李小靜 李志鋒 李顯平 劉保國(guó) 劉志軍

056002河北邯鄲，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

·論著·

丹參酮ⅡA對(duì)黑素瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的抑制作用及機(jī)制

李小靜 李志鋒 李顯平 劉保國(guó) 劉志軍

056002河北邯鄲，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

目的 探討丹參酮ⅡA對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及趨化因子受體7（CXCR7）基因與蛋白表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)黑素瘤A375細(xì)胞，經(jīng)1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA處理48 h后，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定細(xì)胞遷移和侵襲能力，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡分別檢測(cè)A375細(xì)胞CXCR7 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA處理A375細(xì)胞48 h后，Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，每高倍（×200）視野下遷移穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)分別為71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61，而細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞遷移數(shù)分別為301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00，均顯著低于對(duì)照組（105.33±6.51、332.00±6.24，均P＜0.05），且丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞侵襲、遷移能力的抑制作用隨丹參酮ⅡA濃度的升高而增強(qiáng)（均P＜0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western印跡顯示，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組CXCR7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01，蛋白表達(dá)水平分別為0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055，均顯著低于對(duì)照組（1.00±0.02、0.9000±0.010，均P＜0.05），且丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞CXCR7 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制能力隨丹參酮ⅡA濃度的升高而增強(qiáng)（均P＜0.05）。結(jié)論 丹參酮ⅡA可通過(guò)下調(diào)CXCR7表達(dá)抑制黑素瘤A375細(xì)胞的侵襲遷移能力。

黑色素瘤；丹參酮；受體，CCR7；細(xì)胞遷移分析；A375細(xì)胞

黑素瘤惡性程度高，極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，因此臨床上將抑制黑素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移作為其重要的治療手段。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的化合物，在殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)其分化與凋亡等方面發(fā)揮抑癌作用［1］。目前，丹參酮ⅡA對(duì)皮膚黑素瘤的作用仍不清楚。本研究旨在體外觀察丹參酮ⅡA對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞侵襲、遷移的影響，并檢測(cè)其對(duì)趨化因子受體7（CXCR7）表達(dá)的影響，以探討其抗腫瘤機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

兔抗人CXCR7多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），Transwell小室（美國(guó)Corning公司），Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（美國(guó)Promega公司），丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），采用含10%胎牛血清的高糖Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

2.丹參酮ⅡA溶液的配制：取丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品20 mg溶于2 ml二甲基亞砜中，充分溶解配制10 g∕L丹參酮ⅡA儲(chǔ)存液，以每管10 μl分裝于1.5 ml尖底離心管中，封口膜及錫紙封閉，儲(chǔ)存于-20℃。以預(yù)溫的含10%胎牛血清的DMEM稀釋10 g∕L丹參酮ⅡA儲(chǔ)存液1 000倍以上配制不同濃度的丹參酮ⅡA工作液，以使工作液中二甲基亞砜的濃度不超過(guò)0.1%，即丹參酮ⅡA工作液最高濃度不超過(guò)10 mg∕L。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)A375細(xì)胞CXCR7 mRNA的表達(dá)水平：分別采用1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA處理A375細(xì)胞48 h，對(duì)照組加入含0.1%二甲基亞砜的DMEM。用Trizol試劑分別提取各組總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的濃度及純度，A260∕A280吸光度比值在1.9～2.1為合格。各組取大致相等量的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在基因庫(kù)上查找CXCR7基因全系列后，CXCR7引物由Primer zpremier 5.0軟件設(shè)計(jì)，用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序排除其他的可能同源序列，然后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。CXCR7上游引物5′?TTCGTCATCGGCATGATTGC?3′，下游引物5′?AGTGCGTGTCATAGCCTGTG?3′，目的產(chǎn)物79 bp。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；最后72℃再延伸10 min。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線獲取目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，目的基因CXCR7的相對(duì)表達(dá)量采用2?△△Ct計(jì)算，△△Ct=（Ct實(shí)驗(yàn)-Ct參比）-（Ct對(duì)照-Ct參比）。

4.Western印跡檢測(cè)A375細(xì)胞CXCR7蛋白的表達(dá)：分別采用1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA處理A375細(xì)胞48 h，對(duì)照組加入含0.1%二甲基亞砜的DMEM。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞后，加入預(yù)冷的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，收集上清液，提取各組細(xì)胞總蛋白，Broadford法測(cè)定蛋白含量。取70 μg蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）垂直電泳，分別加入一抗（CXCR7），用封閉液1∶400稀釋、二抗（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗體，1∶5 000稀釋?zhuān)?，X線曝光、顯影及定影，用各抗體灰度值與3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）灰度值的比值代表各檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。每組樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取均值。

5.Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞侵襲能力：在Transwell小室的多聚碳酸酯膜上鋪人工基底膜膠，制成人工基底膜。分別用1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA處理A375細(xì)胞48 h，胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，以無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為0.6×106∕ml。將Transwell小室置入24孔板中，在小室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫放置2 h后，在小室外部加入含10%血清的培養(yǎng)基500 μl，棄去小室內(nèi)部的無(wú)血清培養(yǎng)基，加入300 μl細(xì)胞懸液，孵育48 h后染色20 min，干燥后顯微鏡高倍（×200）視野下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

