鄧曉劍，顧建華，何頂秀，黃楷森

(1.德陽市人民醫(yī)院·成都中醫(yī)藥大學(xué)德陽臨床醫(yī)學(xué)院，1.心內(nèi)科；2.神外科；3.急診科，四川 德陽 618000)

吸煙對HDL-C正常者的膽固醇外流功能影響的研究

鄧曉劍1，顧建華2，何頂秀3，黃楷森1

(1.德陽市人民醫(yī)院·成都中醫(yī)藥大學(xué)德陽臨床醫(yī)學(xué)院，1.心內(nèi)科；2.神外科；3.急診科，四川 德陽 618000)

目的通過對比吸煙和不吸煙者外周血中高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)相關(guān)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流功能，以明確吸煙對于膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程的影響。方法分別納入42名高密度脂蛋白膽固醇正常的吸煙者和不吸煙者為研究對象，使用膽固醇外流熒光分析法，測量研究對象外周血血漿中的HDL對J774A.1巨噬細(xì)胞外流率的影響。結(jié)果兩組研究對象在一般情況、血脂譜和高敏C反應(yīng)蛋白基本一致情況下，吸煙組巨噬細(xì)胞膽固醇外流率顯著低于不吸煙組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[(25.72±7.36)%vs. (29.53±7.97)%,P<0.05]，提示吸煙可影響HDL相關(guān)的膽固醇外流功能。結(jié)論吸煙者HDL相關(guān)的膽固醇外流率顯著低于不吸煙者，表明吸煙者體內(nèi)HDL的抗動脈粥樣硬化功能受到明顯削弱，提示戒煙在心血管疾病一級預(yù)防中的重要性。

吸煙；高密度脂蛋白，膽固醇外流率

心血管疾病自1990年起持續(xù)為我國居民首位死因，其中75%以上的心血管疾病是動脈粥樣硬化性疾病。而在動脈粥樣硬化性疾病中，31.9%的發(fā)病危險度歸因于吸煙，僅次于高血壓[1]。在動脈粥樣硬化形成的病理生理過程中，脂質(zhì)異常被認(rèn)為是中心環(huán)節(jié)之一[2]。既往大量研究證實了吸煙可通過升高低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)，降低高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)，促進(jìn)LDL的氧化修飾等多種機(jī)制促進(jìn)膽固醇在動脈內(nèi)膜下異常沉積，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成[3-4]。然而，吸煙是否可作用于HDL相關(guān)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程目前仍少有研究。因此，本研究通過測定吸煙患者HDL相關(guān)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流功能，以明確吸煙對于膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程是否存在影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對象

納入2015年11月至2015年12月在德陽市人民醫(yī)院體檢中心的42名明確吸煙指數(shù)(smoking index，SI)≥400，且HDL-C正常者為吸煙組。同時，根據(jù)吸煙組患者性別和年齡(±1歲)進(jìn)行配對，納入42名否認(rèn)吸煙史，且HDL-C42正常者為不吸煙組。兩組患者一般資料見表1。 兩組患者在BMI、心率、收縮壓以及舒張壓等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示兩組患者一般情況具有可比性。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲或孕產(chǎn)婦；(2)合并糖尿病、冠心病、心衰、腦卒中、嚴(yán)重肝腎疾病、腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病患者；(3)合并任何類型的現(xiàn)癥感染；(4)合并嚴(yán)重心理精神疾病；(5)拒絕簽署知情同意書。

表1 吸煙組與不吸煙組一般情況比較

注：兩組間比較采用 Paired-SamplesT檢驗。

1.2測量指標(biāo)

采集患者空腹外周靜脈血30 mL，常規(guī)方法測定總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、LDL-C、HDL-C，載脂蛋白(apolipoprotein,Apo)AⅠ和B，脂蛋白(lipoprotein,LP)a以及高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hsCRP)，同時制備外周靜脈血血漿以測定膽固醇外流。

1.3主要材料與試劑

J774A.1巨噬細(xì)胞株(普諾賽)，膽固醇外流分析試劑盒-熒光法(Biovision)，RPMI 1640培養(yǎng)基(普諾賽)和胎牛血清FBS(普諾賽)，96孔板(塞默飛世爾)，熒光分光光度計(日立F-4600 型)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4膽固醇外流率測定

