徐 繁, 李 瀟, 劉蘭芳, 潘興華, 張 力, 張圣林, 林萍萍, 李青山

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院, 河北 承德 067000 2.解放軍昆明總醫(yī)院干細胞工程實驗室， 云南 昆明 650000)

靈芝多糖對多柔比星誘導心肌細胞損傷保護作用的研究

徐 繁1, 李 瀟1, 劉蘭芳1, 潘興華2, 張 力1, 張圣林1, 林萍萍1, 李青山1

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院, 河北 承德0670002.解放軍昆明總醫(yī)院干細胞工程實驗室， 云南 昆明650000)

目的研究靈芝多糖對多柔比星所致心肌損傷的保護作用，探討多柔比星對心肌細胞損傷的機制。方法將不同濃度多柔比星(1、2、4、6μmol/L)與H9C2心肌細胞共培養(yǎng)6、12、24h，計算不同作用時間及藥物濃度的細胞抑制率；將H9C2心肌細胞與不同質(zhì)量濃度(0，3.125，6.25，12.5，25mg/L )的靈芝多糖共培養(yǎng)，1h后加入多柔比星，24h后觀察細胞形態(tài)變化，并計算細胞抑制率；將靈芝多糖與MCF-7，KB，K562共培養(yǎng)24h，1 h后加入多柔比星，48h后計算細胞生長抑制率。結果2μmoL/L多柔比星與心肌細胞共培養(yǎng)24h的細胞抑制率最高，25mg/L靈芝多糖可明顯降低多柔比星誘導的心肌細胞死亡，且不降低藥物抗腫瘤作用。結論靈芝多糖對心肌細胞具有直接保護作用，且不減弱多柔比星抗腫瘤作用。

靈芝多糖; 心肌細胞; 多柔比星

多柔比星具有廣譜抗腫瘤作用，但其對正常細胞(心臟、肝臟、腎臟等細胞)具有毒性作用，嚴重制約多柔比星的臨床應用，其中最嚴重的是劑量依賴性心臟毒性，且臨床上尚無有效口服藥物減輕此藥物毒性。靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides，GL-PS)是靈芝的主要活性藥效成分之一，具有抗自由基、免疫增強和抗腫瘤作用。有相關研究表明，靈芝多糖具有對抗心肌細胞損傷，從而保護心血管的作用[1]。本研究說明GL-PS對心肌細胞具有直接保護作用，且不減弱多柔比星抗腫瘤作用。

1 實驗試劑

鹽酸多柔比星注射液購于山西普德藥業(yè)股份有限公司，靈芝多糖購于北京康泰合元生物公司，DMEM完全培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT為Gibco公司產(chǎn)品。大鼠心肌細胞H9C2、人紅白血病細胞 K562、人口腔上皮癌細胞 KB、人乳腺癌細胞MCF-7 由中國科學院細胞庫提供。

2 方 法

2.1不同濃度多柔比星不同時間對心肌細胞的影響:將H9C2細胞置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定并90%融合時加入0.25%胰酶消化，待細胞變形立即加入總體積10%胎牛血清終止消化，棄上清，調(diào)整細胞密度為1×104個，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，并加入分別含多柔比星濃度分別為1、2、4、6μmoL/L的培養(yǎng)液，其中未經(jīng)多柔比星處理的細胞為空白中，經(jīng)藥物處理的細胞為給藥組，并將其共同置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24h，取出后用MTT法在酶標儀上波長550nm處進行光密度定量檢測，以測得的光密度值(OD)反映細胞活性和數(shù)量的多少。細胞抑制率(%)=(空白組OD-給藥組OD)/空白組OD×100%。

