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        酸角殼提取物對蔗糖負荷大鼠血糖及α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的影響

        2017-11-03 12:20:10李維熙劉冬麗蘇薇薇高永堅
        環(huán)球中醫(yī)藥 2017年11期
        關(guān)鍵詞:糖苷酶淀粉酶小腸

        李維熙 劉冬麗 蘇薇薇 高永堅

        ·論著·

        酸角殼提取物對蔗糖負荷大鼠血糖及α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的影響

        李維熙 劉冬麗 蘇薇薇 高永堅

        目的研究酸角殼提取物對蔗糖負荷大鼠糖吸收的抑制作用。方法采用蔗糖負荷大鼠模型觀察酸角殼提取物對蔗糖負荷后不同時間點血糖的影響;采用酶標法測定酸角殼提取物對正常大鼠腸黏膜和內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影響,評價酸角殼提取物對腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影響。結(jié)果各劑量酸角殼提取物能顯著降低蔗糖負荷后15分鐘大鼠的血糖水平(P<0.01)。酸角殼提取物能明顯抑制小腸上段和中段α-葡萄糖苷酶以及小腸中段α-淀粉酶的活性,在給藥30分鐘到1小時的抑制作用最為顯著。結(jié)論酸角殼提取物能夠顯著降低蔗糖負荷后大鼠的血糖水平,其作用可能與抑制腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性有關(guān)。

        酸角殼提取物; 糖負荷; α-葡萄糖苷酶; α-淀粉酶

        酸角TamarindusindicaLinn.,又名酸豆、羅望子、羅晃子、酸梅、木罕(傣語),為蘇木科酸角屬植物[1]。中國云南、四川、海南、廣東、廣西、福建、臺灣等省(區(qū))南部、金沙江干熱河谷中部及北部等區(qū)域均廣為種植[1]。酸角在《本草綱目拾遺》《滇南本草》等傳統(tǒng)藥物典籍中均有收載,有止渴退熱、解利風邪的功效。現(xiàn)代研究表明,酸角葉、果肉及種子提取物具有較好的抗菌、抗炎、解毒、止痛等藥用作用[2]。酸角殼是酸角果肉加工后的副產(chǎn)物,富含黃酮類成分,但由于對其生物活性研究較少,因此尚未得到相應(yīng)的開發(fā)利用。

        流行病學研究表明多數(shù)患者在糖尿病發(fā)病前多年就已出現(xiàn)糖耐量受損,并證明在早期對這類人群進行有效干預,不僅可以延緩發(fā)病時間,也能夠降低發(fā)病率[3-4]。一般認為,餐后血糖升高是糖耐量受損的臨床指標,也是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的重要因素之一。抑制腸道糖苷酶和淀粉酶活性能延緩對淀粉及蔗糖等多糖及雙糖成分的水解,減少機體的糖吸收,降低餐后血糖。因此,尋找新的天然來源的防治糖尿病藥物有著重要的社會和經(jīng)濟意義。本文通過蔗糖負荷實驗探討酸角殼提取物對實驗動物血糖水平的影響,同時評價酸角殼提取物對腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用,旨在為酸角殼的應(yīng)用開發(fā)提供有益的科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1動物

        雄性SD大鼠, 體重200~240 g, SPF級, 8周齡,共108只,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心,動物許可證號SCXK(粵)2014-0002。實驗動物按照美國NIH要求在清潔級層流架中飼養(yǎng),環(huán)境溫度22~24℃,相對濕度為(75%±10%),照明時間每天12小時(6:00~18:00)。實驗動物在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,進行藥效活性評價實驗。

        1.2試劑

        對硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, pNPG,批號:026K1516)、α-葡糖苷酶(α-D -glucosidase,批號:G5003-100UN),美國Sigma 公司;考馬斯亮藍試劑盒,南京建成生物研究所(批號:20141103);蔗糖,上海晶純試劑有限公司;蘆丁(批號:14041306),中國生物制品檢定院;淀粉酶活性檢測試劑盒,南京建成生物研究所(批號:20141131);所用水均為蒸餾水,其余試劑均為分析純。

        1.3儀器

        MK3型酶標儀,芬蘭Labsystem公司;Ultra-Turrax T8型組織勻漿機,德國IKA Labordchnik公司;3-18K型臺式高速冷凍離心機,德國Sartorius公司;BS210S電子分析天平,德國Sartorius公司;WH-861型漩渦混合器,太倉市科教器材廠;ACCU-CHCHEK Active血糖儀,德國Roche公司;ZF-Ⅱ型紫外分析儀,上海市安亭電子儀器廠。