將J774.1細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)直至90%融合狀態(tài)(37℃孵育，5%CO2)。在無菌條件下將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板，平均每孔含細(xì)胞約1×105個及100μL培養(yǎng)液。生長2 h后，當(dāng)細(xì)胞附著于孔板，用RPMI 1640洗滌細(xì)胞。每孔添加含50μL標(biāo)記液后培養(yǎng)板過夜(約16 h)后，移除標(biāo)記液，再次洗滌細(xì)胞。將處理后的患者血清加入J774.1細(xì)胞至每孔100μL，孵育約4～6 h。在孵育結(jié)束時，將上清液轉(zhuǎn)移到96孔板，測量細(xì)胞外流液熒光值。在剩下細(xì)胞中加入裂解液100μL，充分裂解后再次測量細(xì)胞裂解液熒光值。膽固醇外流率計算公式為：膽固醇外流率(%)=100%×細(xì)胞外流液熒光強(qiáng)度/(細(xì)胞外流液熒光強(qiáng)度+細(xì)胞裂解液熒光強(qiáng)度)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1血脂及hsCRP比較

兩組患者空腹血中CHOL、TG、LDL-C、HDL-C、Apo AⅠ、ApoB、LP(a)及hsCRP水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)，且均在正常值范圍之內(nèi)。

指標(biāo)吸煙組不吸煙組P值TC(mmol/L)4.21±0.764.04±0.920.437TG(mmol/L)1.76±1.051.80±0.960.867HDL-C(mmol/L)1.34±0.441.34±0.440.977LDL-C(mmol/L)2.33±0.702.11±0.660.139Apo-AⅠ(g/L)1.33±0.221.25±0.270.203Apo-B(g/L)1.25±0.281.20±0.350.507LP(a)(mg/L)223.58±92.73208.56±89.040.452hsCRP(mg/L)2.64±0.642.49±0.600.242

*兩組間比較采用 Paired-Samples T 檢驗。

2.2膽固醇外流率比較

由吸煙組與不吸煙組外周空腹血血漿中HDL所介導(dǎo)的，J774A.1小鼠單核巨噬的膽固醇外流率分別為(25.72±7.36)%和(29.53±7.97%)，見圖1，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。

*P<0.05，與吸煙組比較。

3 討論

本研究通過對比吸煙組與不吸煙組患者外周血血清中HDL，對于J774A.1巨噬細(xì)胞膽固醇外流率的影響，發(fā)現(xiàn)在兩組患者在一般情況、脂質(zhì)譜和hsCRP基本一致情況下，吸煙組巨噬細(xì)胞膽固醇外流率顯著低于不吸煙組。提示吸煙降低患者HDL介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流率，是HDL的抗動脈粥樣硬化功能失效的可能機(jī)制。

損傷-反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和膽固醇大量沉積。由單核細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)化而來的巨噬細(xì)胞在內(nèi)皮下大量吞噬脂質(zhì)后成為泡沫細(xì)胞，并于內(nèi)皮下其他成分相互作用逐漸形成動脈粥樣硬化病變。與此同時，HDL作為動脈粥樣硬化的保護(hù)因素，可以作為膽固醇的接受體，介導(dǎo)膽固醇從巨噬細(xì)胞流出并轉(zhuǎn)運之到肝臟進(jìn)行代謝，從而降低膽固醇水平，預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生[5]。目前主要通過測定其中的膽固醇成分對HDL進(jìn)行間接定量測定。既往研究發(fā)現(xiàn)吸煙可導(dǎo)致HDL-C水平降低。Craig等[6]回顧了54項研究，發(fā)現(xiàn)吸煙者血漿中HDL-C水平較不吸煙者相比平均低6%。Forey等[7]所做的系統(tǒng)評價表明，HDL-C水平在戒煙前后差值為0.06～0.11 mmol/L。大量研究關(guān)注吸煙與HDL-C水平關(guān)系的同時，僅有極少數(shù)研究涉及了吸煙與HDL功能之間的關(guān)系，如Kralova等[8]發(fā)現(xiàn)不吸煙的中年女性HDL所介導(dǎo)的膽固醇外流率較吸煙者顯著增加。

