楊佳 李黎明 許翠 龍嘉 王堯 楊雪源 蔣明軍

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所中心實驗室 江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（楊佳、李黎明、許翠、龍嘉、楊雪源、蔣明軍）；南京農(nóng)業(yè)大學生命科學與技術(shù)基地班（王堯）

·論著·

慢病毒介導的靶向沉默HPV16 E7?shRNA對SiHa細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響

楊佳 李黎明 許翠 龍嘉 王堯 楊雪源 蔣明軍

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所中心實驗室 江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室（楊佳、李黎明、許翠、龍嘉、楊雪源、蔣明軍）；南京農(nóng)業(yè)大學生命科學與技術(shù)基地班（王堯）

目的 探討慢病毒攜帶的靶向人乳頭瘤病毒16（HPV16）E7基因的短發(fā)夾干擾RNA（shRNA）對HPV16陽性宮頸癌SiHa細胞中4種甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L）表達水平的影響。方法 構(gòu)建HPV16 E7基因靶序列的shRNA重組質(zhì)粒，用BLOCK?iT?Lentiviral RNAi Expression System試劑盒進行慢病毒包裝，分別轉(zhuǎn)染293T細胞48、72 h后收集病毒上清液。分別用含靶向HPV16 E7?shRNA重組質(zhì)粒的病毒上清液與完全培養(yǎng)基（1∶1）的混合液（shRNA組）、含空白質(zhì)粒（即不含靶向HPV16 E7?shRNA序列）的病毒上清液與完全培養(yǎng)基（1∶1）的混合液（陰性對照組）、完全培養(yǎng)基（空白對照組）培養(yǎng)SiHa細胞。感染0、48、96 h后，用實時熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測3組SiHa細胞中HPV16 E7和4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達，Western印跡檢測4種甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白表達。結(jié)果 感染0 h時，shRNA組、陰性對照組、空白對照組SiHa細胞HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；感染48、96 h時，3組細胞間HPV16 E7和4種DNMT mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。shRNA組HPV16 E7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L mRNA表達水平在48 h時的沉默效率分別為71.13%、50.53%、13.72%、46.27%和17.92%，96 h時分別為83.50%、74.2%、47.8%、64.7%和48.9%；而陰性對照組和空白對照組各時間點表達水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。慢病毒感染48、96 h時，3組細胞間上述4種DNMT蛋白表達量差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。shRNA組4種DNMT蛋白表達水平隨感染時間的延長而逐漸下降，感染48 h時DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L蛋白表達抑制率分別為84%、37.2%、59.8%、49.3%，96 h時分別為73.1%、68.7%，55.5%、65.5%。結(jié)論 靶向沉默HPV16陽性宮頸癌SiHa細胞E7基因能夠干擾DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L mRNA及蛋白的表達。

人乳頭瘤病毒16；乳頭瘤病毒E7蛋白質(zhì)類；RNA，小分子干擾；甲基轉(zhuǎn)移酶類；細胞系，腫瘤

近年來，多種研究提示，表觀遺傳學改變參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中DNA甲基化是表觀遺傳學研究最為深入的一種機制［1］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）是催化DNA異常甲基化過程的關(guān)鍵信號分子，其表達水平和功能改變是導致異常DNA甲基化模式的重要因素之一［2］。Burgers等［3］的研究表明，人乳頭瘤病毒16（HPV16）E7可與DNMT1直接結(jié)合，從而激活DNMT1。高危型HPV感染和DNA異常甲基化均參與相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，我們推測，HPV16可能通過E7蛋白與DNMT發(fā)生作用，引起DNA異常甲基化，進而導致相關(guān)目的基因表達和功能發(fā)生改變。本研究以HPV16 E7為靶點設計短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾序列，構(gòu)建重組慢病毒表達載體，對病毒進行包裝，提取病毒液感染HPV16陽性宮頸癌SiHa細胞，探討體外靶向沉默HPV16 E7基因?qū)NMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的影響。

