林 黎， 王智超， 朱保平

(武漢市第一醫(yī)院 急診醫(yī)學科， 武漢 430022)

氯胺酮相關性膀胱炎大鼠逼尿肌熱休克蛋白27的表達及其意義

林 黎， 王智超， 朱保平*

(武漢市第一醫(yī)院 急診醫(yī)學科， 武漢 430022)

研究熱休克蛋白27(HSP27)在氯胺酮誘導膀胱炎大鼠逼尿肌中的表達及臨床意義.基于氯胺酮腹腔內注射誘導大鼠膀胱炎模型，選擇不同時間通過尿流動力學檢測膀胱收縮功能，收集大鼠膀胱組織，常規(guī)病理染色觀察膀胱粘膜及逼尿肌結構，免疫組化法檢測HSP27在逼尿肌中的表達水平.實驗后觀察結果表明，同對照組相比，實驗組尿動力學表現(xiàn)為膀胱收縮頻率顯著增加及初感膀胱容量明顯減??；對照組膀胱組織無明顯病理及免疫表達變化，而實驗組可觀察到不同程度膀胱粘膜充血，炎癥細胞浸潤，HSP27表達水平的上升，且HSP27表達水平與誘導時間呈正相關.實驗結果表明HSP27的表達水平可能與氯胺酮膀胱炎的逼尿肌收縮活動程度相關.

氯胺酮； 熱休克蛋白27； 大鼠

近年來，一種名為K粉(street ketamine)的新型毒品多見于夜店及年輕人派對上，其主要成分為氯胺酮(ketamine).研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮長期大量濫用后會產生許多神經，心血管的不良反應，在隨后的臨床報道中又發(fā)現(xiàn)其對于泌尿系統(tǒng)有著嚴重的損害作用.近年來氯胺酮相關性泌尿系損害逐漸被人們所重視，并且進行了許多動物模型及流行病學研究[1].而在泌尿系統(tǒng)損害中，尤其以膀胱逼尿肌的損害及其相關癥狀較為常見和突出[2].王朝陽等[3]總結治療的26名患者表明氯胺酮依賴者實際濫用超過1 a，大約40%會出現(xiàn)下尿路癥狀(LUTS)，包括尿頻尿急尿痛，排尿困難，會陰或恥骨上疼痛，急迫性尿失禁，甚至出現(xiàn)肉眼血尿.而濫用劑量超過5 g/d，則出現(xiàn)下尿路癥狀比例升高為100%.濫用時間更長者，可進一步出現(xiàn)實質性器官損害，包括不可逆性膀胱攣縮，尿路纖維化，腎小球功能損傷.下尿路癥狀的突出表現(xiàn)與膀胱逼尿肌的病理性改變有著密切的聯(lián)系，包括逼尿肌細胞的凋亡和收縮功能的改變等[4-5].在以往的研究中發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27(HSP27)作為小熱休克蛋白家族之一，廣泛表達于各種平滑肌細胞中，對穩(wěn)定肌細胞結構及調節(jié)平滑肌收縮中發(fā)揮了一定的作用[6].熊智勇等[7]通過實驗發(fā)現(xiàn)對HSP27基因進行低表達干擾后能引起肌動蛋白收縮功能下降，其原因可能為骨架結構發(fā)生變化.閆書賢等[8]研究發(fā)現(xiàn)HSP27上調可能與尿路梗阻導致的逼尿肌收縮應激保護作用有一定的聯(lián)系.本研究擬通過氯胺酮誘導膀胱炎大鼠模型，采用尿動力學檢查、病理及免疫組織化學技術結合圖像分析檢測膀胱逼尿肌組織中熱休克蛋白27的表達情況，進而希望能進一步揭示氯胺酮對于膀胱逼尿肌損傷的影響及相關機制，為臨床治療提供參考.

