于珊，馬旅雁

1中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101

2中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

銅綠假單胞菌鐵攝取與生物被膜形成研究進展

于珊1，馬旅雁2

1中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101

2中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

生物被膜是單細胞微生物通過其分泌的胞外多聚基質(zhì)粘附于介質(zhì)表面并將其自身包繞其中而成的膜樣微生物細胞聚集物。生物被膜的形成使細菌具有更強的適應(yīng)外界環(huán)境的能力，也是導(dǎo)致微生物產(chǎn)生耐藥性及慢性感染性疾病難以治療的重要原因之一。銅綠假單胞菌在肺部的定殖是肺囊性纖維化病患者發(fā)病和死亡主要原因，其造成的感染通常與形成抗生素抗性極強的生物被膜有關(guān)。銅綠假單胞菌生物被膜的形成受控于多種復(fù)雜的細菌調(diào)控體系之下，包括群體感應(yīng)系統(tǒng)及參與調(diào)節(jié)胞外多聚基質(zhì)合成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)等。此外，為了利用低濃度的環(huán)境鐵來維持生存并完成各種生理功能，銅綠假單胞菌進化出了一系列鐵攝取系統(tǒng)，這些系統(tǒng)對其毒力因子的釋放和生物被膜的形成又起著重要的調(diào)控作用。本文主要對銅綠假單胞菌生物被膜的形成與調(diào)控機制及其鐵攝取系統(tǒng)進行了綜述，為進一步了解及清除銅綠假單胞菌引發(fā)的問題提供途徑與思路。

銅綠假單胞菌，生物被膜，鐵攝取，群體感應(yīng)，調(diào)控因子

生物被膜(Biofilm)是指單細胞微生物通過粘附于介質(zhì)表面，分泌胞外多聚基質(zhì)(胞外多糖、蛋白、DNA等)，將其自身包繞其中而成的膜樣微生物細胞聚集物[1]。生物被膜能夠保護微生物在不利環(huán)境中得以存活并在條件有利時散播種子細胞去占領(lǐng)新的地盤。生物被膜可以在多種介質(zhì)表面形成，在自然界、工業(yè)環(huán)境和醫(yī)院等場所都普遍存在。這種固著的聚集狀態(tài)的微生物，其生理指標與游離的菌細胞相比存在很大的差異[2-3]。在臨床環(huán)境中，細菌生物被膜形成后會對抗生素的抗性大大提高并產(chǎn)生多種選擇性的表型突變，因而可引起多種難以清除的慢性感染。對生物被膜在基因和分子水平的形成機制上的深入了解可為防治生物被膜引起的臨床感染和問題提供新的解決策略。

生物被膜的胞外多聚物(EPS)是由多糖、胞外 DNA(eDNA)和蛋白質(zhì)等組成的混合物(圖1A)。EPS可以形成網(wǎng)絡(luò)，并像分子膠水一樣將細菌細胞網(wǎng)羅在一起(圖1B)。這種基質(zhì)網(wǎng)對維持生物被膜的整體結(jié)構(gòu)和抗生素的抗性起到很大作用[4-5]。揭示EPS在生物被膜形成中的作用可為設(shè)計對抗生物被膜的靶向分子提供有益的思路。

條件致病菌銅綠假單胞菌具有極強的生存能力，極易形成生物被膜，是研究生物被膜的模式生物之一。該菌極易感染免疫力較弱的患者，如患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者(如癌癥、大面積燒傷、HIV等)，導(dǎo)致極高的發(fā)病率和致死率。銅綠假單胞菌可在囊性纖維化(Cystic fibrosis，CF)患者的肺部定殖并導(dǎo)致難以根除的慢性感染。已證實這種慢性感染難以根除的原因之一就是因為銅綠假單胞菌可在患者的肺部形成生物被膜。銅綠假單胞菌在不同的營養(yǎng)條件下可形成不同形態(tài)的生物被膜[8]。例如，在以葡萄糖為碳源的限制性培養(yǎng)基中，銅綠假單胞菌PAO1的生物被膜發(fā)育周期可分為5個典型階段(圖2)。

本文介紹了銅綠假單胞菌生物被膜形成調(diào)控機制及其基質(zhì)網(wǎng)的各組分的近期研究進展，并進一步詳細闡述了其鐵攝取的主要系統(tǒng)與策略。深入了解銅綠假單胞菌生物被膜的形成機制和生存策略，可為解決銅綠假單胞菌引起的問題與感染提供途徑與思路。

圖1 銅綠假單胞菌胞外基質(zhì)網(wǎng)的主要組分[6](A)和纖維絲態(tài)的Psl多糖基質(zhì)網(wǎng)(上)及其包被的銅綠假單胞菌生物膜(下)(B)[7]Fig.1 Mainly components of extracellular matrix ofPseudomonas aeruginosa[6](A)and Psl fiber matrix(upper)and encasedP.aeruginosabiofilm(lower)(B)[7].

1 銅綠假單胞菌生物被膜基質(zhì)網(wǎng)

銅綠假單胞菌在肺部的定殖是肺囊性纖維化病(CF)患者發(fā)病和死亡主要原因。銅綠假單胞菌造成的感染通常與形成抗生素抗性極強的生物被膜有關(guān)，菌細胞被包裹在基質(zhì)網(wǎng)中形成微菌落聚集體。即使長期使用大量的抗生素進行治療，感染仍然會持續(xù)存在，非常難以清除[9-10]。EPS基質(zhì)網(wǎng)所起的重要作用與菌株的遺傳背景、營養(yǎng)條件和生物被膜所處的不同發(fā)展階段相關(guān)[11]。普遍接受的觀點認為，EPS可以作為生物被膜的結(jié)構(gòu)骨架并在不利的環(huán)境下為菌細胞提供保護屏障[12-13]。在銅綠假單胞菌中，至少存在3種胞外多糖在維持生物被膜的結(jié)構(gòu)和抗生素抗性方面起著重要作用[5,7,12,14-16]。與生物被膜形成、發(fā)展及功能相關(guān)的基質(zhì)網(wǎng)組成部分主要有胞外多糖(Psl多糖、Pel多糖和褐藻多糖)、胞外DNA、胞外蛋白以及菌體表面的一些蛋白附屬結(jié)構(gòu)，如纖毛、四型菌毛(T4P)及鞭毛。