        1.4酸角殼提取物制備

        酸角采自云南西雙版納地區(qū),剝離酸角殼后用于本實驗。準確稱取一定量的酸角殼,并使用粉碎機粉碎后回收細粉化的酸角殼,加入10倍量50%乙醇,加熱回流提取120分鐘,過濾后濾渣再用相同條件重復提取一次,合并兩次提取物濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收濾液,獲得的酸角殼浸膏用于動物藥效評價實驗。

        1.5酸角殼提取物中總黃酮的測定

        實驗方法參照2015版《中華人民共和國藥典》[5],其中,標準曲線的制備為精密稱取10.3 mg蘆丁對照品,置50 mL容量瓶中,加入適量甲醇溶解后定容至刻度,制得0.206 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取蘆丁對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL與8.0 mL,分別置于25 mL量瓶中,各加水至8.0 mL,分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻后放置6分鐘,再分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻后放置6分鐘,再分別加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10.0 mL,然后分別加水定容至刻度,搖勻后放置15分鐘,以相應(yīng)的試劑為空白對照,采用紫外可見分光光度計在510 nm處測定各溶液的吸光度。以各溶液的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,所得的線性回歸方程為A=0.46197411m-0.00675(r=0.9995),其中m為溶液濃度,A為溶液吸光度。

        酸角殼提取物總黃酮含量的測定為:分別精確稱取經(jīng)粉碎機粉碎后細粉化的酸角殼3份,按照1.4方法制備酸角殼50%乙醇提取物浸膏;分別將制得的浸膏置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度;分別精密量取1.0 mL溶液置于10 mL容量瓶中,加入甲醇定容至刻度,再分別精密量取1.0 mL置于10 mL容量瓶中,加入甲醇定容至刻度,再分別精密量取3.0 mL置于25 mL容量瓶中,然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻后放置6分鐘,再分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻后放置6分鐘,再分別加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10.0 mL,然后分別加水定容至刻度,搖勻后放置15分鐘,以相應(yīng)的試劑為空白對照,采用紫外可見分光光度計在510 nm處測定各溶液的吸光度。根據(jù)上述的標準曲線計算各樣品溶液中的蘆丁含量。

        1.6大鼠蔗糖負荷實驗

        SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、酸角殼乙醇提取物低劑量(50 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)及高劑量(200 mg/kg)組,每組各10只動物,于實驗開始前禁食12小時,各給藥組經(jīng)灌胃給藥,對照組灌胃給等體積蒸餾水。30分鐘后,分別灌胃給予5 mL 2.5 g/kg蔗糖水溶液,并分別于蔗糖負荷前30分鐘、蔗糖負荷后15、30、60及120分鐘經(jīng)尾靜脈采血,檢測不同時間的血糖水平[6]。

        1.7酸角殼提取物對大鼠小腸α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影響

        實驗方法參照文獻[7-8],SD大鼠隨機分為對照組、酸角殼提取物50、100、200 mg/kg給藥組,每組各7只。各實驗組于實驗開始前禁食12小時,然后分別灌胃給予相應(yīng)劑量酸角殼提取物,對照組給予等容量蒸餾水。給藥30分鐘,實驗動物處死后開腹,立即取出小腸置于冰浴上,基于組織部位根據(jù)分析和實驗操作的需要,按小腸長度從上端起均分三等份剪開,即小腸上段、中段及下段三個部位,小腸上段為十二指腸及空腸上段,小腸中段為空腸中段和下段,小腸下段為回腸。分別將腸內(nèi)容物取出,回收于特定容器中,取下小腸內(nèi)黏膜并回收在特定容器中。與預冷生理鹽水按1∶9比例制成勻漿,考馬斯亮藍試劑盒測定勻漿中蛋白含量。分別測定不同部位小腸內(nèi)黏膜及內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性,同時檢測蛋白質(zhì)含量,并計算和比較同等蛋白質(zhì)量中的酶活性以及抑制率,抑制率計算公式:抑制率(%)=[(U對照-U測試)/U對照]×100%[9]。

        α-淀粉酶活性測定采用試劑盒法,α-葡萄糖苷酶采用比色法,具體方法采用生理鹽水稀釋成蛋白含量的勻漿,作為α-葡萄糖苷酶懸液,以對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物,37℃反應(yīng)20分鐘,用20 μL 0.2 mol/(L·kg) Na2CO3溶液終止反應(yīng),于420 nm處測定在酶作用下所釋放硝基苯酚的吸光度(OD)值,測定酸角殼提取物于420 nm處對小腸黏膜α-葡萄糖苷酶作用下所釋放硝基苯酚OD值的影響。根據(jù)標準α-葡萄糖苷酶A值曲線,計算各組小鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶活性(U)。

        1.8酸角殼提取物給藥后對不同時間大鼠小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶和淀粉酶活性的影響