材料與方法

一、試劑與材料

SiHa和293T細胞為本實驗室保存，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Trizol試劑和慢病毒包裝系統(tǒng)（BLOCK?iTTMLentiviral RNAi Expression System Kit）（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）（美國Thermo Fisher Scientific公司），Quanti Fast SYBR Green PCR試劑盒（德國Qiagen公司），高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶和opti?MEM無血清培養(yǎng)基（美國Gibco公司），人DNMT1、DNMT3A、β肌動蛋白抗體、蛋白顯影液 20×LumiGLO?Reagent and 20× Peroxide（美國CST公司），人DNMT3B、DNMT3L抗體（英國Abcam公司）。

二、方法

1.HPV16 E7基因shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)基因庫提供的HPV16 E7基因序列，按照RNA干擾序列設計原則，通過BLOCK?iT RNAi Designer在線設計軟件（http：∕∕rnaidesigner.thermofisher.com∕rnaiexpress∕design.do）選擇長19個堿基的HPV16 E7基因特異性寡核苷酸序列為干擾靶點，靶序列如下：5′?AGGAGGATGAAATAGATGG?3′，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成針對上述HPV16 E7基因靶序列的shRNA重組質(zhì)粒（pLenti6∕BLOCK?iT?DEST expression plasmid）。

2.慢病毒包裝：轉(zhuǎn)染前24 h，選擇生長狀態(tài)良好的293T細胞，胰酶消化后傳代接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞覆蓋率達60%～70%后用于轉(zhuǎn)染。慢病毒包裝操作流程參考慢病毒包裝系統(tǒng)說明書，將制成的DNA?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復合物逐滴加入293T細胞，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，更換為含10%胎牛血清（FBS）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收獲含病毒的上清液，4℃、1 409×g離心15 min去除細胞碎片，病毒液分裝后-80℃凍存。

3.慢病毒感染SiHa細胞：用胰酶消化SiHa細胞后，以1.5×105個細胞∕孔接種于6孔培養(yǎng)板中，次日將培養(yǎng)液換成病毒液和完全培養(yǎng)基混合液（1∶1）2 ml進行病毒感染。實驗分為shRNA組、陰性對照組和空白對照組：①shRNA組：含靶向HPV16 E7?shRNA重組質(zhì)粒的病毒液培養(yǎng)SiHa細胞；②陰性對照組：含空白質(zhì)粒（即不含靶向HPV16 E7?shRNA序列）的病毒液培養(yǎng)SiHa細胞；③空白對照組：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SiHa細胞。每組設3個復孔。

4.實時熒光定量PCR（qRT?PCR）檢測HPV16 E7及4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達情況：分別收集感染0、48、96 h的細胞，Trizol法提取細胞總RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照標準試驗流程將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用Quanti Fast SYBR Green PCR試劑盒按其說明書擴增目的基因。反應體系如下：cDNA模板1 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR Green Mix 10 μl及去離子水8 μl，引物序列見表1。反應條件如下：50℃2 min；95℃5 min；95℃20 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃1 min，95℃15 s。根據(jù)所得的Ct值，以β肌動蛋白為內(nèi)參照，ΔCt=待測基因Ct-β肌動蛋白Ct；ΔΔCt=感染組ΔCt-空白對照組ΔCt，計算2?ΔΔCt，得到感染組樣本待測基因相對于空白對照組樣本基因的相對表達量。DNMT基因沉默效率=［1-（感染后甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA∕感染前甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA）］×100%。

表1 待測基因及內(nèi)參照的引物序列

5.Western印跡測定4種甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白表達：分別于感染0、48、96 h后收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，分別加入兔抗人DNMT1（1∶1 000）、DNMT3A（1∶1 000）、DNMT3B（1∶2 000）、DNMT3L（1∶2 000）抗體及兔抗人β肌動蛋白（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜。TBST液洗膜，加入辣根過氧化物酶（HRP）-羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST液洗膜，用20×LumiGLO?Reagent and 20×Peroxide發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光獲取圖像，用Quantity one軟件對各個條帶進行灰度值觀察。待測蛋白表達量=待測蛋白條帶灰度值∕β肌動蛋白條帶灰度值。DNMT蛋白表達抑制率=［1-（感染后DNMT蛋白表達量∕感染前DNMT蛋白表達量）］×100%。