1.1 Psl多糖

2004年3個不同的研究組分別鑒定出了Psl的多糖合成位點[14-15,17]。Psl多糖是由15個共轉(zhuǎn)錄的基因(pslA-pslO, PA2231–PA2245)組成的基因簇所編碼的一系列蛋白共同合成的。Psl多糖對于菌體的初始吸附、生物被膜結(jié)構(gòu)的維持以及提供細胞與細胞間、細胞與介質(zhì)表面的相互作用至關(guān)重要[7,18-20]。相關(guān)研究進一步表明psl合成基因簇的15個基因中的前11個是合成Psl多糖所必需的[21]，銅綠假單胞菌PA14由于pslA-pslD基因的缺失導(dǎo)致其喪失了合成Psl多糖的能力[22]。早先有研究表明 Psl多糖富含半乳糖、甘露糖及少量的葡萄糖和木糖[18]。最近有研究進一步證實了Psl多糖是由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖形成的四糖重復(fù)單位組成的[21]。此外，在基因及生化水平對單個的psl基因，如pslA、pslB和pslD的功能研究揭示出這些基因?qū)?Psl多糖的合成及生物被膜的形成都是非常關(guān)鍵的[23-25]。

圖2 銅綠假單胞菌生物被膜的典型發(fā)育周期[7].1：可逆性吸附期：浮游微生物附著至載體表面的初期，附著于載體的微生物也可以回到單細胞浮游狀態(tài)(Ⅰ)；2：不可逆吸附期(Ⅱ)；3：生物被膜形成初期(Ⅲ)；4：生物被膜成熟期(Ⅳ)；5：“種子散播期”(Ⅴ).(Ⅰ–Ⅴ)在生物被膜發(fā)育的每個階段，Psl多糖是如何包被生物被膜中的細菌及其在相應(yīng)時期的變化(Psl多糖由紅色熒光標記，菌體由綠色熒光標記)Fig.2 Scheme of biofilm development inP.aeruginosa[7].Selected images showed how the matrix of Psl polysaccharide(red fluorescence)enmeshes bacterial cells(green fluorescence)within bacterial communities during biofilm development.1: initial attachment(Ⅰ);2: irreversible attachment(Ⅱ);3: microcolony formation(Ⅲ);4:biofilm maturation(Ⅳ);5: biofilm dispersion(Ⅴ).

由于 Psl多糖在銅綠假單胞菌生物被膜的形成中起著非常重要的作用，因而對其在生物被膜形成中的具體功能和角色已經(jīng)有了許多非常廣泛深入的研究[20]。首先，Psl多糖的過量生產(chǎn)可以增強菌細胞之間、菌細胞與介質(zhì)表面間的黏附作用，提示 Psl多糖在吸附中的重要功能對起始和維持生物被膜的結(jié)構(gòu)非常關(guān)鍵[19,21]。后來 Ma及其同事用熒光標記的凝集素進一步直接觀察到了 Psl多糖在生物被膜不同發(fā)育階段的形態(tài)和結(jié)構(gòu)(圖2)，而且發(fā)現(xiàn)了Psl多糖是以一種雙螺旋的形態(tài)錨定在菌細胞表面并通過這種錨定方式有效地促進了菌細胞之間的相互作用，并以此完成早期生物被膜及其基質(zhì)網(wǎng)的形成和組裝。在生物被膜形成后期，Psl多糖主要聚集在立體的微菌落結(jié)構(gòu)的外圍。這種定位方式為生物被膜提供了結(jié)構(gòu)支撐并便于之后的種子散播[7]。除此之外，對Psl多糖的染色觀察表明 Psl可以形成一種纖維狀的網(wǎng)絡(luò)將菌細胞網(wǎng)羅在生物被膜中。近來，有研究發(fā)現(xiàn)Psl多糖基質(zhì)網(wǎng)是通過依賴四型菌毛的遷移策略形成的，T4P介導(dǎo)的細菌遷移導(dǎo)致了Psl纖維基質(zhì)網(wǎng)的形成，缺失了菌毛的突變株喪失了形成Psl纖維結(jié)構(gòu)的能力并且導(dǎo)致生物被膜的生物量下降[26]。Zhao及其同事也同時證明銅綠假單胞菌通過在介質(zhì)表面的遷移留下Psl多糖蹤跡，進一步影響后續(xù)菌細胞的表面運動并最終導(dǎo)致生物被膜形成的起始[27]。以上這些最新發(fā)現(xiàn)都擴展了對Psl多糖的生物學(xué)理解。

令人驚訝的是，Psl多糖還具有信號功能，可通過刺激兩個二鳥苷酸環(huán)化酶 SiaD和 SadC來升高胞間第二信使分子c-di-GMP的水平，形成一個獨特的正反饋調(diào)節(jié)回路最終提高 Psl多糖的產(chǎn)量[28]。

此外，Psl多糖在賦予菌體抗原性及保護菌細胞免受宿主免疫系統(tǒng)攻擊等方面也有作用。Psl多糖可通過增強菌細胞與上皮細胞的接觸直接刺激NF-κB的活性并促進鞭毛介導(dǎo)的促炎信號[29]。Mishra等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的Psl多糖可通過限制補體介導(dǎo)的調(diào)理作用減弱中性白細胞的吞噬以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[30]。此類研究清晰地表明 Psl多糖對宿主內(nèi)環(huán)境中的菌體生存具有重要意義，并提供了將Psl多糖作為靶點清除生物被膜從而治療相關(guān)慢性感染的直接依據(jù)。

