孫 偉，羅國帥

(天津市安定醫(yī)院，天津 300222*通信作者：羅國帥，E-mail：luoguoshuai1988@126.com)

論著·基礎

雙歧桿菌對慢性應激抑郁大鼠學習記憶的影響

孫 偉，羅國帥*

(天津市安定醫(yī)院，天津 300222*通信作者：羅國帥，E-mail：luoguoshuai1988@126.com)

目的觀察雙歧桿菌對抑郁模型大鼠行為及學習記憶的影響，探討雙歧桿菌潛在的抗抑郁作用及機制。方法選取48只成年雄性SD大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為模型組、氟西汀組、雙歧桿菌組和對照組各12只。對照組在標準環(huán)境下飼養(yǎng)6周，另外三組分別單籠孤養(yǎng)并釆用連續(xù)6周慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)的方法建立慢性抑郁大鼠模型。于第3周末至第6周末對雙歧桿菌組和氟西汀組分別給予雙歧桿菌和氟西汀灌胃，模型組和對照組給予同體積生理鹽水灌胃。CUMS前后及干預后，以糖水消耗實驗、體質(zhì)量測量及曠場實驗評估大鼠行為，采用Morris水迷宮試驗評估大鼠學習記憶能力。結果干預后，與對照組相比，模型組的糖水消耗量及體質(zhì)量增加更少、水平運動距離更短、直立次數(shù)更少、糞便粒數(shù)更多(P均<0.05)；與模型組相比，雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠的糖水消耗量更多、體質(zhì)量增加更多、水平運動距離更遠、直立次數(shù)更多、糞便粒數(shù)更少，逃避潛伏期更短、空間探索時間更長、跨平臺次數(shù)更多(P均<0.05)。雙歧桿菌組與氟西汀組的上述指標差異均無統(tǒng)計學意義。結論雙歧桿菌可能有助于改善抑郁模型大鼠的抑郁行為并提高其學習記憶能力，效果與氟西汀類似，其可能通過改善抑郁行為和提高學習記憶能力而發(fā)揮抗抑郁作用。

抑郁癥；雙歧桿菌；大鼠；氟西汀；慢性不可預見性溫和刺激

抑郁癥是一種常見的精神疾病，臨床上主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲緩、興趣喪失、意志活動減退等“三低”癥狀和軀體癥狀等。抑郁癥嚴重危害人類心身健康，世界衛(wèi)生組織(WHO)預計，到2020年抑郁癥的疾病負擔將上升為第2位，占全球疾病負擔的15%[1]。迄今為止，抑郁癥的發(fā)病機制仍未完全闡明，有研究表明，腸道局部炎癥可通過細胞因子、神經(jīng)肽等物質(zhì)的釋放影響大腦的功能，從而出現(xiàn)抑郁癥狀[2]，提示抑郁癥的發(fā)生原因之一可能是“腸-腦軸”的功能障礙。雙歧桿菌是腸道益生菌的重要成員之一，國內(nèi)外研究顯示，雙歧桿菌可提高大腦單胺神經(jīng)遞質(zhì)濃度，發(fā)揮抗抑郁作用[3-4]。已有研究表明，抗抑郁藥物(如氟西汀)可改善抑郁癥患者的認知、學習記憶等。雙歧桿菌被證明可提高單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量，然而目前尚未檢索到雙歧桿菌對抑郁癥行為學及學習記憶影響的相關研究，本研究通過觀察雙歧桿菌灌胃干預后抑郁模型大鼠行為學及學習記憶的變化，探討雙歧桿菌潛在的抗抑郁作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠48只[許可證號：SYXK(京)2011-0039，北京維通利華實驗動物技術有限公司]，體質(zhì)量180～200 g，喂養(yǎng)于濕度40%～50%、溫度(20±2)℃的獨立通氣籠系統(tǒng)，晝夜時間比為12 h/12 h(光照時間為7∶00-19∶00)，食物和水充分供給，自由攝取。大鼠在動物房適應飼養(yǎng)3 d后正式開始實驗。