結(jié)果

一、各組SiHa細胞HPV16 E7 mRNA水平

表2 慢病毒感染SiHa細胞3組間HPV16 E7 mRNA表達水平比較（±s）

表2 慢病毒感染SiHa細胞3組間HPV16 E7 mRNA表達水平比較（±s）

注：n=3。時間主效應F=10.70，P＜0.01；組間主效應F=22.01，P＜0.01；交互效應F=6.15，P＜0.01

組別shRNA組陰性對照組空白對照組F值P值0 h 0.97±0.04 0.96±0.02 0.98±0.05 0.07＞0.05 48 h 0.28±0.09 0.98±0.05 0.95±0.03 152.08＜0.05 96 h 0.16±0.08 0.93±0.08 0.96±0.05 287.85＜0.05 F值149.20 1.06 0.22 P值＜0.05＞0.05＞0.05

見表2。經(jīng)多因素方差分析，3組細胞間HPV16 E7 mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=22.01，P＜0.01），各組HPV16 E7 mRNA相對表達量隨感染時間的延長而降低（F=10.70，P＜0.01），時間與組別間存在交互作用（F=6.15，P＜0.01）。感染0 h時，3組細胞間HPV16 E7 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而感染48、96 h時，3組細胞間HPV16 E7 mRNA相對表達量的差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。shRNA組HPV16 E7 mRNA表達水平隨時間的延長而逐漸降低（P＜0.05），48、96 h時的沉默效率分別為71.13%、83.50%，而陰性對照組和空白對照組各時間點HPV16 E7 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

二、HPV16 E7表達水平變化對SiHa細胞4種mRNA和蛋白的表達

1.經(jīng)多因素方差分析，3組細胞間DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、 DNMT3L mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為294.80、52.50、214.73、77.40，均 P＜0.01）。各組細胞4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對表達量有隨感染時間變化的趨勢（F值分別為90.94、25.50、72.76、31.04，均P＜0.01），時間與組別均存在交互作用（F值分別為78.82、19.93、57.22、22.74，均P＜0.01）。見圖1。

圖1 慢病毒感染SiHa細胞后各組4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）mRNA表達情況 shRNA組4種DNMT mRNA相對表達量均隨感染時間的延長而逐漸下降，而陰性對照組和空白對照組未見明顯變化

慢病毒感染SiHa細胞0 h時，3組細胞間4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義（F分別為0.16、0.33、0.27、0.11，均P＞0.05）；感染48、96 h時，3組細胞間4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA相對表達量的差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。此外，shRNA組上述4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達水平隨感染時間的延長而逐漸下降（均P＜0.01），感染48、96 h時4種DNMT的沉默效率分別為50.53%、74.2%，13.72%、47.8%，46.27%、64.7%，17.92%、48.9%。然而，陰性對照組和空白對照組各時間點4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖2 Western印跡法檢測感染48、96 h后3組SiHa細胞4種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）蛋白的表達 1：shRNA組；2：陰性對照組；3：空白對照組。感染48、96 h時，shRNA組4種蛋白表達水平均明顯低于陰性對照組和空白對照組，而陰性對照組與空白對照組間無明顯差異；此外，shRNA組4種DNMT蛋白表達水平隨感染時間的延長而逐漸下降

表3 慢病毒感染48、96 h后3組SiHa細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）蛋白表達（±s）

表3 慢病毒感染48、96 h后3組SiHa細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）蛋白表達（±s）

注：n=3

組別shRNA組陰性對照組空白對照組DNMT1 48 h 0.08±0.05 0.54±0.04 0.50±0.06 96 h 0.07±0.01 0.29±0.03 0.26±0.05 DNMT3A 48 h 0.27±0.02 0.41±0.01 0.43±0.02 96 h 0.10±0.02 0.36±0.05 0.32±0.06 DNMT3B 48 h 0.37±0.06 0.92±0.04 0.92±0.06 96 h 0.20±0.02 0.50±0.05 0.45±0.05 DNMT3L 48 h 0.37±0.06 0.66±0.02 0.73±0.06 96 h 0.23±0.03 0.80±0.03 0.67±0.05

