王建國 ，史春云 ，丑廣程 ，陳占良 ，馮惠清 ，王淑仙

（1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，河北 保定 071000；2.河北省保定市兒童醫(yī)院 內(nèi)三科，河北 保定 071051）

新進展研究·論著

Graves病患者血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17相關(guān)細胞因子表達變化及意義

王建國1，史春云2，丑廣程1，陳占良1，馮惠清1，王淑仙1

（1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，河北 保定 071000；2.河北省保定市兒童醫(yī)院 內(nèi)三科，河北 保定 071051）

目的探討Graves病患者血清Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）和調(diào)節(jié)性T細胞/輔助性T細胞17（Treg/Th17）相關(guān)細胞因子表達變化及意義。方法選取62例初步確診為Graves病的患者和45例健康者（對照組），采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清中促甲狀腺素（TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）和促甲狀腺素受體抗體（TRAb）水平，利用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）對血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-10、IL-6和IL-17水平進行檢測。結(jié)果Graves病患者血清TSH水平低于對照組，而血清FT3、FT4和TRAb水平則高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Graves病患者血清TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平均高于對照組，而TGF-β1水平則低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Pearson相關(guān)分析顯示，Graves病患者血清 TSH 與 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和 IL-17均呈負相關(guān)（P＜0.05），而與 TGF-β1呈正相關(guān)（P＜0.05），血清 FT3和 FT4均與 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和 IL-17呈正相關(guān)（P＜0.05），而與TGF-β1呈負相關(guān)（P＜0.05）；Graves病患者血清TLR4與NF-κB呈正相關(guān)（P＜0.05），且與IL-10、IL-6和IL-17呈正相關(guān)（P＜0.05），而與TGF-β1呈負相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論Graves病患者血清TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平升高，而TGF-β1水平降低，NF-κB信號通路激活和Treg/Th17平衡失調(diào)可能共同參與Graves病發(fā)病過程。

Graves病；Toll樣受體4；核因子-κB；調(diào)節(jié)性T細胞/輔助性T細胞17；細胞因子

Graves病作為臨床常見病和多發(fā)病，是一種器官特異性免疫性疾病，約80%～86%的甲狀腺功能亢進癥（甲亢）是由該病引起，并可導(dǎo)致多器官損害[1]，該病發(fā)病年齡不具有特異性，且近年來發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響患者生存質(zhì)量[2]。目前，該病發(fā)生機制尚未完全清楚，有研究指出[3]，細胞免疫功能紊亂與Graves病發(fā)生及進展密切相關(guān)。而免疫細胞發(fā)揮作用則主要是通過相關(guān)細胞因子發(fā)揮作用[4]，有研究指出[5]，Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）、核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路在自身免疫性疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性 T 細胞（CD4+，CD25+regulatory T cells，Treg）/輔助性 T 細胞 17（T helper cell 17，Th17）作為新近發(fā)現(xiàn)的CD4+細胞重要的亞群，其平衡在免疫調(diào)節(jié)及與免疫相關(guān)疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[6]。本研究擬對初診Graves病患者血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17相關(guān)細胞因子表達水平進行分析，探討該病發(fā)病中的意義，以期為臨床實踐提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月-2016年8月在本院確診為Graves病的患者62例。其中，男性22例，女性40例；平均年齡（38.7±10.6）歲。病例納入標準：①均符合《中國甲狀腺疾病診治指南》[7]；②年齡19～65歲；③均未接受過Graves病相關(guān)治療。排除標準：①既往糖尿病史、肝功能異常和血液系統(tǒng)疾病者；②合并其他自身免疫系統(tǒng)疾病者；③急慢性感染、惡性腫瘤、妊娠和過敏性疾病，以及近30 d內(nèi)使用過糖皮質(zhì)疾病者。同期，從醫(yī)院體檢中心選取健康者45例作為對照組，均排除甲狀腺疾病和家族史者、自身免疫性疾病者和使用免疫抑制劑者。其中，男性17例，女性28例；平均年齡（39.4±11.2）歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對象均抽取晨起空腹靜脈血 6 ml，＜30 min 于 3 000 r/min 離心 15 min，留取血清，置于-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2.2 實驗室檢測 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清中甲狀腺激素[促甲狀腺素（thyrotropin，TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（free tetraiodothyronine，F(xiàn)T4）和促甲狀腺素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）]水平，利用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）對血清中TLR4、NF-κB、人轉(zhuǎn)化生長因子β1（human transforming growth factor beta1，TGF-β1）、白細胞介素 10（interleukin，IL-10）、IL-6 和 IL-17 水平進行檢測，試劑盒購自上海酶遠生物公司，所有操作均按照試劑盒說明書在標準實驗室內(nèi)完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關(guān)分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料和甲狀腺功能