有研究證實 Psl多糖在細菌抗生素耐藥性的產(chǎn)生中也發(fā)揮作用。最近有研究揭示Psl多糖可以促進細菌對生物被膜抑制劑聚山梨醇酯80(Polysorbate80)的抗性[31]。Yang等報道生物被膜中依賴 Psl多糖形成的微菌落結(jié)構(gòu)使銅綠假單胞菌對抗生素的處理變得不敏感[20]。通過用熒光標記的抗生素觀察到胞外基質(zhì)網(wǎng)可通過限制妥布霉素的滲透保護生物被膜中的菌細胞免遭抗生素的殺傷，且這種對抗生素的隔離作用主要發(fā)生在生物被膜的外周區(qū)域[32]。然而，沒有明確證據(jù)能直接證實生物被膜基質(zhì)網(wǎng)對這種保護和相互作用的關(guān)鍵功能。此外，另一個研究組報道在生物被膜的形成起始階段 Psl多糖作為第一道防線來抵御陽離子或陰離子類抗生素的攻擊，且這種由Psl多糖介導(dǎo)的保護作用可以擴展到混合培養(yǎng)生物被膜中的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[33]。

總之，Psl多糖不僅可作為生物被膜發(fā)育過程中的結(jié)構(gòu)骨架，還可以作為一種信號分子存在最終導(dǎo)致生物被膜的形成。這種正反饋回路代表了一種銅綠假單胞菌在不同環(huán)境中生存定殖的進化策略。此外，Psl多糖還可作為屏障來抵御宿主免疫和抗生素的殺傷。

1.2 Pel多糖

Pel多糖是由pelA-pelF(PA3058-PA3064)組成的pel合成基因簇編碼的蛋白合成。Pel多糖是一種富含葡萄糖且對纖維素處理敏感的胞外多聚物[34]。pel合成基因簇在革蘭氏陰性菌中比較保守[35]。這部分基因的缺失會導(dǎo)致細菌在靜置培養(yǎng)條件下無法形成氣液交界面的菌膜，此外，Pel多糖在介質(zhì)表面形成牢固的生物被膜過程中也發(fā)揮作用[14]。有趣的是，缺失菌毛的銅綠假單胞菌PAK的pel突變株，其在固體介質(zhì)表面的初始吸附能力大大減弱了，提示 Pel多糖可能在其他一些黏附因子如四型菌毛缺失時可以提供代償作用[7]。然而，Pel多糖在其他銅綠假單胞菌菌株的吸附過程中的明確作用仍需進一步深入的研究。此外，Pel多糖通過維持細胞間的相互粘連在菌株 PA14形成的生物被膜中為菌細胞提供主要的骨架支撐，并通過增強生物被膜對氨基糖甙類抗生素的抗性為細菌提供保護[16]。進一步對Pel功能的研究揭示Pel多糖可以和其他類型的EPS共同作用來促進銅綠假單胞菌的生物被膜發(fā)育[20]。

1.3 褐藻多糖

褐藻多糖(Alginate)是 CF患者肺部臨床分離株產(chǎn)生的主要胞外多糖[36]。典型黏液型表型的產(chǎn)生原因是由于菌株生產(chǎn)了大量的褐藻多糖，這種多糖形成的生物被膜胞外基質(zhì)網(wǎng)可以保護銅綠假單胞菌免受肺部不利環(huán)境的影響。然而，這種多糖對于體外非黏性生物被膜的形成并不是必需的[37]。褐藻多糖在保護和維持生物被膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等方面起著重要作用——有保水及儲存營養(yǎng)物質(zhì)的功能[4]。有趣的是，近來的研究發(fā)現(xiàn)，黏性菌株生物被膜的形成也依賴Psl多糖的產(chǎn)生[38-39]。褐藻多糖還有維持細胞存活和免疫逃避的功能[40]。褐藻多糖的大量生產(chǎn)可以增強菌細胞對抗生素和調(diào)離吞噬作用的抵抗能力[41-42]。這種多糖在體內(nèi)可以清除由中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的自由基[43]。Bragonizi等也曾報道褐藻多糖的大量合成并沒有增強銅綠假單胞菌在小鼠感染模型中長久生存能力，這也許是由于感染過程中菌株從黏液型到非黏液型的表型轉(zhuǎn)變有關(guān)[44]。

1.4 胞外DNA

胞外DNA(eDNA)是銅綠假單胞菌生物被膜基質(zhì)網(wǎng)中的另一重要組分[17,45-46]。eDNA可能源于基因組DNA，在生物被膜中提供細胞間的相互聯(lián)結(jié)。對生物被膜中的eDNA進行染色發(fā)現(xiàn)其主要大量存在于蘑菇狀微菌落的柄部[45]。此外，在生物被膜微菌落中也存在著菌細胞的自溶現(xiàn)象，但目前尚不明確 eDNA是否來源于菌細胞自溶釋放出的基因組DNA[47]。關(guān)于eDNA的來源目前主要的幾個假設(shè)有：來源于由前噬菌體裂解的亞群體、由菌細胞直接分泌及由小的外膜囊泡產(chǎn)生等[48]。

與生物被膜基質(zhì)網(wǎng)中的其他組分相同，eDNA對生物被膜的形成也具有多重作用，有研究證實外源添加 DNaseⅠ可以降解較為“年輕”的生物被膜，此外 eDNA也與抗生素抗性的產(chǎn)生有關(guān)[49]。有趣的是，eDNA還可在饑餓狀態(tài)時作為菌細胞的營養(yǎng)來源[50]，近來有研究表明，銅綠假單胞菌產(chǎn)生一種胞外脫氧核糖核酸酶(PA3909)可利用eDNA作為營養(yǎng)來吸收利用，這進一步擴展了我們對于 eDNA在銅綠假單胞菌生物被膜形成過程中作用的理解[51]。此外，eDNA還可以與壞死的中性粒細胞釋放出的F-肌動蛋白形成束狀物，這些束狀物可以促進銅綠假單胞菌生物被膜的形成起始[52]。eDNA作為銅綠假單胞菌生物被膜中的主要促炎因子，通過CpG和TLR9-依賴的機制激活中性粒細胞[53]。進一步的研究發(fā)現(xiàn) eDNA可以通過維持細胞間的粘連和排列來調(diào)節(jié)生物被膜邊緣部位先鋒細胞群的運動，進而促進由顫動作用介導(dǎo)的生物被膜擴張[54]。