2.蛋白表達水平變化：見圖2，表3。經(jīng)多因素方差分析，3組細胞間4種DNMT蛋白表達水平的差異有統(tǒng)計學意義（F值分別為140.57、61.25、143.84、184.43，均P＜0.01），且各組細胞4種DNMT蛋白表達量有隨感染時間變化的趨勢（F值分別為98.28、 41.89、230.83、51.56，均P＜0.01），時間與組別間存在交互作用（F值分別為22.05、4.67、14.255、16.34，均P＜0.05）。感染48 h時4種DNMT蛋白表達抑制率分別為84%、37.2%、59.8%、49.3%，96 h時為73.1%、68.7%，55.5%、65.5%。

討論

流行病學和分子生物學資料［4］表明，高危型HPV持續(xù)感染兩性生殖器部位皮膚黏膜易導致陰莖癌、女性外陰癌和宮頸癌，以高危型HPV16最為常見，其基因組基本結(jié)構(gòu)分為3個功能區(qū)：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（E1、E2、E4、E5、E6、E7），晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（L1、L2）和非轉(zhuǎn)錄區(qū)（LCR）。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼的基因主要參與病毒DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和細胞轉(zhuǎn)化等功能，其中E7基因編碼的蛋白可導致多種細胞周期負向調(diào)控信號失效，如pRb介導的生長停滯、p16介導的細胞周期停滯等［5］。有學者［6］研究發(fā)現(xiàn)，E7蛋白能夠通過激活EZH2基因表達增強DNMT的活性，表明HPV16 E7與DNA甲基化狀態(tài)有密切聯(lián)系。

DNMT是催化DNA異常甲基化過程的關(guān)鍵信號分子，其表達水平和功能的改變是導致異常DNA甲基化模式的重要內(nèi)源性因素，主要包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L。DNMT1是DNA進行復制并維持其正常甲基化的關(guān)鍵酶，DNMT3A和DNMT3B主要催化從頭甲基化，DNMT3L并沒有直接的甲基化作用，但可以通過蛋白之間的相互作用調(diào)節(jié)DNMT3A和DNMT3B的活性［7］。有研究表明，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達水平在宮頸癌組織中高于正常宮頸組織，提示DNMT表達異常是引起宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素［8?9］。Au Yeung等［10］通過RNAi技術(shù)沉默宮頸癌細胞株中HPV16 E6基因后，觀察到DNMT1蛋白表達水平下降，而過表達E6基因，DNMT1蛋白表達水平隨之上升，提示HPV16 E6癌基因參與調(diào)節(jié)宮頸癌中DNMT的表達。Burgers等［3］研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E7可通過與DNMT1直接結(jié)合，形成E7∕DNMT1復合物，活化DNMT1，促進DNMT1與DNA和腺苷蛋氨酸結(jié)合，這是迄今為止唯一明確證實E7和DNMT有直接結(jié)合，進而激活酶活性的研究報道。

本研究選擇HPV16陽性宮頸癌細胞株SiHa，應用靶向HPV16 E7的shRNA慢病毒載體介導的RNAi技術(shù)，選擇性抑制細胞內(nèi)HPV16編碼的E7基因表達，并分別采用qRT?PCR和Western印跡法對E7蛋白及4種DNMT在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達情況進行分析，從而探索4種DNMT表達水平與HPV16 E7蛋白的依賴關(guān)系。數(shù)據(jù)表明，在慢病毒感染SiHa細胞48、96 h后，HPV16 E7 mRNA表達水平較感染前顯著下降，提示靶向HPV16 E7干擾慢病毒構(gòu)建成功，該慢病毒能夠有效且特異地沉默E7基因，抑制其在轉(zhuǎn)錄水平的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染前3組細胞間4種甲基轉(zhuǎn)移酶的表達水平均無明顯差異，感染48、96 h時，shRNA組4種甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA和蛋白表達水平均逐漸下降。提示在SiHa細胞中，HPV16 E7基因可能通過某種直接或間接的機制參與調(diào)控DNMT的表達，進而導致相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)改變，促進細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。該研究為深入研究E7基因與DNMT的相互作用關(guān)系提供了依據(jù)。