Graves病患者和對照組在性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Graves病患者血清TSH水平低于對照組，而血清FT3、FT4和TRAb水平則高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組血清 TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-10、IL-6和IL-17水平

Graves病患者血清 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平均高于對照組，而TGF-β1水平則低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 甲狀腺功能與血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，Graves病患者血清TSH與 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6 和 IL-17 均呈負相關(guān)（P＜0.05），而與 TGF-β1呈正相關(guān)（P＜0.05）；血清FT3和 FT4均與 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6 和 IL-17呈正相關(guān)（P＜0.05），而與 TGF-β1呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表 3。

2.4 Graves病患者血清TLR4、NF-κB與Treg/Th17相關(guān)細胞因子的相關(guān)性

Graves病患者血清TLR4與NF-κB呈正相關(guān)（P＜0.05），且均與IL-10、IL-6和IL-17呈正相關(guān)（P＜0.05），而與 TGF-β1呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表 4。

表1 兩組一般資料和甲狀腺功能比較

表2 兩組血清 TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-10、IL-6和 IL-17比較

表3 甲狀腺功能與血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17的相關(guān)性

表4 Graves病患者血清TLR4、NF-κB與Treg/Th17相關(guān)細胞因子的相關(guān)性

3 討論

Graves病發(fā)病較為復(fù)雜，是環(huán)境、遺傳和自身免疫功能紊亂等多種因素導(dǎo)致的甲狀腺發(fā)生特異性自身免疫反應(yīng)，出現(xiàn)彌漫性甲狀腺腫，甲狀腺功能亢進[8]。本研究對初次確診而未治療的Graves病患者甲狀腺功能檢測發(fā)現(xiàn)，Graves病患者血清TSH水平低于對照組，而血清FT3、FT4和TRAb水平則高于對照組，說明Graves病患者出現(xiàn)甲狀腺功能紊亂，且血清中出現(xiàn)TRAb等自身抗體，提示免疫功能異常參與Graves病發(fā)病過程。

TLR4作為Ⅰ型跨膜糖蛋白，可與相應(yīng)的受體結(jié)合，在下游信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，參與細菌感染及自身免疫性疾病的發(fā)生[9]。有研究指出[10]，TLR4引發(fā)的胞內(nèi)信號通路可導(dǎo)致NF-κB活化，激活炎癥轉(zhuǎn)錄程序，進而大量釋放細胞炎癥因子，產(chǎn)生級聯(lián)炎癥反應(yīng)。NF-κB幾乎在所有類型細胞及組織中均存在，在多種炎癥反應(yīng)信號通路中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子[11]。本研究顯示，Graves病患者血清TLR4、NF-κB水平均高于對照組，說明TLR4/NF-κB可能參與Graves病發(fā)病過程，相關(guān)分析亦顯示，Graves病患者血清TLR4與NF-κB呈正相關(guān)，血清TSH與TLR4、NF-κB均呈負相關(guān)血清FT3和FT4均與TLR4、NF-κB呈正相關(guān)，進一步說明TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與Graves病發(fā)病及進展過程。