        SD大鼠隨機分為對照組、給藥后30分鐘、1小時、2小時、3小時組,共五組,每組8只,各實驗組于實驗前12小時禁食后灌胃100 mg/kg酸角殼提取物,對照組給予等容量蒸餾水。各實驗組動物按照不同時間點,處死后開腹,取出小腸置于冰浴上,并參照1.7中實驗方法分別測定小腸不同部位內(nèi)黏膜及內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性,同時檢測蛋白質(zhì)含量,并計算和比較同等蛋白質(zhì)量中的酶活性以及抑制率。

        1.9統(tǒng)計學處理

        2 結(jié)果

        2.1酸角殼提取物中總黃酮含量測定

        實驗結(jié)果如表1所示,酸角殼提取物中的總黃酮平均含量為6.305%,顯示該部位含有黃酮類成分。

        表1 酸角殼提取物總黃酮的含量

        2.2酸角殼提取物對蔗糖負荷小鼠糖吸收的抑制作用

        實驗結(jié)果如表2所示,當給予大鼠2.5 g/kg蔗糖15分鐘后,血糖水平達到峰值,隨后逐漸下降,與對照組相比,50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg酸角殼提取物給藥后均能降低蔗糖負荷后的大鼠血糖水平(P<0.01),其中酸角殼提取物給藥后15及30分鐘具有顯著性差異。

        2.3酸角殼提取物對大鼠小腸α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        實驗結(jié)果如表3及表4所示,小腸內(nèi)容物包含消化液,脫落的腸黏膜細胞和食物殘渣,小腸各段黏膜與小腸道內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶的活性水平比較接近。給予50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg酸角殼乙醇提取物對小腸上段,即十二指腸和空腸上段黏膜和內(nèi)容物α-葡萄糖苷酶活性均顯示一定程度的抑制作用,其中對小腸上段黏膜中α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為57%、59%和66%,對小腸上段內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為36%、47%和51%。中、高劑量酸角殼提取物還對空腸中段和下段(小腸中段)和回腸(小腸下段)內(nèi)容物中的α-葡萄糖苷酶也顯示出一定的抑制作用。

        2.4酸角殼提取物對大鼠小腸α-淀粉酶的抑制作用

        實驗結(jié)果如表5及表6所示,小腸內(nèi)容物中α-淀粉酶活性水平高于黏膜中的活性,同時小腸上段和中段α-淀粉酶活性遠高于下段,表明α-淀粉酶主要集中于十二指腸及空腸,回腸中α-淀粉酶活性較低。不同劑量的酸角殼提取物對小腸中段黏膜和內(nèi)容物淀粉酶活性具有顯著的抑制作用。其中,50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg酸角殼提取物對空腸中段和下段(小腸中段)黏膜中淀粉酶的抑制率為75%、79%和80%,對空腸中段和下段內(nèi)容物中α-淀粉酶的抑制率分別為84%,86%和86%。其抑制效果在不同給藥組間并無顯著差異。

        表2 酸角殼提取物對蔗糖負荷大鼠血糖的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表3 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)黏膜中α-葡萄糖苷酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表4 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表5 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)黏膜中α-淀粉酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表6 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)容物中α-淀粉酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表7 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)容物中α-淀粉酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表8 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)黏膜中α-葡萄糖苷酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表9 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

        表10 酸角殼提取物對大鼠小腸內(nèi)黏膜中α-淀粉酶活性的影響

        注: 與對照組比較,aP<0.05。

        2.5酸角殼提取物給藥后不同時間點對大鼠小腸α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影響

        實驗結(jié)果如表7~10所示,酸角殼乙醇提取物在給藥30分鐘和1小時對小腸上段及中段內(nèi)黏膜中α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用,給藥2小時后抑制作用減弱,對小腸上段內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶的抑制活性由給藥后30分鐘持續(xù)到給藥后2小時,而對小腸中段內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶的抑制活性則由給藥后1小時持續(xù)到給藥后3小時。酸角殼乙醇提取物對小腸上段和中段內(nèi)黏膜α-淀粉酶的抑制活性在給藥后30分鐘較為顯著,對小腸上段內(nèi)容物中α-淀粉酶活性也有明顯的抑制作用,而對小腸中段α-淀粉酶的抑制作用可從給藥后30分鐘一直維持到給藥后3小時。

        3 討論

        糖耐量低下通常會先于空腹血糖和隨機血糖升高出現(xiàn),是糖代謝異常的臨床常見癥狀,也是引起糖尿病的高危因素。據(jù)不完全統(tǒng)計每年大約有6%~10%的糖耐量異常人群轉(zhuǎn)化為糖尿病患者[10],如不進行積極干預,將有超過90%的糖耐量異常者最終發(fā)展成為糖尿病[11]。此外,餐后血糖的異常升高,導致血管內(nèi)皮細胞功能紊亂、氧化應(yīng)激水平升高,引起動脈粥樣硬化以及微血管并發(fā)癥。糖耐量受損不僅是心血管事件的獨立危險因素[12],也是微血管并發(fā)癥發(fā)生的重要原因之一[13]。因此,積極干預糖耐量異常對預防和延緩糖尿病發(fā)生以及心血管和微血管并發(fā)癥具有重要的臨床意義。