1.5 胞外蛋白及菌體表面蛋白附屬結(jié)構(gòu)

除胞外多糖和胞外DNA外，胞外蛋白與四型菌毛、鞭毛和纖毛等蛋白多聚體細胞附屬物也是組成生物被膜基質(zhì)網(wǎng)的成分。這些細胞附屬物主要作為黏附因子和結(jié)構(gòu)支撐為銅綠假單胞菌生物被膜的形成提供輔助作用[55]。

鞭毛可以介導(dǎo)銅綠假單胞菌的游動(Swimming)和叢集運動(Swarming)，還可以作為黏附因子為細胞和介質(zhì)表面的初始接觸提供關(guān)鍵助力[56]。四型菌毛(T4P)是一種線狀的運動器官，采用一種“伸展-握緊-撤回”的機制形成銅綠假單胞菌的顫動(Twitching)能力[57]。四型菌毛在銅綠假單胞菌微菌落的典型“蘑菇冠”結(jié)構(gòu)的形成中起著重要作用[56]。如上所述，T4P介導(dǎo)的菌體運動可以幫助Psl多糖纖維絲狀網(wǎng)的形成[26]，而另有研究認為銅綠假單胞菌的鞭毛和菌毛并不是初始吸附或形成生物被膜所必需的[58]，即鞭毛或菌毛介導(dǎo)的生物被膜形成可能是依條件和營養(yǎng)而異的。近來，有研究證實一個新鑒定的粘附素CdrA是銅綠假單胞菌EPS基質(zhì)網(wǎng)中的關(guān)鍵組分蛋白，通過直接與Psl多糖作用介導(dǎo)菌體的自聚集并增強生物被膜的穩(wěn)定性[59]。

銅綠假單胞菌的纖毛類附屬物由“分子伴侶-引導(dǎo)蛋白(Chaperon-Usher)”機制組裝而成，其對生物被膜的形成亦具有促進作用[60]。在銅綠假單胞菌PAO1中，鑒定出至少4個纖毛系統(tǒng)(CupA、B、C和 D)并分別具有不同的組織形式和功能[61]。有研究表明Cup纖毛有利于生物被膜的形成起始，特別是在介導(dǎo)細胞間互作和微菌落的形成過程中起著關(guān)鍵作用[18,62]。

2 銅綠假單胞菌生物被膜形成的調(diào)控

生物被膜的形成受控于多種復(fù)雜的細菌調(diào)控體系之下，包括群體感應(yīng)系統(tǒng)(Qurum sensing，QS)及參與調(diào)節(jié)胞外多糖合成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)等[63]。這些調(diào)控系統(tǒng)的缺失會導(dǎo)致生物被膜的結(jié)構(gòu)、形態(tài)及保護能力的變化?，F(xiàn)對銅綠假單胞菌與生物被膜形成相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控系統(tǒng)進行簡要概述。

2.1 群體感應(yīng)系統(tǒng)與生物被膜形成

群體感應(yīng)是細菌群體的一種細胞間的交流方式，通過生產(chǎn)及接受能擴散的信號分子感應(yīng)菌細胞的群體密度，并通過這種機制調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生、運動力的變化及生物被膜的形成[64-65]。銅綠假單胞菌具有兩種主要的QS系統(tǒng)(las和rhl)，分別通過合成酶LasI、RhlI合成兩種自誘導(dǎo)信號分子：N-3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C12-HSL)和 N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)[65]。信號分子與相應(yīng)的受體蛋白(轉(zhuǎn)錄因子 LasR和 RhlR)結(jié)合后激活一系列基因(包括lasI和rhlI在內(nèi))的轉(zhuǎn)錄。此外，銅綠假單胞菌還有第3個QS系統(tǒng)——PQS系統(tǒng)，依賴喹諾酮信號分子，與酰基高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)信號分子之間存在著復(fù)雜的交互調(diào)控關(guān)系[65](圖3)。

Davies等已證明了las系統(tǒng)在銅綠假單胞菌生物被膜形成和成熟過程中的作用[2]。與野生型相比，las系統(tǒng)缺失株形成更扁平、均一化的生物被膜，且受到十二烷基硫酸鈉的處理后更易從介質(zhì)表面剝離，但las系統(tǒng)在生物被膜形成中的具體功能尚不明確。而后 Gilbert等報道QS轉(zhuǎn)錄因子LasR可以結(jié)合在psl操縱子的啟動子區(qū)——表明QS系統(tǒng)可以調(diào)控psl基因簇的表達[67]。rhl系統(tǒng)亦被證實可以通過促進Pel多糖的合成參與銅綠假單胞菌生物被膜形成：在rhl系統(tǒng)缺失株中pel操縱子的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低[68]。而PQS系統(tǒng)與生物被膜發(fā)育過程中eDNA的釋放有關(guān)，pqsA突變株形成的生物被膜中的eDNA含量比野生型生物被膜中的更少[45,69]。綜上所述，以上3種QS系統(tǒng)均在銅綠假單胞菌生物被膜的發(fā)育過程中起著較為重要的調(diào)控作用。

圖3 銅綠假單胞菌的層級群體感應(yīng)系統(tǒng)[66]Fig.3 The hierarchy quorum sensing network inP.aeruginosa[66].