Treg作為維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要細胞，可通過細胞接觸或分泌如TGF-β、IL-10等相關(guān)細胞因子，而在負性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、維持免疫耐受及防止自身免疫發(fā)生中發(fā)揮重要作用[12]，Th17作為CD4+T細胞中不同于Th1、Th2的細胞亞群，可被TGF-β等誘導(dǎo)分化，同時被IL-6增強，可通過產(chǎn)生IL-17而參與感染性疾病及免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生[13]。研究表明[14]，Treg/Th17動態(tài)平衡維持免疫功能的穩(wěn)定。本研究顯示，Graves病患者血清IL-10、IL-6和IL-17水平均高于對照組，而TGF-β1水平則低于對照組，間接反映出Graves病患者Treg/Th17動態(tài)平衡可能被打破，出現(xiàn)自身免疫抑制功能下降，但血清中IL-10水平未降低反而升高，筆者分析，可能是Treg雖可分泌IL-10，但并非IL-10的唯一來源，Th2及Th9細胞亦可以分泌IL-10[15]，從而導(dǎo)致血清中IL-10水平不升反降。Pearson相關(guān)分析顯示，Graves病患者血清TSH與IL-10、IL-6和IL-17均呈負相關(guān)，而與TGF-β1呈正相關(guān)，血清 FT3和 FT4均與 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6 和IL-17呈正相關(guān)，而與TGF-β1呈負相關(guān)，進一步說明了Treg/Th17分泌的細胞因子參與Graves病發(fā)病過程，可能與Graves病病程進程密切相關(guān)。有研究指出[16]，IL-17和NF-κB信號通路相互關(guān)系，IL-17可激活NF-κB信號通路而誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。有研究指出[17]，Th17/IL-23通路是經(jīng)由NF-κB而參與銀屑病致病。本研究相關(guān)分析顯示，Graves病患者血清TLR4與NF-κB呈正相關(guān)，且均與IL-10、IL-6和IL-17呈正相關(guān)，而與TGF-β1呈負相關(guān)，說明TLR4/NF-κB信號通路參與Graves病發(fā)病過程，同時Treg/Th17產(chǎn)生的相關(guān)細胞因子亦可能通過NF-κB信號通路而參與Graves病發(fā)病，但具體作用機制尚待進一步研究明確。

綜上所述，Graves病患者血清 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平升高，而TGF-β1水平降低，NF-κB信號通路激活和Treg/Th17平衡失調(diào)可能共同參與Graves病發(fā)病過程，但具體相互作用機制有待進一步明確。

[1]WANG L,WANG B,CHEN S R,et al.Effect of selenium supplementation on recurrent hyperthyroidism caused by Graves'disease:a prospective pilot study[J].Horm Metab Res,2016,48(9):559-564.

[2]HIROMATSU Y,EGUCHI H,TANI J,et al.Graves'ophthalmopathy:epidemiology and natural history[J].Intern Med,2014,53(5):353-360.

[3]BURCH H B,COOPER D S.Management of Graves disease:A review[J].JAMA,2015,314(23):2544-2554.

[4]QUISPEL W T,STEGEHUIS-KAMP J A,SANTOS S J,et al.Activated conventional T-cells are present in langerhans cell histiocytosis lesions despite the presence of immune suppressive cytokines[J].J Interferon Cytokine Res,2015,35(10):831-839.

[5]SHEN W,GAO Y,LU B,et al.Negatively regulating TLR4/NF-κB signaling via PPARα in endotoxin-induced uveitis[J].Biochim Biophys Acta,2014,1842(7):1109-1120.

[6]BARBIJ,PARDOLL D,PAN F.Metaboliccontrolofthe Treg/Th17 axis[J].Immunol Rev,2013,252(1):52-77.

[7]單忠艷.《中國甲狀腺疾病診治指南》導(dǎo)讀[J].中國實用內(nèi)科雜志,2008,28(4):260-261.

[8]LI H X,XIANG N,HU W K,et al.Relation between therapy options for Graves'disease and the course of Graves'ophthalmopathy:a systematic review and meta-analysis[J].J Endocrinol Invest,2016,39(11):1225-1233.

[9]LIU Y,YIN H,ZHAO M,et al.TLR2 and TLR4 in autoimmune diseases:a comprehensive review[J].Clin Rev Allergy Immunol,2014,47(2):136-147.