1.1.2 藥品及試劑

雙歧桿菌，來自天津中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑中心。氟西汀(fluoxetine hydrochloride，F(xiàn)LX)，購自禮來蘇州制藥有限公司，0.9%注射用生理鹽水(0.9% normal saline，N.S)購自北京化工廠。其余試劑均由天津市安定醫(yī)院實驗室自制。

1.1.3 主要設備與儀器

Med曠場測驗箱，用于曠場實驗，購自美國MED Associates公司。Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，用于水迷宮實驗，購于成都泰盟科技有限公司。AG285電子分析天平，用于測量大鼠體質(zhì)量，購自日本CASIO公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)3天后，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、雙歧桿菌組和氟西汀組各12只。對照組在原條件下飼養(yǎng)6周，模型組、雙歧桿菌組及氟西汀組分別單籠孤養(yǎng)并接受連續(xù)6周的慢性不可預見性溫和刺激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)。

1.2.2 CUMS

參考Liu等[5]的抑郁癥造模方法：隨機給予7種應激因子，每天1種，相同刺激不可連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠不能預料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應性反應。應激方法包括：熱應激(45℃，每次5 min，每天1次)；潮濕墊料24 h；明暗顛倒24 h；夾尾巴(每次1 min，尾部近體端1/3處，每天1次)；禁食24 h；禁水24 h；電擊足底(電壓60 V，電擊10次，每次間隔5 s，每只大鼠每天10次)。以糖水消耗量、體質(zhì)量增加量、曠場實驗中的運動距離、直立次數(shù)以及糞便粒數(shù)來判斷抑郁癥造模是否成功。

1.2.3 干預方法

各組均于第3周末至第6周末進行灌胃，灌胃時間為每天9∶00-10∶00。雙歧桿菌組給藥方法：將含有1×1010個活菌細胞的雙歧桿菌粉劑溶于5 mL 0.9%生理鹽水中；氟西汀組給藥方法：以10 mg/kg灌胃劑量的氟西汀溶于5 mL 0.9%生理鹽水中；對照組及模型組均給予相同體積(5 mL)的生理鹽水。

1.2.4 行為評估

采用體質(zhì)量測量、糖水消耗實驗和曠場實驗分別于CUMS前后及灌胃干預后對大鼠行為進行評估。①體質(zhì)量測量：記錄CUMS前后及干預后的體質(zhì)量并計算兩個體質(zhì)量增加量：增加量1= CUMS后-CUMS前；增加量2=干預后-CUMS后；②糖水消耗實驗：禁水24 h后，將所有大鼠置于單籠內(nèi)，給予1%濃度蔗糖水200 mL，1 h后取出水瓶并測量剩余糖水體積，糖水消耗量=消耗糖水體積；③曠場實驗：曠場設置于暗室，由不透明鋼板制成，大小100 cm×100 cm×40 cm(長×寬×高)，實驗時將大鼠置于曠場中心，由攝像機拍攝，采用Smart virsion 2.5軟件記錄并分析大鼠5 min內(nèi)的行為并記錄大鼠運動的總路程(水平運動距離)，人工同步記錄大鼠直立次數(shù)和糞便粒數(shù)。實驗之前預跑30 s，每次實驗后打掃曠場，清除糞便，并用醫(yī)用酒精擦拭以消除大鼠遺留氣味。

1.2.5 Morris水迷宮測試

測試在干預結束后1周進行，包括定位航行實驗及空間探索實驗兩部分。其中，定位航行實驗用于測試學習能力，空間探索實驗用于測試記憶能力。Morris水迷宮被均分為4個象限，水池水溫(22±1)℃，平臺置于第三象限水下1 cm處。對所有大鼠進行水迷宮訓練，訓練時從平臺的對側面向池壁放入大鼠，2 min內(nèi)找到平臺則訓練結束，未找到平臺大鼠則將其引導至平臺，停留數(shù)秒。連續(xù)訓練5天，每只動物每天訓練4次(分別從不同的象限入水)，每次訓練之間間隔10 min。第6天開始定位航行實驗：將大鼠從4個象限中心放入水中，記錄大鼠入水至找到平臺并停留10 s所用時間(即逃避潛伏期)，若在平臺停留不足10 s再次入水則繼續(xù)計時；若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺，則引其上平臺停留10 s，逃避潛伏期記為60 s；將每天記錄的4次逃避潛伏期取平均值，作為大鼠當天的學習指標，逃避潛伏期越長，學習能力越差?？臻g探索實驗：第6天進行水迷宮測試，撤除平臺，在水池第三象限周邊壁上做明顯標記(黑色三角)，開始空間探索實驗。將大鼠放入任意象限，記錄60 s內(nèi)大鼠在平臺所在象限的停留時間(空間探索時間)和跨平臺次數(shù)，作為記憶能力的評價指標。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結 果