6.細(xì)胞劃痕法測(cè)定丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞遷移能力：分別采用1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA處理A375細(xì)胞48 h，用10 μl移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后換成含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育24 h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，在高倍鏡（×200）下計(jì)數(shù)遷移到劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)目。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，作方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析和SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

處理A375細(xì)胞48 h后，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組及對(duì)照組每高倍（×200）視野下遷移穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)分別為71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61及105.33±6.51，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=140.075，P＜0.001）。SNK檢驗(yàn)顯示，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組遷移細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05），且丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞侵襲能力的抑制作用隨丹參酮ⅡA濃度的升高而增強(qiáng)（均P＜0.05）。

二、Western印跡法結(jié)果

丹參酮ⅡA處理48 h后，單層細(xì)胞劃痕24 h后，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組及對(duì)照組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為301.00±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00及332.00±6.24，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 897.236，P＜0.001）。SNK檢驗(yàn)顯示，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組細(xì)胞遷移數(shù)均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05），且丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞遷移能力的抑制作用隨丹參酮ⅡA濃度的升高而增強(qiáng)（均P＜0.05）。

三、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

處理A375細(xì)胞48 h后，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組及對(duì)照組CXCR7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01及1.00±0.02，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=432.445，P＜0.001）。SNK檢驗(yàn)顯示，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組CXCR7 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05），且丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞CXCR7 mRNA表達(dá)的抑制能力隨丹參酮ⅡA濃度的升高而增強(qiáng)（均P＜0.05）。

四、細(xì)胞劃痕法測(cè)定結(jié)果

處理A375細(xì)胞48 h后，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組及對(duì)照組CXCR7蛋白表達(dá)量分別為0.573± 0.015、0.416±0.011、0.260±0.055及0.900±0.010，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=251.548，P＜0.001），見(jiàn)圖1。SNK檢驗(yàn)顯示，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA組CXCR7蛋白表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.05），且丹參酮ⅡA對(duì)A375細(xì)胞CXCR7蛋白表達(dá)的抑制能力隨丹參酮ⅡA濃度的升高而增強(qiáng)（均P＜0.05）。

圖1 Western印跡檢測(cè)不同濃度丹參酮ⅡA處理A375細(xì)胞后CXCR7蛋白表達(dá)的變化 1：對(duì)照組；2：1 mg∕L丹參酮ⅡA組；3：2 mg∕L丹參酮ⅡA組；4：4 mg∕L丹參酮ⅡA組。CXCR7：趨化因子受體7；GAPDH：3磷酸甘油醛脫氫酶

討論

惡性黑素瘤是一種惡性程度較高的皮膚腫瘤，早期黑素瘤可手術(shù)切除，但由于其轉(zhuǎn)移率高，對(duì)目前治療方案不敏感，若發(fā)生轉(zhuǎn)移則預(yù)后極差。丹參酮ⅡA是唇形科鼠尾草屬植物丹參干燥根莖的脂溶性活性成分，多項(xiàng)體外研究均證實(shí)其對(duì)多種血液系統(tǒng)腫瘤及實(shí)體瘤有殺傷作用，包括食道癌［1］、膀胱癌［2］、非小細(xì)胞肺癌［3］、肝癌［4］等，作用機(jī)制主要為抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。丹參酮ⅡA可通過(guò)抑制環(huán)氧合酶2（COX?2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和血管生成［5］，還可通過(guò)mTOR∕p70S6K∕RPS6∕4E?BP1信號(hào)通路下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子?1α（HIF?1α）和VEGF的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和血管生成［6］。體外實(shí)驗(yàn)顯示［7］，丹參酮ⅡA可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲。為進(jìn)一步證實(shí)丹參酮ⅡA對(duì)黑素瘤細(xì)胞的體外抑制作用，本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)研究丹參酮ⅡA對(duì)黑素瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。結(jié)果顯示，1、2、4 mg∕L丹參酮ⅡA作用黑素瘤A375細(xì)胞48 h后，隨丹參酮ⅡA濃度的增加，對(duì)黑素瘤細(xì)胞侵襲及遷移的抑制能力增強(qiáng)。