1 材料與方法

1.1 建立氯胺酮膀胱炎大鼠模型

實驗材料為清潔級健康雌性SD大鼠40只，購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，周齡12 w，體質量 200～250 g.隨機分為4組，每組10只，A組為對照組，B組為8 w實驗組，C組為9 w實驗組，D組為10 w實驗組.按照Meng方法[4]改良建立氯胺酮相關性膀胱炎大鼠模型，實驗組與對照組分別于腹腔注射鹽酸氯胺酮注射液(60 mg·kg-1·d-1)與容積生理鹽水，持續(xù)注射8 w.鹽酸氯胺酮注射液購自武漢久安藥業(yè)有限公司，生理鹽水取自武漢市第一醫(yī)院藥劑科.使用膠體金法檢測大鼠尿中高濃度的氯胺酮及其代謝產物殘留，證實模型誘導成功.建模成功后繼續(xù)腹腔灌注氯胺酮，分別于第9 w、第10 w尿流動力學檢測后處死大鼠，取新鮮膀胱組織，分同等2份，10%福爾馬林溶液(取自武漢市第一醫(yī)院病理科)固定后，制備石蠟切片，常規(guī)固定脫水透明，包埋切片，用于常規(guī)HE染色和免疫組化染色.

1.2 尿動力學檢測

使用腹腔注射淺表麻醉大鼠，固定大鼠后將自制頭端開有側孔的1 mm輸尿管導管經尿道口插入膀胱，后端通過軟管接三通，三通管一端接微量泵，另一端接測壓管連接換能器.檢測指標包括：1) 初感膀胱容量：向膀胱內灌注生理鹽水到開始排尿的最小容量；2) 膀胱排尿壓：剛好促發(fā)并引起排尿的最大膀胱壓.

1.3 常規(guī)病理染色

組織切片蘇木精—伊紅(HE)染色，光鏡下觀察膀胱尿路上皮及逼尿肌細胞的形態(tài)變化和炎性細胞浸潤情況.

1.4 免疫組化染色(IHC staning)

采用SP法，SP試劑盒購自武漢市博士德生物工程有限公司，操作過程均按試劑盒說明進行，一抗為鼠抗人HSP27單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶(HRP).使用HSP27顯著表達的陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗為空白對照.HSP27的陽性表達物質彌漫性分布于胞質中，呈棕黃色顆粒狀.在實驗組玻片中隨機選取10個視野，用酶聯(lián)儀(武漢大學基礎醫(yī)學院租用)在450 nm波長測量隨機視野吸光度，測得結果進行比較.

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件分析所得數(shù)據(jù)，以mean+SD形式表示相關計量資料數(shù)據(jù)，實驗計量資料滿足正態(tài)和方差齊性，多組間采用反差分析，兩組間比較采用t檢驗.P< 0.05為有顯著統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 氯胺酮膀胱炎模型大鼠尿動力學改變

按1.1所述方法對氯胺酮處理組不同時間點的膀胱炎模型大鼠進行尿動力學檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，初感排尿容量在8 w，9 w，10 w時均顯著減少(圖1)，具體數(shù)值如表1所示；同時，氯胺酮處理組大鼠的膀胱排尿壓在上述3個時間點也顯著減小(圖2)，具體數(shù)值如表2所示.上述結果表明，氯胺酮處理對膀胱炎大鼠排尿具有促進作用.

圖1 氯胺酮處理后膀胱炎模型大鼠不同時間初感排尿容量變化Fig.1 Change of bladder capacity of first sensation at different time after ketamine treatment

表1 氯胺酮處理后膀胱炎模型大鼠不同時間初感排尿容量數(shù)值Tab.1 Bladder capacity of first sensation at different time after ketamine treatment mL

注：數(shù)值為x±s形式，n=10，B、C、D三組中實驗組相較于對照組均有P<0.05.

圖2 氯胺酮處理后膀胱炎模型大鼠不同時間膀胱排尿壓變化Fig.2 Change of vesical micturition pressure at different time after ketamine treatment

表2 氯胺酮處理后膀胱炎模型大鼠不同時間膀胱排尿壓力值Tab.2 Change of vesical micturition pressure at different time after ketamine treatment mmH2O

注：數(shù)值為x±s形式，n=10，B、C、D三組中實驗組相較于對照組均有P< 0.05.