不能忽略的是，QS系統(tǒng)還可通過調(diào)控銅綠假單胞菌的叢集運動、顫動及鼠李糖脂、凝集素的產(chǎn)量來間接影響生物被膜的形成過程。銅綠假單胞菌的叢集運動能力是由鞭毛、菌毛和胞間接觸共同介導(dǎo)的一種復(fù)雜的表面運動能力[70-71]。rhl系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)叢集運動參與早期銅綠假單胞菌生物被膜的形成[72]。銅綠假單胞菌在促進叢集運動的培養(yǎng)基(如以谷氨酸或琥珀酸為碳源的生長培養(yǎng)基)中形成扁平均一的生物被膜，而在喪失叢集運動的情況下形成融合樣細胞聚集狀態(tài)的生物被膜[8]。顫動能力是一種由極生四型菌毛介導(dǎo)的一種細菌運動[73]，已知其在鐵缺乏的限制性培養(yǎng)基中受到rhl系統(tǒng)的調(diào)控[74]。顫動能力是銅綠假單胞菌在生物被膜形成過程中將單層細胞組裝成微菌落的立體結(jié)構(gòu)所必需的[56]。

鼠李糖脂，除了作為一種表面活性劑和銅綠假單胞菌的毒力因子[75]，可受到rhl系統(tǒng)的調(diào)控并在生物被膜的形成中起多種作用[76]：1)參與生物被膜微菌落的形成[77]；2)通過干擾細胞-細胞、細胞-介質(zhì)表面間的相互作用阻礙菌細胞定殖并維持生物被膜中通道結(jié)構(gòu)的開放[78]；3)通過促進3D蘑菇狀結(jié)構(gòu)的形成幫助銅綠假單胞菌生物被膜發(fā)育[77]；4)高產(chǎn)鼠李糖脂的突變株更易從生物被膜中脫離，因此鼠李糖脂的過量表達可以促進銅綠假單胞菌生物被膜的瓦解[79]。最后，銅綠假單胞菌的細胞毒力因子——凝集素LecA和 LecB，也參與生物被膜的形成，LecA和LecB的突變株只能形成比野生型更薄的生物被膜[80-81]，而LecA和LecB的表達也是受到rhl系統(tǒng)調(diào)控的[82]。

2.2 GacS/GacA和RetS/LadS雙組分系統(tǒng)對生物被膜的調(diào)控

在銅綠假單胞菌基因組中的60個雙組分調(diào)控系統(tǒng)中[83]，GacS/GacA系統(tǒng)參與調(diào)控 QS系統(tǒng)并調(diào)節(jié)多種毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成[84]。Gac系統(tǒng)由一個跨膜感應(yīng)激酶GacS和一個配對反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白GacA組成，GacS可通過自磷酸化轉(zhuǎn)移一個磷酸基給 GacA，磷酸化的GacA可上調(diào)兩個小RNA——RsmZ和RsmY的表達，RsmZ和RsmY可結(jié)合在一種小RNA結(jié)合蛋白RsmA上，而RsmA在轉(zhuǎn)錄后水平抑制psl合成簇(pslA-L)的轉(zhuǎn)錄[85-86](圖4)。GacS/GacA系統(tǒng)還對AHL系統(tǒng)有調(diào)控作用：可通過使游離的RsmA失活解除其對 C4-HSL和3-oxo-C12-HSL合成的抑制作用，從而通過las和rhl系統(tǒng)調(diào)控胞外毒力因子的產(chǎn)生[87-88]。

圖4 銅綠假單胞菌GAC雙組分系統(tǒng)[89]Fig.4 The GAC system network inP.aeruginosa[89].

有報道稱混合傳感組氨酸激酶RetS可抑制生物被膜的形成[90-91]，而另一個組氨酸激酶LadS對 RetS有拮抗作用[92]。與野生型菌株P(guān)AO1相比，retS突變株可形成結(jié)構(gòu)化程度更高的生物被膜[90]；而天然缺乏ladS基因的菌株P(guān)A14與ladS過表達株相比，所形成的生物被膜更薄[93]。有研究表明，RetS和LadS與GacS/GacA系統(tǒng)之間存在著交互作用：即可通過調(diào)節(jié) GacS的磷酸化狀態(tài)來抑制或促進GacA的磷酸化[93-94]。有趣的是，GacS/GacA和RetS/LadS系統(tǒng)還參與調(diào)控銅綠假單胞菌從急性感染到慢性感染的表型轉(zhuǎn)變過程[90]。

2.3 環(huán)二鳥苷酸(C-di-GMP)依賴的多糖合成與生物被膜的形成

銅綠假單胞菌胞外多糖的合成依賴于胞內(nèi)環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)的濃度[95-96]，c-di-GMP是細菌中廣泛存在的一種胞內(nèi)第二信使[97]。在菌細胞內(nèi)，兩分子的鳥苷三磷酸(GTP)在二鳥苷酸環(huán)化酶的催化下合成一分子的c-di-GMP，后者又可在底物專一性的磷酸二酯酶的催化下降解為兩分子的鳥苷酸(GMP)[97](圖5)。

高濃度的c-di-GMP可通過與合成褐藻多糖和Pel多糖所必需的Alg44和PelD蛋白結(jié)合分別促進這兩種多糖的合成[96-98]。然而，這種c-di-GMP調(diào)控糖前體多聚化的具體機制尚不明確。反過來，低濃度的c-di-GMP可通過加強鞭毛運動促進菌細胞的游動和解聚[96]。

圖5 銅綠假單胞菌c-di-GMP的信號作用[97]Fig.5 Physiological functions ofc-di-GMP[97].