2.2心肌細胞培養(yǎng)及給藥:將H9C2細胞在96孔板中培養(yǎng)穩(wěn)定，24h后加入不同質(zhì)量濃度(0，3.125，6.25，12.5，25mg/L )的GL-PS，1h后加入最適濃度多柔比星(最適濃度根據(jù)本實驗方法2.1得出)，僅含GL-PS的細胞作為對照組；僅含多柔比星，不含GL-PS的處理組作為模型組；同時含有兩種藥物的為干預組。培養(yǎng)24h后，用 MTT 法在波長550 nm處測定吸光度值表示細胞活力。細胞抑制率按以下公式計算：細胞抑制率(%)=(對照組OD-模型組或干預組OD)/對照組OD×100%。

2.3腫瘤細胞培養(yǎng)及給藥:為了評價GL-PS對多柔比星抗腫瘤活性的影響，分別將三株人源腫瘤細胞MCF-7，KB ，K562接種于96孔板上，每孔細胞量2×103個。24h后加入不同質(zhì)量濃度(0，3.125，6.25，12.5，25mg/L )的GL-PS，1h后加入多柔比星(根據(jù)方法2.1得出)。其中，僅含GL-PS作為對照組；僅含多柔比星作為模型組 ；同時含有GL-PS和多柔比星的處理組為干預組。細胞培養(yǎng)48 h后，MTT法在波長550 nm處測定吸光度值表示細胞活力。細胞生長抑制率按照以下公式計算：細胞抑制率(%)=(對照組OD-模型或干預組OD)/對照組OD×100%。

3 結 果

3.1不同時間、不同濃度多柔比星對心肌細胞影響:實驗結果表明不同多柔比星濃度對心肌細胞活性均有現(xiàn)抑制作用。但多柔比星以2μmoL/L的濃度作用24H抑制心肌細胞活性作用最強，當濃度增加到4μmoL/L時各時間點抑制率明顯下降。以上結果表明選取多柔比星濃度為2μmoL/L，作用24h，為最佳實驗濃度和時間。實驗結果見表1。

3.2GL-PS對多柔比星所致H9C2心肌細胞抑制率的影響:在本研究中，模型組心肌細胞H9C2經(jīng)過2moL/L多柔比星處理 24h后，細胞活力較對照組下降了40%左右。在加多柔比星之前1h給予不同質(zhì)量濃度的GL-PS(3.125～25mg/L) ，顯示一定的保護效果，隨著GL-PS濃度升高細胞抑制率明顯降低。見表2、圖1。

表1 不同濃度多柔比星及不同作用時間對心肌細胞抑制率

表2 MTT測定GL-PS對多柔比星所致H9C2心肌細胞抑制率的影響

圖1

圖2

3.3顯微鏡觀察GL-PS對多柔比星誘導心肌細胞形態(tài)的影響:如圖可見，對照組正常心肌細胞呈現(xiàn)梭狀，心肌細胞結構正常，細胞膜完整，細胞之間相互連接(見圖2)；模型組大都數(shù)心肌細胞明顯呈現(xiàn)圓縮形，細胞問連接減少，偽足消失，細胞腫脹，甚至出現(xiàn)死亡(見圖3)；與模型組比較，GL-PS組心肌細胞結構功能和細胞形態(tài)顯著改善，死亡細胞減少(見圖4)。

圖3

圖4

注：心肌細胞形態(tài)變化(×100)

3.4對多柔比星抑制腫瘤細胞生長的影響:多柔比星在0.1moL/L濃度下，對MCF-7、KB及K562 3種細胞的抑制率分別為 42.0%，37.2%和 43.7%。提前1 h加入不同質(zhì)量濃度 (3.125～25mg/L )的GL-PS，對上述細胞的抑制率分別為35.6%～42.1%，32.6%～43.6%，43.3～46.1%，此結果表明GL-PS對多柔比星抗腫瘤作用并無影響。