2.2 氯胺酮處理后大鼠膀胱組織鏡下病理改變

通過常規(guī)HE染色可見，對照組炎性細胞少量或基本正常，而建模成功后的氯胺酮性膀胱炎大鼠膀胱尿路上皮細胞層數(shù)明顯減少，部分缺失，大量炎性細胞及淋巴細胞浸潤，圖中較為紫色深染的為多核細胞；大鼠膀胱粘膜層和肌層之間還可見纖維組織增生和膠原沉積(圖3).

圖3 膀胱炎模型大鼠第9 w膀胱組織HE染色結果(放大100倍)Fig.3 HE staining results of bladder tissue of 9 w rat model

2.3 膀胱組織HSP27表達檢測(放大100倍)

對第10 w的4組大鼠膀胱組織進行免疫組化染色，檢測其中HSP27的表達.結果發(fā)現(xiàn)，對照組A中，HSP幾乎無明顯表達，HSP陽性表達物質棕色顆粒極少可見；氯胺酮處理組中則均可見HSP棕色表達顆粒(圖4).具體統(tǒng)計數(shù)值，表明實驗組HSP27表達明顯增高，棕色顆粒色度表達與吸光度數(shù)值呈正比(表3).上述結果顯示HSP27表達水平同灌注氯胺酮時間有相關性.

圖4 膀胱炎模型大鼠第10 w膀胱組織中HSP27的表達情況(放大100倍)Fig.4 HSP27 express in bladder tissue of 10 w rat model

表3 HSP27免疫組化染色結果統(tǒng)計值Tab.3 Statistical results of HSP27 expression level determined by IHC staining

注：數(shù)值為HSP27/β-actin，x±s形式，n=10，B、C、D三組中實驗組相較于對照組均有P< 0.05.