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Effects of lentivirus?delivered short hairpin RNA targeting human papillomavirus 16 E7 gene on the expression of DNA methyltransferases in SiHa cells

Yang Jia,Li Liming,Xu Cui,Long Jia,Wang Yao,Yang Xueyuan,Jiang Mingjun
Central Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042, China（Yang J,Li LM,Xu C,Long J,Yang XY,Jiang MJ）;Life Sciences and Technology Base Class, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China（Wang Y）

Jiang Mingjun,Email:drmingjunjiang@163.com

Objective To evaluate the effects of lentivirus?delivered short hairpin RNA（shRNA）targeting human papillomavirus 16（HPV16）E7 gene on the expression of 4 kinds of DNA methyl?transferases（DNMTs）,including DNMT1,DNMT3A,DNMT3B and DNMT3L,in HPV16?positive cervical cancer cell line SiHa.Methods The recombinant plasmid containing HPV16 E7 gene?targeting shRNA was constructed firstly.Then,the BLOCK?iTTM lentiviral RNAi expression system kit was used to package the lentiviral vector,which was transfected into 293T cells.The lentivirus?containing supernatants were collected at 48 and 72 hours after transfection.The SiHa cells were divided into 3 groups to be cultured with lentiviral supernatant containing HPV16 E7 gene?targeting shRNA recombinant plasmids mixed with complete medium at a ratio of 1∶1（shRNA group）,lentiviral supernatant containing empty plasmids mixed with complete medium at a ratio of 1∶1（negative control group）,and complete medium alone（blank control group）,respectively.Real?time fluorescence?based quantitative PCR（qRT?PCR）was performed to measure mRNA expression of HPV16 E7 and 4 kinds of DNMTs in the above 3 groups at 0,48,96 hours after infection,and Western blot analysis to determine protein expression of the 4 DNMTs at 48,96 hours after infection.Results There were no significant differences in the mRNA expression of HPV16 E7 and the 4 DNMTs among the shRNA group,negative control group and blank control group at 0 hour after infection（all P＞0.05）.At 48,96 hours after infection,the mRNA expression of HPV16 E7 and the 4 DNMTs decreased significantly in the shRNA group compared with the negative control group and blank control group（all P＜0.05）,but did not differ between the negative control group and blank control group（all P＞0.05）.Additionally,E7,DNMT1,DNMT3A,DNMT3B and DNMT3L gene?silencing efficiencies in the shRNA group were 71.13%,50.53%,13.72%,46.27%and 17.92%at 48 hours,and 83.50%,74.2%, 47.8%,64.7%and 48.9%at 96 hours after infection,respectively.Western blot analysis showed that the protein expression of the 4 DNMTs significantly decreased in the shRNA group compared with the negative control group and blank control group at 48,96 hours after infection（all P＜0.01）.Moreover,the protein expression of DNMT1,DNMT3A,DNMT3B and DNMT3L in the shRNA group gradually decreased over time,and was inhibited by 84%,37.2%,59.8%and 49.3%at 48 hours respectively,and by 73.1%,68.7%, 55.5%and 65.5%at 96 hours after infection respectively.Conclusion Targeted silencing of E7 gene in HPV16?positive SiHa cells can interfere with the mRNA and protein expression of DNMT1,DNMT3A, DNMT3B and DNMT3L.

Human papillomavirus 16;Papillomavirus E7 proteins;RNA,small interfering;Methyl?transferases;Cell line,tumor

蔣明軍，Email：drmingjunjiang@163.com

10.3760∕cma.j.issn.0412?4030.2017.02.002

國家自然科學基金（31470274）；江蘇省臨床醫(yī)學研究中心項目（BL2012003）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費（2016RC310025）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（31470274）;Clinical Research Center Program of Jiangsu Province（BL2012003）;Special Fund for Basic Scientific Research Business of Central Public Research Institutes（2016RC310025）

2015?12?28）

（本文編輯：周良佳 顏艷）