于喆源（張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 張掖 734000）張婕（蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000）

對(duì)食品中脫氫乙酸HPLC檢驗(yàn)方法的研究

于喆源（張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 張掖 734000）張婕（蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 730000）

在脫氫乙酸的高效液相法檢測(cè)時(shí)，常會(huì)因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間漂移和峰形拖尾嚴(yán)重，影響對(duì)目標(biāo)物的定性和定量。本文通過(guò)對(duì)脫氫乙酸化學(xué)性質(zhì)的分析及考察樣品pH，流動(dòng)相pH，色譜柱類型對(duì)檢測(cè)的影響，來(lái)有效控制拖尾和保留時(shí)間漂移，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。研究結(jié)果表明：用HPLC檢驗(yàn)脫氫乙酸，采用封尾工藝的色譜柱，樣品pH在5-7，流動(dòng)相用pH=4.5的醋酸鈉緩沖液-甲醇（85:15）體系檢驗(yàn)，回收率，精密度，檢出限，重現(xiàn)性良好，能更好的滿足樣品檢驗(yàn)的需求。

高效液相色譜；pH值；脫氫乙酸

脫氫乙酸鈉是一種廣譜，抑菌力極強(qiáng)的食品防腐劑。對(duì)霉菌、酵母菌、細(xì)菌的抑制能力特別強(qiáng)，廣泛的應(yīng)用于果汁、醬菜、乳酸菌飲料、果醬、糕點(diǎn)等各類食品加工行業(yè)中[1]。在我國(guó)為合法添加劑，最大限制為0.3g/kg[2]。

目前脫氫乙酸的檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法為氣相色譜法和高效液相色譜法。氣相色譜法實(shí)驗(yàn)流程較為繁瑣，目前大部分實(shí)驗(yàn)室選擇使用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)分析。依據(jù)國(guó)標(biāo)方法，采用C18色譜柱，乙酸銨緩沖鹽溶液-甲醇（90:10）體系為流動(dòng)相時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)保留時(shí)間漂移和嚴(yán)重的峰形拖尾現(xiàn)象，增加實(shí)驗(yàn)的不確定性[3-6]。為此本文通過(guò)對(duì)脫氫乙酸化學(xué)性質(zhì)的分析，研究色譜柱工藝和樣品pH，流動(dòng)相pH對(duì)分析的影響，提出改進(jìn)方法，盡可能達(dá)到在穩(wěn)定色譜條件分析目標(biāo)物的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260型，配有二極管陣列檢測(cè)器；梅特勒萬(wàn)分之一天平：EL204-IC；梅特勒千分之一天平：ML503/02；離心機(jī)：10000r/min，tgl-16a高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；酸度計(jì)：梅特勒320型；甲醇：色譜純，德國(guó)默克；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.5%，美國(guó)sigma公司；其他試劑均為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水為滿足GB/T 6682的一級(jí)水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

脫氫乙酸儲(chǔ)備液（1.0mg/ml）:精密稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品100mg至100ml容量瓶，用20ml氫氧化鈉溶液（20g/L）溶解后用水定容。4℃保存。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20ml的脫氫乙酸儲(chǔ)備液，用水定容至100ml容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4℃保存。

1.3 樣品處理

稱取樣品1g（液體樣品吸取1g）至50ml離心管中，精密加水15ml，超聲處理30min，然后分別精密加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2.5ml，振搖，8000r/min離心10min，取上清液，分別用乙酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為5、7，9，過(guò)0.45um濾膜后上機(jī)。

1.4 色譜條件

第一組C18未封尾+乙酸銨（0.02mol/L）緩沖液-甲醇（90:10）體系流動(dòng)相[7]

第二組C18封尾柱+乙酸銨（0.02mol/L）緩沖液-甲醇（90:10）體系流動(dòng)相

第三組C18封尾柱+乙酸銨（0.02mol/L，后用乙酸調(diào)節(jié)pH為5.5）緩沖液-甲醇（90:10）體系流動(dòng)相

第四組C18封尾柱+乙酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇（90:10）體系流動(dòng)相