3 討論

氯胺酮于1962年由美國藥劑師Calvinstevens首次以苯環(huán)已哌啶(N-1-pheny-cyclohexy-piperidine，PCP)的衍生物形式成功研制[9].氯胺酮作為非巴比妥類藥物，在臨床上主要作為麻醉藥物使用.由于它有一定的致幻作用，故被某些娛樂場所作為致幻劑濫用.根據(jù)安麗娜等[10]對廣州戒毒醫(yī)院調查分析，首次吸食氯胺酮者年齡主要集中在19歲左右，其中25歲的青少年男性比例達到90%以上.藍曉嫦等研究表明氯胺酮可導致吸食者體內多種性激素包括睪酮(TEST)、雌二醇(E2)等血清水平明顯升高，故可提高性欲，在一定程度上增強性能力[11].氯胺酮在肝臟的首過效應比較明顯，故濫用時吸食方式多以鼻吸，肌肉注射及靜脈注射為主.相對于傳統(tǒng)毒品，氯胺酮身體成癮性較低，主要成癮性表現(xiàn)為精神上的致幻及興奮，除此以外還可引起心血管、神經及消化系統(tǒng)損害，近年來又發(fā)現(xiàn)還具有泌尿系損害副作用[2].2007年首次報道了由氯胺酮所導致的泌尿系損害癥狀[12]，即在吸食后出現(xiàn)尿頻尿急血尿等類似間質性膀胱炎癥狀[9].隨著相關病例及報道逐漸增多，氯胺酮相關性泌尿系損傷也被人們重視及關注.銀佑樂等[13]研究顯示在氯胺酮的長期作用下，可引起腎小球炎癥細胞大量浸潤，腎小管水腫及空泡樣改變，多處小管壞死，最終可引起腎小球萎縮，甚至閉鎖，同時腎間質中膠原纖維沉積，形成纖維條索.目前，尚未有明確證據(jù)反映氯胺酮引起泌尿系統(tǒng)損害的機制，但氯胺酮吸食者的尿液中可檢測出高濃度的氯胺酮及代謝物，多數(shù)學者認為尿液中氯胺酮及其代謝物是引起損害的主要物質.這些物質可導致整個尿路上皮的慢性炎性改變，凋亡，使尿路上皮缺失、纖維化，從而進一步損害膀胱肌層，產生肌層的纖維化，引起結構破壞及功能喪失[9，14-15].而膀胱逼尿肌收縮功能的下降，纖維化增生將最終導致膀胱壁增厚，膀胱攣縮，容量減小，使膀胱失去正常的排尿功能.人熱休克蛋白27由205 aa組成，于平滑肌細胞中廣泛表達，以分子伴侶蛋白形式調節(jié)平滑肌收縮，對細胞生存具有重要影響[16-18].HSP27常以大分子復合物存在于平滑肌中，包括單體和多聚體[19]. BATTS[20]等發(fā)現(xiàn)膀胱組織中有熱休克蛋白家族成員HSP20表達.而XIONG[21]，閆書賢[8]等報道在急性尿潴留大鼠模型膀胱逼尿肌中，HSP27和HSP20顯著表達，并且HSP的表達變化與大鼠膀胱收縮功能變化相關.本實驗通過腹腔注射建立氯胺酮相關性膀胱損害大鼠模型，以注射后8周檢測到大鼠尿液中含有氯胺酮及代謝物為成功建立模型的標志[22-23].利用大鼠模型研究由氯胺酮導致的膀胱尿流動力學改變及病理學變化，以及HSP27在膀胱逼尿肌組織中的表達變化.結果顯示較對照組大鼠腹腔注射氯胺酮均后出現(xiàn)初感排尿容量的下降、排尿前膀胱壓的增加及儲尿期收縮頻率的增加，這些尿流動力學表現(xiàn)同人類吸食氯胺酮后引起的下尿路癥狀類似.同時通過對膀胱組織不同時段HSP27檢測，發(fā)現(xiàn)注射氯胺酮后大鼠膀胱逼尿肌中HSP27表達水平有隨時間升高的趨勢，同尿流動力學中膀胱收縮性呈正相關.因此推測，氯胺酮成功誘導膀胱炎后可引起急性期膀胱逼尿肌收縮頻率增加，肌細胞中的HSP27水平相應上升，而且呈時間相關性.HSP27水平一定程度的上調可能早期對于逼尿肌有一定的保護及代償作用，但同時也可以作為逼尿肌功能受到損害的表現(xiàn)，進一步研究HSP27上調水平的曲線，有助于了解逼尿肌功能失代償?shù)臋C制，為臨床治療提供新的參考.

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Expressionsandsignificancesofheatshockprotein27indetrusortissueofratswithketamine-associatedcystitis

LIN Li， WANG Zhichao， ZHU Baoping

(Wuhan NO.1 Hospital， Wuhan 430022)

To investigate the expression of heat shock protein 27(HSP27) in detrusor tissue of rats with ketamine and clinical significance. Rats were injected intraperitoneal with ketamine to establish the cystitis model. Through urodynamic detection the function of bladder contraction was studied， and then urinary bladders of the rats were harvested for routine pathological staining to analysis bladder mucosa and detrusor structure. HSP27 expression level in detrusor tissue at different time point was detected by immunohistochemical (IHC) staining. In comparison to the control group， urodynamic change of ketamine treated group showed significantly increased frequency of bladder contraction and reduced bladder capacity of first sensation; there is no significant change on pathological and immune expression in the control group， while it was observed in the experimental group with different degree of bladder mucosal hyperemia， inflammatory cells infiltration and elevated HSP27 expression levels; additionally， HSP27 expression level was positively correlated with the induction time. These results suggested that the expression levels of HSP27 might have a correlation with the degree of detrusor contraction activities of ketamine-associated cystitis．

ketamine; heat shock protein 27; rats

R694+.3

A

2017-05-21.

湖北省自然科學基金項目(2012FFA094).

*通訊聯(lián)系人. E-mail: 130719170@126.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.05.015

1000-1190(2017)05-0646-05