2.1 CUMS前四組大鼠行為學指標比較

CUMS前，四組大鼠糖水消耗量、體質(zhì)量、水平運動距離、直立次數(shù)以及糞便粒數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 CUMS前四組大鼠行為學指標比較

注：CUMS，慢性不可預見性溫和刺激

2.2 CUMS后四組大鼠行為學指標比較

造模后，與對照組比較，模型組、雙歧桿菌組、氟西汀組大鼠的糖水消耗量更少、體質(zhì)量增加更少、水平運動距離更短、直立次數(shù)更少、糞便粒數(shù)更多，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。模型組、雙歧桿菌組、氟西汀組比較，大鼠的糖水消耗量、體質(zhì)量增加、水平運動距離、直立次數(shù)、糞便粒數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 CUMS后四組大鼠行為學指標比較

注：CUMS，慢性不可預見性溫和刺激

2.3 干預后四組大鼠行為學指標比較

與對照組相比，模型組的糖水消耗量更少、體質(zhì)量增加更少、水平運動距離更短、直立次數(shù)更少、糞便粒數(shù)更多(P均<0.05)。與模型組相比，雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠的糖水消耗量更多、體質(zhì)量增加量更多、水平運動距離更長、直立次數(shù)更多、糞便粒數(shù)更少，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。進一步兩兩比較，雙歧桿菌組與氟西汀組上述指標差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 干預后四組大鼠行為學指標比較

注：aP<0.05，模型組與對照組比較；bP<0.05，模型組與雙歧桿菌組、氟西汀組比較

2.4 四組大鼠逃避潛伏期比較

自水迷宮訓練第3天起，模型組大鼠的逃避潛伏期長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠的逃避潛伏期均短于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠的逃避潛伏期比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 四組大鼠逃避潛伏期比較秒)

注：aP<0.05，模型組與對照組比較；bP<0.05，模型組與雙歧桿菌組、氟西汀組比較

2.5 四組大鼠空間探索時間和跨平臺次數(shù)比較

干預后，與對照組相比，模型組大鼠的空間探索時間更短、跨平臺次數(shù)更少(P均<0.05)；與模型組相比，雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠的空間探索時間和跨平臺次數(shù)均較多，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 四組大鼠空間探索時間和跨平臺次數(shù)比較

注：aP<0.05，模型組與對照組比較；bP<0.05，模型組與雙歧桿菌組、氟西汀組比較

3 討 論

目前臨床上治療抑郁癥主要使用選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)，然而其對部分抑郁癥患者療效并不理想。隨著對腸道微生物菌群研究的興起，提示可以從“腸-腦軸”去研究抑郁癥的發(fā)病機制及微生物菌群對抑郁癥的作用。