本研究選擇HDL-C正常者為研究對象，可部分排除HDL水平高低不同對于膽固醇外流率的影響。同時，本研究在測量膽固醇外流率時使用巨噬細(xì)胞，而非研究對象自身來源巨噬細(xì)胞，故此時的膽固醇外流率主要反映研究對象體內(nèi)HDL對于膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程的影響。結(jié)果提示吸煙組巨噬細(xì)胞膽固醇外流率顯著低于不吸煙組，與既往類似研究結(jié)果一致[8]。本研究在檢測膽固醇外流率過程時，采用了熒光標(biāo)記的膽固醇，而非既往研究常用的放射性同位素標(biāo)記。這種新的檢測方法[9]，可有效避免放射性同位素的輻射效應(yīng)，同時顯著降低了檢測成本，適用大樣本量的檢測。

吸煙是動脈粥樣硬化疾病的重要致病因素，同時也幾乎是惟一能夠完全逆轉(zhuǎn)致病因素。大量流行病學(xué)調(diào)查和前瞻性臨床研究結(jié)果均證實吸煙與心血管疾病存在因果關(guān)系。戒煙治療的花費用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥物治療的費用，因此戒煙是避免心血管病死亡最經(jīng)濟(jì)、有效的干預(yù)措施。同時也是心血管疾病一級預(yù)防的主要措施[1]。既往大量研究證實吸煙可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，血管炎癥，血小板聚集，內(nèi)皮功能紊亂以及血脂譜異常[3]，本研究發(fā)現(xiàn)在未合并明確心血管疾病的長期重度吸煙者，體內(nèi)HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流率顯著降低，HDL的抗動脈粥樣硬化功能受到明顯削弱。本研究結(jié)果再次強(qiáng)調(diào)了戒煙在心血管疾病一級預(yù)防中的重要地位，以及通過行為治療、心理社會支持以及戒煙藥物治療等多種方式提高戒煙成功率的重要性。

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StudytheeffectsofsmokingoncholesteroleffluxfunctioninhealthysubjectswithnormalHDL-C

Deng Xiao-jian1,Gu Jian-hua2,He Ding-xiu3,Huang Kai-sen1

(1.DepartmentofCardiology;2.DepartmentofCerebralSurgery;3.DepartmentofEmergency,People’sHospitalofDeyangCity,ChengduUniversityofTCM,Deyang618000,Sichuan,China)

Objective：To investigate and compare the HDL related cholesterol efflux capabilities between smokers and non-smokers without arteriosclerotic cardiovascular disease,and to determine the effects of smoking on reverse cholesterol transport.Methods42 smoking patients with normal HDL in smoking group and 42 non-smoking patients in control group were included.The effect of HDL in peripheral blood plasma on the efflux rate of J774A.1 macrophages was measured by cholesterol efflux fluorescence analysis.ResultsThe capability of HDL to activate cholesterol efflux was shown to reduce significantly in smoking group,compared with non-smoking group(25.72±7.36%vs.29.53±7.97% ).the two groups of subjects in the general situation,blood lipid spectrum and high sensitivity C reactive protein basically the same situation,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionHDL related cholesterol efflux rate in smokers was significantly lower than that of non-smokers,smokers showed that HDL anti atherosclerosis function is obviously weakened,suggesting the importance of smoking cessation in the primary prevention of cardiovascular diseases.

Smoking;High-density lipoprotein;Cholesterol efflux

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.022

四川省醫(yī)學(xué)會青年創(chuàng)新課題(Q16027、Q15064)

2017-05-10

鄧曉劍(1968-)，男，副主任醫(yī)師。E-mail：hushijie2004@sina.com

黃楷森，E-mail：271388479@qq.com

時間： 2017-10-10 02∶28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.046.html

1005-3697(2017)05-0725-03

R541.4

A

(學(xué)術(shù)編輯羅勇)

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