4 討 論

多柔比星可抑制RNA和DNA合成，抗瘤譜較廣，屬周期非特異性藥物，適用于急性白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、肉瘤等疾病，但目前認為總量不易超過450mg～550mg/m2，否則發(fā)生心臟毒性，嚴重時可出現(xiàn)心臟衰竭。普遍認為多柔比星心臟毒性與過量氧自由基的產(chǎn)生有關，抑制氧自由基的產(chǎn)生，或者直接清除過量氧自由基，均有助于減輕多柔比星的心臟毒性。Chen 等[2]卵巢癌大鼠模型上發(fā)現(xiàn)靈芝多糖肽能顯著減少丙二醛的產(chǎn)生和增加血清抗氧化酶的活性，表明了靈芝多糖肽具有抗氧化、清除自由基作用。有研究表明，化療病人的血清中多柔比星最高濃度為5μmoL/L[3]，本實驗過程中，依據(jù)文獻資料選取多柔比星濃度范圍為1～6μmoL/L，經(jīng)過不同的時間點6、12、24h作用。研究發(fā)現(xiàn)作用24h后，多柔比星對心肌細胞活性抑制率最高是2μmoL/L濃度。該時期多柔比星可造成心肌細胞大量死亡。然而，用3.125～25mg/L的GL-PS預處理細胞1h后，隨著GL-PS濃度增加多柔比星誘導的死亡細胞的數(shù)量明顯減少。說明GL-PS對心肌細胞具有直接保護作用?，F(xiàn)代研究認為靈芝多糖肽不僅能夠直接抑制腫瘤的生長和血管生成，還具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。但本實驗將GL-PS與腫瘤細胞共培養(yǎng)未顯示明顯的協(xié)同增效作用。

目前，公認有效的抗多柔比星心臟毒性藥物有輔酶Q10、右丙亞胺，但無口服有效的藥物。在本研究中，未采用陽性對照藥物，是本試驗設計的不足之處 。但本研究提供的實驗結果，仍能充分地證明GL-PS對于防治多柔比星心臟毒性的潛在價值。

[1] 曹容華．靈芝多糖對免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].山東醫(yī)科大學學報，1993，31(4)：287～290．

[2] Chen YG, Shen ZJ, Chen X. Modulatory effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on serum antioxidant enzymes activities in ovarian cancer rats[J].Carbohydrate Polymers, 2009, 78(2): 258～262.

[3] Minotti G，Menna P，Salvatorelli E，Cairo G Gianni L．Anthracyclines：molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity[J].Pharmacol Rev,2004，56：185～229.

[4] Liang Z, Yi Y, Guo Y, et al. Chemical characterization and antitumor activities of polysaccharide extracted from Ganoderma lucidum[J].International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(5): 9103.

StudyontheProtectiveEffectofGanodermaLucidumPolysaccharidesaboutDoxorubicinInducingMyocardialCellInjury

XUFan,LIXiao,LIULanfang,etal

(TheAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HebeiChengde067000,China)

Objective:To study the protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on adriamycin induced myocardial injury, and to explore the mechanism of adriamycin induced myocardial cell.MethodsDifferent concentrations of doxorubicin (1, 2, 4, 6μmol/L) with H9C2 were cultured for 6, 12, 24h，then calculated the cell inhibitory rates at different time and concentration;H9C2cardiac myocytes were cultured with Ganoderma lucidum polysaccharides of different mass concentrations (0, 3.125, 6.25, 12.5, 25mg/L),adding doxorubicin after 1h,observing morphological changes of the cells after 24h,calculating the cell inhibition rate；MCF-7，KB，K562 were cultured with Ganoderma lucidum polysaccharides,adding doxorubicin after 1h,after 48h calculating the cell inhibition rateResultsThe inhibition rate of 24h was the highest when 2μmol/L was cocultured with cells，25mg/L Ganoderma lucidum polysaccharides can significantly reduce the death of myocardial cells induced doxorubicin, and not reduce the anti-tumor effect of drugs.ConclusionGL-PS has a protective effect on myocardial cells, had no effect on adriamycin inhibit the growth of tumor cells, there is no synergistic effect.

Ganoderma lucidum polysaccharide; Myocardial cells; Adriamycin

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.10.002

1006-6233(2017)10-1588-04

李青山，E-maillibing200865@126.com

承德市科學技術研究與發(fā)展計劃項目，(編號：201601A055)