3 銅綠假單胞菌的鐵攝取系統(tǒng)

鐵離子是地球上絕大多數(shù)生物生存必不可少的元素之一，生物體內(nèi)的很多酶催化反應(yīng)都需要鐵離子的參與。然而，由于氧的存在，環(huán)境中的大部分鐵離子都以三價鐵的形式存在，很難溶解于水溶液中。因此，環(huán)境中的鐵看起來很多，實際上大部分都是鐵的化合物，自由鐵的濃度很低，滿足不了微生物的生長需求。此外，由于宿主鐵大多被亞鐵血紅素分子及轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白之類的循環(huán)蛋白所結(jié)合，因而病原微生物在宿主體內(nèi)也面臨著嚴峻的鐵攝取問題[99-100]，細菌為了利用鐵來維持自身生長并完成各種生理功能，進化出了一系列能夠螯合、攝取鐵的系統(tǒng)，而這些系統(tǒng)對細菌毒力因子的釋放和生物被膜的形成均起著重要的調(diào)控作用。

銅綠假單胞菌可以通過如下不同策略來獲取鐵元素：1)生產(chǎn) Fe3+螯合分子，即鐵載體：熒光嗜鐵素(Pyoverdine)和鰲鐵蛋白(Pyochelin)，并通過 TonB依賴的受體(TonB-dependent receptors，TBDR)攝入三價鐵-載體復(fù)合物。2)攝入外源鐵載體復(fù)合物(非銅綠假單胞菌本身產(chǎn)生的鐵載體)。3)從宿主產(chǎn)生的血紅素蛋白攝入血紅素分子。4)利用吩嗪(Phenazine)和Fe2+專一性攝取系統(tǒng)(Feo系統(tǒng))在胞外將 Fe3+還原為 Fe2+并加以吸收利用。5)在宿主體內(nèi)，依據(jù)造成感染的不同類型(急性感染或慢性感染)，銅綠假單胞菌能夠采取不同的鐵攝取策略在不造成過多能量消耗的前提下滿足自身的鐵需求。

3.1 銅綠假單胞菌所產(chǎn)鐵載體及其介導(dǎo)的鐵攝取系統(tǒng)

鐵載體是一類能夠以高親和力專一性螯合Fe3+的低分子量的分泌型分子，能夠依賴由TonB周質(zhì)膜蛋白所提供的能量被特異性受體識別[101-105]。鐵載體依據(jù)其與鐵所形成的復(fù)合物的形式，可分為不同的種類，如酚鹽鐵載體、苯酚鐵載體、異羥肟酸鐵載體、羧化鐵載體及混合鐵載體。

3.2 熒光嗜鐵素：引發(fā)急性感染所必需的高親和力鐵載體

銅綠假單胞菌熒光嗜鐵素是由一個肽鏈和一個發(fā)色團組成的混合型鐵載體[106-108]。熒光嗜鐵素是能發(fā)熒光的一些假單胞菌(如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌和銅綠假單胞菌)的標志性特點，其在環(huán)境鐵濃度過低時被產(chǎn)生出來[106-108]。熒光嗜鐵素與鐵的親和力極高，可將鐵從轉(zhuǎn)鐵蛋白中螯合出來，且熒光嗜鐵素的產(chǎn)生是引起小鼠燒傷模型和肺病模型的感染所必需的[106,109-113]。同樣地，TonB蛋白的突變株喪失了在小鼠模型中的致病力[111]。在Imperi等的研究中，篩選到了一些通過FDA認證的抑制銅綠假單胞菌熒光嗜鐵素合成的化合物，其中一個化合物——抗真菌藥物氟胞嘧啶對多株銅綠假單胞菌產(chǎn)生的不同類型的熒光嗜鐵素均有明顯的抑制作用，且這種抑制作用是通過作用于σ因子PvdS來實現(xiàn)的，而PvdS是熒光嗜鐵素合成基因簇轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)節(jié)因子[113]。熒光嗜鐵素不僅是一種鐵載體，還是一種信號分子，可誘導(dǎo)兩種胞外毒力因子蛋白酶 PrpL和外毒素 A的產(chǎn)生[108,114-117](圖6)。此外，盡管熒光嗜鐵素是銅綠假單胞菌引起急性感染所必需的因素，其也在較厚的成熟生物被膜形成過程中發(fā)揮作用[74,118-119]。

圖6 熒光嗜鐵素是一種信號分子[120]Fig.6 Ferripyoverdine is also a signal molecule[120].

3.3 鰲鐵蛋白：一種低親和力鐵載體

鰲鐵蛋白是所有銅綠單胞菌均產(chǎn)生的一種鐵載體，但其對鐵的親和力較熒光嗜鐵素低[121-123]。鰲鐵蛋白合成所需的基因數(shù)比熒光嗜鐵素所需基因數(shù)更少[124]，且有研究表明銅綠假單胞菌優(yōu)先合成鰲鐵蛋白，在環(huán)境鐵濃度非常低的情況下再切換為熒光嗜鐵素的合成[125]。鰲鐵蛋白-鐵復(fù)合物可以進行氧化還原循環(huán)并引起宿主的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，尤其是在銅綠假單胞菌的另一種胞外產(chǎn)物綠膿菌素也存在的情況下[126-128]。在慢性感染過程中，如在CF患者肺部，鰲鐵蛋白的產(chǎn)生可引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致組織損傷[129]。在 CF痰培養(yǎng)基中，銅綠假單胞菌的鰲鐵蛋白合成量增加[130]。

3.4 亞鐵血紅素攝取系統(tǒng)

圖7 銅綠假單胞菌的兩個血紅素攝取系統(tǒng)：Phu和Has[120]Fig.7 P.aeruginosahas two heme uptake systems, Phu and Has[120].