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程相似，其中趨化因子及其受體為腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移提供了有利的微環(huán)境，在腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞及其間質(zhì)細(xì)胞以自分泌以及旁分泌的方式產(chǎn)生趨化因子，并與趨化因子受體特異性結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的趨化和轉(zhuǎn)移。CXCR7參與多種腫瘤生長(zhǎng)、生存和轉(zhuǎn)移過(guò)程［8］。研究顯示，CXCR7在乳腺癌［9］、胰腺癌［10］等多種腫瘤組織中表達(dá)升高，在腎細(xì)胞癌中下調(diào)CXCR7表達(dá)后可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移［11］。研究表明［12?13］，黑素瘤細(xì)胞系及正常人表皮黑素細(xì)胞存在CXCR7∕CXCL12趨化因子受體及配體共表達(dá)，且CXCR7與受體CXCL12結(jié)合后可導(dǎo)致正常人表皮黑素細(xì)胞CXCL12誘導(dǎo)的遷移過(guò)程。本課題組前期研究顯示［14］，在黑素瘤組織及黑素瘤細(xì)胞株A375和M14細(xì)胞中均存在CXCR7蛋白的高表達(dá)，提示CXCR7可能影響黑素瘤生物學(xué)行為。通過(guò)小RNA干擾技術(shù)靶向沉默CXCR7表達(dá)后，黑素瘤M14細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力被顯著抑制，證實(shí)CXCR7在黑素瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，有望成為黑素瘤潛在的治療靶點(diǎn)［15］。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測(cè)丹參酮ⅡA作用黑素瘤細(xì)胞前后CXCR7基因與蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示丹參酮ⅡA組CXCR7 mRNA與蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，且隨丹參酮ⅡA濃度的增加而下降，提示丹參酮ⅡA可能通過(guò)抑制CXCR7表達(dá)，抑制黑素瘤A375細(xì)胞侵襲與遷移，但關(guān)于丹參酮ⅡA作用后激活的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需進(jìn)一步研究。

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2017中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)征文通知

經(jīng)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)定于2017年4月20-24日在珠海維景國(guó)際大酒店召開(kāi)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)。此次會(huì)議將發(fā)揚(yáng)歷次年會(huì)的優(yōu)良傳統(tǒng)，注重中西醫(yī)結(jié)合治療皮膚病的新方法及新的研究進(jìn)展等方面的學(xué)術(shù)交流，內(nèi)容密切聯(lián)系臨床，切合皮膚科醫(yī)師的實(shí)際需求，會(huì)議將邀請(qǐng)知名專(zhuān)家做特邀演講，闡述皮膚科相關(guān)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，創(chuàng)造形式多樣、內(nèi)容充實(shí)、緊張熱烈、活躍互動(dòng)的學(xué)術(shù)交流形式，達(dá)到全國(guó)皮膚科中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師共同展現(xiàn)才華、獲取知識(shí)和信息、增進(jìn)友誼的目的，欲參加會(huì)議者請(qǐng)仔細(xì)閱讀通知并在規(guī)定的時(shí)間按要求投稿。

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Inhibitory effects of tanshinoneⅡAon migration and invasion of melanoma cells and their mechanisms

Li Xiaojing,Li Zhifeng,Li Xianping,Liu Baoguo,Liu Zhijun
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei, China

s:Liu Baoguo,Email:LBG66@163.com;Liu Zhijun,Email:zlmdsh@126.com

Objective To evaluate effects of tanshinoneⅡAon the invasion and migration of melanoma A375 cells,as well as on the mRNA and protein expression of CXC chemokine receptor type 7（CXCR7）.Methods In vitro cultured A375 cells were divided into 4 groups to be treated with tanshinoneⅡA at different concentrations of 1,2 and 4 mg∕L,and 0.1%dimethyl sulfoxide（DMSO）（control group）for 48 hours,respectively.Wound scratch assay and Transwell invasion assay were conducted to estimate the migratory and invasive abilities of A375 cells,respectively,and real?time fluorescence?based quantitative PCR（qRT?PCR）and Western blot analysis to determine the mRNA and protein expression of CXCR7 in A375 cells,respectively.Results After 48?hour treatment,the 1?,2?and 4?mg∕L tanshinoneⅡA groups showed significantly decreased number of A375 cells crossing the polycarbonate membrane per high?power field（×200）（71.00±4.00,51.00±2.00 and 37.00±3.61,respectively）in Transwell invasion assay,as well as decreased number of A375 cells migrating to the scratch zone（301±3.00, 253.00±3.61 and 126.00±7.00,respectively）in wound scratch assay,compared with the control group（105.33±6.51,332.00±6.24,respectively,all P＜0.05）.Additionally,qRT?PCR and Western blot analysis revealed that the mRNA and protein expression of CXCR7 was significantly lower in the 1?,2?and 4?mg∕L tanshinoneⅡA groups than in the control groups（CXCR7 mRNA:0.63±0.04,0.44±0.02 and 0.31±0.01 vs.1.00±0.02;CXCR7 protein:0.573±0.015,0.416±0.011 and 0.260±0.055 vs.0.9000± 0.010;all P＜0.05）.Moreover,inhibitory effects of tanshinoneⅡA on the migration and invasion of A375 cells,as well as on the mRNA and protein expression of CXCR7,were significantly enhanced with the increase of tanshinoneⅡA concentrations（all P＜0.05）.Conclusion TanshinoneⅡA can inhibit the migratory and invasive abilities of melanoma A375 cells by down?regulating CXCR7 expression.

Melanoma;Tanshinone;Receptors,CCR7;Cell migration assays;A375 cells

劉保國(guó)，Email：LBG66@163.com；劉志軍，Email：zlmdsh@126.com

10.3760∕cma.j.issn.0412?4030.2017.02.008

2016?05?06）

（本文編輯：周良佳 顏艷）