腸道微生物與許多精神疾病的發(fā)生密切相關，抑郁癥可能是一種由腸道菌群紊亂引起的慢性炎癥性疾病在精神方面的表現(xiàn)[6-7]，降低抑郁癥患者炎癥因子的濃度可以減少自殺發(fā)生[8]。實驗表明，人體內(nèi)雙歧桿菌的濃度容易因情緒變化而波動[9]。有研究顯示，應激狀態(tài)下的動物腸道中有益菌含量減少，如雙歧桿菌和乳酸桿菌[10]。以上研究均提示，雙歧桿菌可能通過影響人體內(nèi)炎癥因子的變化而參與抑郁癥的發(fā)病過程，同時具有潛在的抗抑郁作用。有臨床試驗表明[11]，增加腸易激綜合征(IBS)和慢性疲勞綜合征(CFS)患者腸道中的益生菌雙歧桿菌含量，可降低患者焦慮水平、改善患者情緒，這對雙歧桿菌可能改善抑郁情緒提供了參考。研究顯示，雙歧桿菌治療能夠增強個體對不利應激的反應能力[12]，并且可以提高抑郁癥患者大腦5-羥色胺(5-HT)水平[4]，增強對社會的適應能力[13]。以上研究表明，雙歧桿菌可能通過降低抑郁癥患者體內(nèi)炎癥因子濃度，提高大腦中5-HT水平，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究結果顯示，CUMS抑郁造模后，與對照組相比，模型組大鼠的糖水消耗量、體質(zhì)量增加量更少、水平運動距離更短、直立次數(shù)更少、糞便粒數(shù)更多，說明模型組大鼠自主運動能力下降(運動的總距離較短)，探索能力、快感缺乏(直立次數(shù)較少)，緊張焦慮增加(糞便粒數(shù)較多)，處于抑郁狀態(tài)，造模成功。提示CUMS可引起大鼠抑郁行為，與Lu等[14]的研究結果一致。灌胃后，模型組大鼠抑郁樣行為較對照組多，提示模型組抑郁樣行為得到維持；模型組大鼠抑郁樣行為較雙歧桿菌組、氟西汀組多，提示雙歧桿菌、氟西汀均可逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為。其中，氟西汀對大鼠抑郁樣行為的作用與王國棟等[15]的研究結果一致，雙歧桿菌對大鼠抑郁樣行為的作用與Desbonnet等[3]的研究結果一致。雙歧桿菌組與氟西汀組行為學指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示雙歧桿菌對大鼠抑郁樣行為的逆轉(zhuǎn)效果與氟西汀類似，這也進一步從行為學方面印證了Desbonnet等的研究結果。

Morris水迷宮是測試動物學習記憶能力常用的實驗之一[16]，用于測試實驗動物的學習能力和記憶能力[17]。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組逃避潛伏期時間長、空間探索時間短、跨平臺次數(shù)少，說明抑郁模型大鼠的學習及記憶能力受損；與模型組相比，雙歧桿菌組及氟西汀組大鼠的逃避潛伏期時間短、空間探索時間長、跨平臺次數(shù)多，提示雙歧桿菌與氟西汀均可有效改善抑郁模型大鼠的學習記憶能力。但雙歧桿菌組與氟西汀組大鼠的逃避潛伏期、空間探索時間及跨平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示兩者對抑郁模型大鼠的學習及記憶改善能力相當。

綜上所述，雙歧桿菌可能有助于改善抑郁模型大鼠的抑郁行為并提高其學習記憶能力，效果與氟西汀類似，提示雙歧桿菌可能通過改善抑郁行為和提高學習記憶能力而發(fā)揮抗抑郁作用。本研究存在不足之處：樣本量較小，未來仍需大樣本的研究對雙歧桿菌治療抑郁癥的效果進行驗證；初步從行為學方面探討了雙歧桿菌可提高抑郁模型大鼠的學習記憶能力，但仍需從分子生物學、影像學、基因組學等領域進一步探討。

[1] Zunszain PA, Anacker C, Cattaneo A, et al. Glucocorticoids, cytokines and brain abnormalities in depression[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2011, 35(3): 722-729.

[2] Song C, Wang H. Cytokines mediated inflammation and decreased neurogenesis in animal models of depression[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2011, 35(3): 760-768.

[3] Desbonnet L, Garrett L, Clarke G, et al. The probiotic bifidobacteria infantis: an assessment of potential antidepressant properties in the rat[J]. J Psychiatr Res, 2008, 43(2): 164-174.

[4] 羅國帥, 楊建立, 王承展, 等. 雙歧桿菌對大鼠抑郁樣行為及單胺神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J]. 天津醫(yī)科大學學報, 2016, 22(5): 401-405.

[5] Liu D, Wang Z, Gao Z, et al. Effects of curcumin on learning and memory deficits, BDNF, and ERK protein expression in rats exposed to chronic unpredictable stress[J]. Behav Brain Res, 2014, 271: 116-121.

[6] Fehér J, Kovács I, Balacco Gabrieli C. Role of gastrointestinal inflammations in the development and treatment of depression[J]. Orv Hetil, 2011, 152(37): 1477-1485.

[7] Rosenblat JD, McIntyre RS. Bipolar disorder and inflammation[J]. Psychiatr Clin North Am, 2016, 39(1): 125-137.