        筆者在大鼠糖耐量實驗中發(fā)現(xiàn),給予蔗糖15分鐘后大鼠血糖水平顯著上升,隨后逐漸下降,與對照組相比,不同劑量組酸角殼提取物均能夠顯著抑制蔗糖負荷引起的大鼠血糖升高,降低餐后血糖曲線的波動幅度。有研究表明,糖類成分在體內(nèi)的吸收需要經(jīng)α-淀粉酶水解為含有葡萄糖的低聚糖、雙糖或三糖,再經(jīng)由α-葡萄糖苷酶進一步水解成單糖實現(xiàn)。因此,抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性將有利于延緩和減少糖類成分的吸收,從而降低餐后血糖水平。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶不僅存在于小腸黏膜上皮細胞刷狀緣,同時也大量存在于小腸內(nèi)容物中。小腸內(nèi)容物包括小腸液、脫落的小腸黏膜上皮細胞和腸道微生物,其中包含大量的消化酶。筆者在探討酸角殼提取物對大鼠小腸α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性影響實驗中注意到,α-葡萄糖苷酶的活性在小腸各段黏膜和內(nèi)容之間比較接近,而α-淀粉酶的活性在小腸內(nèi)容物中遠遠高于小腸內(nèi)黏膜,且在小腸不同部位的活性區(qū)別也較大。酸角殼提取物能夠顯著抑制小腸黏膜及內(nèi)容物中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性,提示酸角殼提取物可以通過拮抗腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶,延緩和阻礙食物中糖的吸收,抑制餐后血糖異常波動,減輕對胰島β-細胞的刺激和緩解β-細胞負荷。酸角殼提取物的酶抑制活性在小腸上段與中段作用較強,即對十二指腸與空腸的酶抑制作用較強,綜合比較對小腸不同部位兩種酶活性的作用,在給藥后30分鐘到1小時酸角殼提取物的作用相對較好

        至今為止的一些研究表明酸角殼中含有多酚類化合物[14],筆者在測定酸角殼提取物中總黃酮類成分含量時發(fā)現(xiàn)酸角殼50%乙醇提取物中的黃酮類成分含量在6%以上。黃酮類成分具有改善氧化應(yīng)激、抗炎、抗過敏等廣泛的生理活性[14],筆者的研究結(jié)果提示酸角殼提取物抑制腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性,減少糖吸收,降低餐后血糖水平的活性可能與該提取物中的黃酮類成分有關(guān)。

        綜上所述,酸角殼提取物中含有豐富的黃酮類成分,并對腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有較好抑制作用,提示酸角殼提取物能夠通過阻斷腸道α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性,達到抑制糖類分解和吸收及降低餐后血糖水平的作用。

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        Effectsoftamarindshellonsucrosetoleranceandtheactivityofα-glucosidaseandα-amylaseinsucrose-loadedrats

        LIWeixi,LIUDongli,SUWeiwei,etal.SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China

        Correspondingauthor:GAOYongjian,E-mail:23734909@qq.com

        ObjectiveTo study the inhibitory effects of tamarind shell extract on intestinal absorption of sucrose.MethodsThe sucrose load model of rats were used and blood glucose levels were analyzed chronologically to evaluate the effect of tamarind extract. In vivo experiments were also performed to study the inhibitory effects of tamarind shell extract on the activities of α-glucosidase and α-amylase in the small intestinal mucosa and contents of rats.ResultsTamarind shell extract of all doses had significant effects on the blood glucose levels after 15 min and 30 min of surcrose administration (P<0.01). Tamarind shell extract also significantly inhibited the activities of α-glucosidase and α-amylase in the small intestinal mucosa and contents.ConculusionTamarind shell extract could effectively reduce the blood glucose level in sucrose-loaded rats. The mechanism might be related to its inhibitory effects on the activities of α-glucosidase and α-amylase.

        Tamarind shell extract; Glycemic load; α-glucosidase; α-amylase

        R285.5

        A

        10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.007

        2017-03-04)

        (本文編輯: 禹佳)

        510275 廣州,中山大學生命科學學院(李維熙、蘇薇薇);國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司(李維熙、高永堅);云南中醫(yī)學院中藥學院(李維熙、劉冬麗)

        李維熙(1982- ),女,博士,講師。研究方向:天然產(chǎn)物活性。E-mail:Weixi_li@qq.com

        高永堅(1968- ),本科,高級工程師。研究方向:天然產(chǎn)物活性。E-mail:23734909@qq.com

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