[10]BARTUZI P,HOFKER M H,van de SLUIS B.Tuning NF-κB activity:a touch of COMMD proteins[J].Biochim Biophys Acta,2013,1832(12):2315-2321.

[11]PANDAY A,INDA M E,BAGAM P,et al.Transcription factor NF-κB:an update on intervention strategies[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2016,64(6):463-483.

[12]CAPRARA C,KINSEY G R,CORRADI V,et al.The influence of hemodialysis on T regulatory cells:a meta-analysis and systematic review[J].Blood Purif,2016,42(4):307-313.

[13]SMITH J A,COLBERT R A.Review:the interleukin-23/interleukin-17 axis in spondyloarthritis pathogenesis:Th17 and beyond[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(2):231-241.

[14]KUMAR P,SUBRAMANIYAM G.Molecular underpinnings of Th17 immune-regulation and their implications in autoimmune diabetes[J].Cytokine,2015,71(2):366-376.

[15]SIMONOVIC S Z,MIHALJEVIC O,MAJSTOROVIC I,et al.Cytokine production in peripheral blood cells of patients with differentiated thyroid cancer:elevated Th2/Th9 cytokine production before and reduced Th2 cytokine production after radioactive iodine therapy[J].Cancer Immunol Immunother,2015,64(1):75-82.

[16]郭江燕,高梓珊,姜姝姝,等.IL-17和NF-κB通路與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2015,31(1):192-194.

[17]徐可佳.銀屑病全基因組關(guān)聯(lián)的易感基因和信號通路的研究進展[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(26):3725-3727.

Involvement of circulating TLR4,NF-κB and Treg/Th17 related cytokines in Graves'disease

Jian-guo Wang1,Chun-yun Shi2,Guang-cheng Chou1,Zhan-liang Chen1,Hui-qing Feng1,Shu-xian Wang1
(1.Department of Laboratory,Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;2.Department of Children's Internal Medicine,Baoding Children's Hospital,Baoding,Hebei 071051,China)

ObjectiveTo investigate the concentration of Toll-like receptor 4 (TLR4),nuclear factor κB(NF-κB)and regulatory T cells (Treg)/T helper cell 17 (Th17)related cytokines in patients with Graves'disease and their potential correlations.MethodsA total of 62 patients initially diagnosed with Graves'disease and 45 healthy volunteers were involved in this study.The serum levels of thyroid stimulating hormone(TSH),free triiodothyronine(FT3),free tetraiodothyronine(FT4)and thyrotropin receptor antibody(TRAb)were measured by Electrochemiluminescence.The serum levels of TLR4,NF-κB,transforming growth factor β(TGF-β),interleukin 10(IL-10),interleukin 6(IL-6)and interleukin 17(IL-17)were measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe serum levels of TSH in patients were increased while FT3,FT4and TRAb were decreased significantly when compared with those in volunteers (P＜0.05).Bloodconcentration of TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17 in patients was upregulated while concentration of TGF-β1was downregulated in comparison with the healthy control group (P ＜ 0.05).Pearson correlation analysis showed that TSH was negatively correlated with TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17 (P ＜ 0.05),but positively correlated with TGF-β1(P ＜ 0.05).FT3and FT4 were positively correlated with TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17,but negatively correlated with TGF-β1(P＜0.05).TLR4 was positively correlated with NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17(P＜0.05),but negatively correlated with TGF-β1(P＜0.05).ConclusionsThe serum levels of TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17 in patients with Graves'disease are increased while level of TGF-β1is decreased.Activation of NF-κB signaling pathway and Treg/Th17 imbalance might be involved in the pathogenesis of Graves'disease.

Graves'disease;toll-like receptor 4;nuclear factor kappa B;CD4+,CD25+regulatory T cells/T helper cell 17;cytokines

R581.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.012

1005-8982（2017）24-0058-04

2017-02-20

王淑仙，E-mail：402767260@qq.com；Tel：13111666605

（唐勇 編輯）