[8] Beyer JL, Weisler RH. Suicide behaviors in bipolar disorder: a review and update for the clinician[J]. Psychiatr Clin North Am, 2016, 39(1): 111-123.

[9] Goncharova GI, Liz'ko NN, Liannaia AM, et al. Bifidobacterium flora status of cosmonauts before and after completing space flights[J]. Kosm Biol Aviakosm Med, 1981, 15(3): 14-18.

[10] Bailey MT, Lubach GR, Coe CL. Prenatal stress alters bacterial colonization of the gut in infant monkeys[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2004, 38(4): 414-421.

[11] Rao AV, Bested AC, Beaulne TM, et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study of a probiotic in emotional symptoms of chronic fatigue syndrome[J]. Gut Pathog, 2009, 1(1): 6.

[12] Gareau MG, Jury J, MacQueen G, et al. Probiotic treatment of rat pups normalises corticosterone release and ameliorates colonic dysfunction induced by maternal separation[J]. Gut, 2007, 56(11): 1522-1528.

[13] Brummelte S, Mc Glanaghy E, Bonnin A, et al. Developmental changes in serotonin signaling: implications for early brain function, behavior and adaptation[J]. Neuroscience, 2017, 342: 212-231.

[14] Lu J, Shao RH, Jin SY, et al. Acupuncture ameliorates inflammatory response in a chronic unpredictable stress rat model of depression[J]. Brain Res Bull, 2017, 128: 106-112.

[15] 王國棟, 董嬌, 李晏, 等. 慢性應激抑郁模型大鼠海馬組織S100B表達及氟西汀的干預作用[J]. 中華行為醫(yī)學與腦科學雜志, 2013, 22(11): 978-981.

[16] 曾雪愛, 陳道亮, 黃俊山. 兩種水迷宮在測試擬阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力中的比較[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2009, 19(9): 25-27.

[17] Morris RGM. Spatial localization does not require the presence of local cues[J]. Learn Motiv, 1981, 12(2): 239-260.

(本文編輯：唐雪莉)

Effectofbifidobacteriaontheabilitiesofleaningandmemoryinchronicunpredictablestressrats

SunWei,LuoGuoshuai*

(TianjinAndingHospital,Tianjin300222,China*Correspondingauthor:LuoGuoshuai，E-mail：luoguoshuai1988@126.com)

ObjectiveTo observe the effect of bifidobacteria on the behavior, learning and memory of depressive model rats, and to explore the potential antidepressant effect and mechanism of bifidobacteria.Methods48 male SD rats were divided into the model group, fluoxetine group, bifidobacteria group and control group according to random number table, 12 in each group. Rats in control group were fed in standard environment for 6 weeks. Rats in other three groups were all fed alone and

chronic unpredicted mild stress (CUMS) for 6 weeks to establish chronic depression rat model. Rats in bifidobacteria group and fluoxetine group were given by gavage with bifidobacteria and fluoxetine respectively once a day during the last 3 weeks, while model group and control group were given by gavage with the same volume of normal saline. Every rat received behavioral assessment by sucrose water consumption test, weight measurement and open field test before and after CUMS and after intervention. The Morris water maze test was used to assess the learning and memory ability.ResultsAfter intervention, compared with the control group, less sugar water consumption and gain of body weight, shorter distance of horizontal motion, less vertical times and more fecal grains were found in model group (allP<0.05). Compared with the model group, more sugar water consumption and gain of body weight, farther distance of horizontal motion, more vertical times, less fecal grains, shorter escape latency, longer space exploration time, more cross-platform times were found in the bifidobacteria group and fluoxetine group (allP<0.05). There was no significant difference between bifidobacteria group and fluoxetine group among above indicators.ConclusionBifidobacteria can effectively improve the depressive behavior and the abilities of leaning and memory of the depression model rats, the effect is similar to fluoxetine. Bifidobacteria may play an anti-depressant role by improving depression behavior and learning and memory ability.

Depression; Bifidobacteria; Rat; Fluoxetine; Chronic unpredictable mild stress

R749.4

A

10.11886/j.issn.1007-3256.2017.05.006

2016-10-23)