銅綠假單胞菌可以通過Has和Phu兩套系統(tǒng)從血紅蛋白中攝取亞鐵血紅素[131](圖7)。亞鐵血紅素?zé)o法以自由游離形式存在，因為強疏水性使其與膜相結(jié)合并在膜上進行非酶促氧化還原反應(yīng)[132]，因此亞鐵血紅素必須從血紅蛋白或血液結(jié)合素上提取得到。在銅綠假單胞菌的Phu系統(tǒng)中，亞鐵血紅素是從一種外膜TBDR中提取到的，而在 Has系統(tǒng)中，亞鐵血紅素先由血紅蛋白攝取，然后這種“血紅素載體-血紅素”復(fù)合物再被另一種TBDR——HasR識別[133-135]。在細胞周質(zhì)中，血紅素與周質(zhì)結(jié)合蛋白結(jié)合后通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運輸?shù)桨麅?nèi)。而在ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中，血紅素先與血紅素分子伴侶PhuS結(jié)合，然后被運輸給血紅素氧化酶 HemO，進一步將血紅素降解為膽綠素、CO和Fe2+[136-138]。對Has或Phu系統(tǒng)的一個單突變不會影響血紅素攝取，而對兩個系統(tǒng)的雙突變則會導(dǎo)致銅綠假單胞菌完全喪失將血紅素作為鐵源的攝取能力[131]。

3.5 外源鐵載體的攝取

銅綠假單胞菌至少具有30個以上的基因用來編碼 TBDRs，而其中大多數(shù)都參與鐵與載體復(fù)合物的攝入[139-141]。不同的TBDRs可以分為兩類：簡單的TBDR和TonB依賴的轉(zhuǎn)換子，即TBDT[142]。以TBDT系統(tǒng)中的“鐵-熒光嗜鐵素”復(fù)合物受體FpvA為例，F(xiàn)pvA可以通過與一個作為抗 σ因子的膜蛋白相互作用來感受“鐵-熒光嗜鐵素”復(fù)合物的存在[142]。這種受體識別一旦發(fā)生就會使抗 σ因子蛋白水解，從而釋放出外ECFσ(Extracytoplasmic function sigma factor)，ECFσ可與RNA聚合酶作用，從而引發(fā)下游基因轉(zhuǎn)錄自誘導(dǎo)反應(yīng)[117,140,142-143]。大多數(shù)的銅綠假單胞菌(98%)都具有另一種“一型鐵-熒光嗜鐵素受體”——FpvB，這意味著幾乎所有菌株都能利用這種熒光嗜鐵素作為鐵源[139,144]。銅綠假單胞菌還可以通過各種不同的受體來攝取各種各樣由其他細菌產(chǎn)生的“鐵-載體復(fù)合物”，這種能夠“偷取”其他細菌鐵源的能力，可能賦予其在混合感染中較強的競爭優(yōu)勢[145]。

3.6 通過Feo系統(tǒng)與吩嗪攝入Fe2+

圖8 銅綠假單胞菌兩種主要的吩嗪——PCA和綠膿菌素的結(jié)構(gòu)(A)和還原態(tài)PCA分泌出胞外后將Fe3+還原為Fe2+[120](B)Fig.8 Structure of the two majorP.aeruginosaphenazines, PCA and pyocyanin(A).Reduced PCA is excreted out of the cell and is oxidizedresulting in the reduction of Fe3+to Fe2+[120](B).

與Fe3+不同，F(xiàn)e2+具有水溶性，并存在于低pH值的厭氧或微厭氧環(huán)境中[146]。Fe2+可以擴散至外膜并通過在革蘭氏陰性菌中廣泛存在的FeoABC系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)[147](圖8)。Fe2+通過由透性酶FeoB和FeoA、FeoC蛋白組成的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)繼續(xù)被運輸至細胞內(nèi)部[147]。Fe2+的攝入可能與銅綠假單胞菌對微厭氧或厭氧環(huán)境的感受有關(guān)，如CF患者的肺部的生物被膜黏液環(huán)境[148-149]。

吩嗪類物質(zhì)是一種由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[150]，1-羧基-吩嗪酸(PCA)是綠膿菌素的前體，綠膿菌素是銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的一種藍綠色特征性化合物，這兩種吩嗪物質(zhì)都具有氧化還原能力[150]。PCA及一些少量的綠膿菌素可將宿主蛋白結(jié)合的Fe3+還原為Fe2+，在生物被膜中Fe2+可經(jīng)由Feo系統(tǒng)攝入[151]。近來有研究報道當(dāng)病情惡化時，可在CF患者肺部檢測到吩嗪和 Fe2+的大量積累[152-153]，而 Fe2+和 Fe3+兩種離子的螯合劑聯(lián)用可以大大削弱銅綠假單胞菌的生物被膜形成能力[153]。

圖9 銅綠假單胞菌的TonB依賴的鐵攝取調(diào)控[158]Fig.9 Regulation of iron uptake via TonB-dependent receptors inP.aeruginosa[158].

3.7 銅綠假單胞菌鐵平衡的調(diào)節(jié)機制

與大多數(shù)細菌一樣，F(xiàn)ur是假單胞菌的一個主要的鐵調(diào)節(jié)蛋白，且在銅綠假單胞菌中，fur是生存必需基因[154]。大部分基因參與“鐵-載體復(fù)合物”攝取的基因受到Fur的間接調(diào)控(圖9)。Fur調(diào)控一些ECFσ因子的表達，這些σ因子包括熒光嗜鐵素生物合成基因pvdS、熒光嗜鐵素復(fù)合物基因fpvA和其他一些編碼TonB依賴型外源鐵復(fù)合物受體的基因，它們是實現(xiàn)一些下游基因轉(zhuǎn)錄所必需的。鐵濃度可作為信號通過ECFσ因子引發(fā)這些基因的表達。受體與“鐵-載體復(fù)合物”的結(jié)合改變了受體蛋白 N端與膜抗 σ因子的相互作用，釋放出 ECFσ因子，使后者能夠與核RNA聚合酶結(jié)合。銅綠假單胞菌還具有另一種鐵調(diào)節(jié)機制，即通過AraC調(diào)節(jié)子來控制鰲鐵蛋白的合成與鐵攝取[155]。最后，兩個小RNA——PrrF1和PrrF2可以作為mRNA反義轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子參與Fur的調(diào)節(jié)，主要通過參與上調(diào)氧化還原應(yīng)激、鐵儲存和中間代謝等Fe-Fur基因的表達[156-157]。