封尾柱為：Agilent Extend-C18(250mm*4.6mm,5um)

非封尾柱為：Agilent SB-C18(250mm*4.6mm,5um)

檢測(cè)器波長(zhǎng):293nm，進(jìn)樣量:10ul，流速1ml/min，保留時(shí)間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品pH對(duì)檢驗(yàn)的影響

依據(jù)上述樣品處理方法，調(diào)節(jié)pH后，國(guó)標(biāo)色譜條件（第一組）進(jìn)樣，考察其保留時(shí)間，峰形對(duì)稱性。

在堿性環(huán)境下，脫氫乙酸會(huì)得到裂峰，不能作為定量定性依據(jù)，故拖尾因子未標(biāo)出。國(guó)標(biāo)GB 5009.121-2016要求對(duì)樣品提取液要調(diào)節(jié)pH值至中性或酸性，但多數(shù)糕點(diǎn)會(huì)使用純堿等堿性物質(zhì)，所以堿性較強(qiáng)，不利于分析。綜上，確定樣品pH為7為最佳。

2.3 流動(dòng)相pH對(duì)檢測(cè)的影響

表1是樣品pH為7，采用封尾工藝色譜柱時(shí)，不同pH流動(dòng)相對(duì)其峰形和保留時(shí)間的影響。

表1

由表可知，流動(dòng)相pH對(duì)于脫氫乙酸的保留時(shí)間無(wú)明顯影響，但對(duì)其峰形對(duì)稱性有較為明顯的影響。在使用中性體系流動(dòng)相時(shí)峰形對(duì)稱性差，隨著流動(dòng)相酸性的增加，峰形對(duì)稱性好轉(zhuǎn)，當(dāng)pH達(dá)到4.5時(shí)，峰形對(duì)稱性已到達(dá)1.01。綜上，乙酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇體系流動(dòng)相更適合脫氫乙酸分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性，精密度和最低檢出限

使用1.2配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，在上述實(shí)驗(yàn)中得到的最佳條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=22.43799x-17.15686，r=0.9998，線性良好。6針連續(xù)進(jìn)樣，RSD小于0.7%，精密度良好。在該條件下，以3倍信噪比為檢出限，以10倍信噪比為定量限，檢測(cè)線達(dá)到0.2mg/kg，定量限達(dá)到2mg/kg，滿足國(guó)標(biāo)GB 5009.121-2016對(duì)檢出限，定量限的規(guī)定。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)脫氫乙酸化學(xué)性質(zhì)的分析和實(shí)驗(yàn)證明，在脫氫乙酸的分析中，采用封尾色譜柱和偏酸性流動(dòng)相可以更好的得到穩(wěn)定的結(jié)果。當(dāng)流動(dòng)相構(gòu)成為乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）-甲醇體系時(shí)，調(diào)整兩相比例，對(duì)峰形和穩(wěn)定性影響不顯著，選擇85：15的比例作為實(shí)驗(yàn)比例，可以在保證穩(wěn)定的情況下，有效提高實(shí)驗(yàn)效率，減少工作負(fù)荷。

[1]駱萌.脫氫乙酸及相關(guān)化合物生產(chǎn)技術(shù)[J].化工中間體,2004,7(1):31-33.

[2]明立艷,張忠義.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量[J].食品研究與開發(fā),2009,30(3):106-108.

[3]GB/T 23377—2009,食品中脫氫乙酸的測(cè)定高效液相色譜法[S].中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2009.

[4]王若燕,王立媛.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量的研究[J].浙江科學(xué)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,15(11):97-99.

[5]張輝珍,馬愛國(guó),梁惠,等.高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸的方法研究[J].衛(wèi)生研究,2007,36(6):748-750.

[6]GB 5009.121-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[S]食品中脫氫乙酸的測(cè)定.