綜上所述，銅綠假單胞菌可以從合成較低鐵親和力的鰲鐵蛋白轉(zhuǎn)為合成較高鐵親和力但更耗能量的熒光嗜鐵素來攝取足夠量的Fe3+[125]。一個典型的例子即發(fā)生在銅綠假單胞菌對 CF患者肺部環(huán)境的適應(yīng)過程中[129]。當(dāng)銅綠假單胞菌開始侵染肺部時，可能產(chǎn)生熒光嗜鐵素，但隨其在肺部的進一步定殖，細菌開始由于某些原因合成鰲鐵蛋白并引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致組織損傷和包括血紅蛋白和其他含鐵蛋白等細胞內(nèi)容物的釋放[128]。盡管包括熒光嗜鐵素在內(nèi)的鐵載體在 CF患者的痰液樣本中被檢測到[159]，但不能產(chǎn)生熒光嗜鐵素的突變株具有更久的定殖能力[160-161]，這意味著銅綠假單胞菌可以利用其他代償性機制來滿足自身的鐵需求，例如可以從炎癥反應(yīng)中釋放出的血紅蛋白中攝取血紅素，或者攝取經(jīng)由吩嗪類物質(zhì)，特別是PCA介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的Fe2+[151,153,161-162]。

4 鐵與生物被膜形成

有研究發(fā)現(xiàn)外源添加鐵螯合劑乳鐵蛋白可對銅綠假單胞菌生物被膜的形成產(chǎn)生明顯的抑制作用[163]，而適宜的高鐵濃度環(huán)境則促進其生物被膜的形成[164-165]。這表明環(huán)境鐵可作為一種信號調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌生物被膜的發(fā)育。與上述研究結(jié)論相一致，研究者還發(fā)現(xiàn)喪失了螯合環(huán)境鐵能力的銅綠假單胞菌突變株不能形成正常的生物被膜[74,118]。這種鐵對銅綠假單胞菌生物被膜的調(diào)節(jié)效應(yīng)可能是受到鐵受體調(diào)節(jié)子 Fur的調(diào)控而產(chǎn)生[141,166]。近年來有研究報道高鐵濃度可以抑制銅綠假單胞菌黏性菌株的主要胞外多糖——褐藻多糖的產(chǎn)生，使其生物被膜的形成能力降低[167]。最新研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌的胞外多糖Psl可直接結(jié)合環(huán)境中的自由鐵，而高鐵濃度信號通過抑制轉(zhuǎn)錄因子 AmrZ降低鼠李糖脂的合成量，從而通過解除其對Psl多糖的糖前體競爭抑制而產(chǎn)生更多的Psl多糖，形成更大生物量的生物被膜(圖10)，這是一種銅綠假單胞菌攝取鐵的新策略[168]。

圖10 銅綠假單胞菌Psl多糖與鐵的相互作用模式圖[168]Fig.10 A schematic shows the mechanisms of the iron-Psl interplay inP.aeruginosa[168].

5 結(jié)語

本文概述了銅綠假單胞菌生物被膜發(fā)展發(fā)育的主要過程及其系統(tǒng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并特別介紹了鐵攝取系統(tǒng)的工作原理及鐵信號與其生物被膜形成之間的關(guān)系。進一步增強了人們對于微生物生物被膜發(fā)育過程以及環(huán)境適應(yīng)性的認識，同時為生物被膜的防控提供了潛在的候選藥物靶標。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Iron uptake and biofilm formation inPseudomonas aeruginosa

Shan Yu1, and Luyan Ma2
1Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China
2Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Biofilms are surface-associated communities of microorganisms embedded within self-secreted extracellular polymeric substances, and a major cause of chronic and persistent infections.RespiratoryPseudomona aeruginosainfection is the leading reason for morbidity and mortality in cystic fibrosis patients.The formation of biofilms byP.aeruginosain the airway is thought to increase persistence and antibiotic resistance during infection.Biofilm formation ofP.aeruginosais regulated by complicated signaling systems including quorum sensing and two-component systems that control the synthesis of extracellular polymeric substances.Furthermore, iron is an essential and scarce nutrient for bacteria and an important signal factor.P.aeruginosahas developed multiple iron uptake systems to sequester enough iron for its survival,with important regulatory roles in both release of virulence factors and formation of biofilms.In this review, we summarize recent advances in biofilm formation and its regulation along with the iron-uptake strategies inP.aeruginosa, to provide new insights and understanding to fight bacterial biofilms.

Pseudomonas aeruginosa, biofilm, iron uptake, qurom sensing, regulation factor

April5,2017;Accepted:May8,2017

Luyan Ma.Tel: +86-10-64807437; Fax: +86-10-64806101; E-mail: luyanma27@im.ac.cn

于珊, 馬旅雁.銅綠假單胞菌鐵攝取與生物被膜形成研究進展.生物工程學(xué)報,2017,33(9):1489–1512.

Yu S, Ma LY.Iron uptake and biofilm formation inPseudomonas aeruginosa.Chin J Biotech,2017,33(9):1489–1512.

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2014CB846002), National Natural Science Foundation of China(No.31570126).

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2014CB846002)，國家自然科學(xué)基金(No.31570126)資助。

馬旅雁 中國科學(xué)院微生物研究所研究員，博士生導(dǎo)師。1996年于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲理學(xué)博士學(xué)位；中國科學(xué)院“百人計劃”入選者；中國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)會微生物生物技術(shù)分會理事；Microbiology Open副主編，F(xiàn)rontiers in Microbiology編委。馬旅雁研究員致力于細菌生物被膜(Biofilm，亦稱生物膜)的研究，旨在了解細菌的群體行為以及微生物間的信息交流，解析細菌生物被膜形成與瓦解的分子機理，為環(huán)境治理中有效發(fā)揮生物被膜的功能奠定理論基礎(chǔ)，為防治和控制生物被膜相關(guān)問題提供理論依據(jù)及可能的解決辦法。