郭獨(dú)一 康天濟(jì) 閆慧敏 趙惠娟 姜薇

100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科（郭獨(dú)一、閆慧敏、趙惠娟、姜薇）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室（康天濟(jì)）

·論著·

家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變性?xún)杉蚁礝SMR基因突變

郭獨(dú)一 康天濟(jì) 閆慧敏 趙惠娟 姜薇

100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科（郭獨(dú)一、閆慧敏、趙惠娟、姜薇）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心機(jī)能實(shí)驗(yàn)室（康天濟(jì)）

目的 檢測(cè)家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變性?xún)蓚€(gè)家系OSMR基因突變情況并分析與臨床表現(xiàn)的關(guān)系。方法 收集兩個(gè)原發(fā)性皮膚淀粉樣變性家系的臨床資料，提取外周血DNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增兩例先證者及其家屬OSMR基因18個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列并測(cè)序，并以100例健康人作為對(duì)照。結(jié)果 第1個(gè)家系先證者OSMR基因第15號(hào)外顯子發(fā)生c.2081C＞T雜合突變，導(dǎo)致氨基酸序列出現(xiàn)p.P694L改變，家族中其他4例患者均帶有相同突變位點(diǎn)。第2個(gè)家系先證者OSMR基因第11號(hào)外顯子發(fā)生c.1538G＞A雜合突變，導(dǎo)致氨基酸序列出現(xiàn)p.G513D改變，其母親也帶有相同突變位點(diǎn)，突變位點(diǎn)與疾病符合共分離。兩家系中健康成員及100例健康對(duì)照者均未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變。結(jié)論 OSMR基因p.P694L和p.G513D突變可能與原發(fā)性皮膚淀粉樣變性有關(guān)。

淀粉樣變，家族性；系譜；突變；皮膚表現(xiàn)；基因，OSMR

原發(fā)性皮膚淀粉樣變性（primary cutaneous amyloidosis，PCA）是淀粉樣蛋白沉積于皮膚中，無(wú)其他內(nèi)臟器官受累的一種局限性疾病。該病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與遺傳、病毒（如EB病毒）、長(zhǎng)期摩擦［1］有關(guān)，大多數(shù)為散發(fā)病例，10%有顯性遺傳家族史。家族性原發(fā)性皮膚淀粉樣變性（familial primary cutaneous amyloidosis，F(xiàn)PCA）在南美洲、東南亞（包括臺(tái)灣）較為常見(jiàn)［2］，該病常于青春期前后起病，多為持久性、瘙癢性皮損，好發(fā)于脛前及四肢伸側(cè)。目前發(fā)現(xiàn)該病的致病基因分別位于5p13.1的OSMR（601743）基因和位于5q11.2的IL31RA基因（609510）基因［3］，其中OSMR基因突變最為常見(jiàn)。我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)2個(gè)FPCA家系并對(duì)其進(jìn)行OSMR基因突變研究，探討其發(fā)病的分子基礎(chǔ)與臨床表型之間的關(guān)系。

資料和方法

一、臨床資料

家系1先證者為55歲男性，23年前雙脛前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)瘙癢，逐漸出現(xiàn)針尖大小褐色丘疹，后逐漸增大至黃豆大小，丘疹密集分布但不融合，逐步擴(kuò)展到上背部、雙前臂，瘙癢劇烈。曾外用多種藥物治療，皮疹和瘙癢程度改善不明顯。其他系統(tǒng)檢查未見(jiàn)異常。家族中共有5個(gè)成員受累（圖1?Ⅱ6），皮損表現(xiàn)及發(fā)病過(guò)程與先證者基本相似。家族中其他成員否認(rèn)代謝性疾病史。取先證者左小腿丘疹（圖2）行組織病理檢查可見(jiàn)真皮乳頭增寬，其內(nèi)可見(jiàn)均一嗜酸性團(tuán)塊狀物（圖3）。家系2先證者（圖4?Ⅲ2）為45歲女性，自青春期開(kāi)始雙小腿逐漸出現(xiàn)米粒大小堅(jiān)實(shí)的褐色角化性丘疹，上背部可見(jiàn)褐色斑點(diǎn)，聚合成網(wǎng)狀，伴輕度瘙癢。一直未治療，各系統(tǒng)檢查未見(jiàn)異常。家族中先證者母親是患者（圖4?Ⅱ3），臨床表現(xiàn)與先證者相似，瘙癢嚴(yán)重一些。家族中其他成員否認(rèn)代謝性疾病史。取先證者左小腿皮損（圖5）行組織病理活檢可見(jiàn)真皮乳頭中均一紅染的團(tuán)塊狀沉積物（圖6）。本研究通過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者和健康人均簽署知情同意書(shū)。

圖1 家系1 圖2 家系1先證者雙脛前黃豆大小褐色丘疹，密集不融合 圖3 先證者小腿脛前皮損組織病理 真皮乳頭增寬，其內(nèi)可見(jiàn)均一嗜酸性團(tuán)塊狀物（HE×100，箭頭）

圖4 家系2 圖5 家系2先證者雙脛前密集米粒大小角化性堅(jiān)實(shí)的褐色丘疹 圖6 先證者小腿脛前皮損組織病理 真皮乳頭均一紅染的團(tuán)塊狀沉積物（HE×100，箭頭）

二、方法

1.DNA提?。菏占?個(gè)家系中所有患者和健康成員各5例及100例健康對(duì)照外周血4 ml，用DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA。

2.PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序：根據(jù)OSMR基因序列采用軟件Primer3設(shè)計(jì)18對(duì)特異性引物擴(kuò)增該基因全部外顯子及其側(cè)翼序列，其中OSMR基因第11號(hào)外顯子引物序列：上游5′?AAGCTGTTTGAATTTTCT GGTG?3′，下游5′?GGCCCAAAAGAAAATGACTG?3′；15號(hào)外顯子引物為：上游5′?TGTCCCAGAAACT CCTAAGGG?3′，下游5′?TTCCCAGAAACTCCTAAG GG?3′。PCR反應(yīng)采用50 μl體系：上、下游引物各10 pmol∕L，dNTP 10 mmol∕L，MgCl215 mmol∕L，Taq酶2.5 U。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用10 g∕L瓊脂糖凝膠（溴化乙錠染色）電泳分析，經(jīng)酶純化后用ABIPrism377型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序（北京天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司），并將突變結(jié)果進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證。

結(jié)果

以先證者基因組DNA為模板，18對(duì)引物分別擴(kuò)增出各自產(chǎn)物，對(duì)所有產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與基因庫(kù)NM_003999（http：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕nuccore∕NM_003999）以及 Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∕∕www. ensemble.org∕）所公布的序列相比較，發(fā)現(xiàn)家系1先證者OSMR基因第15號(hào)外顯子中第2081位胞嘧啶C被胸腺嘧啶T替代（c.2081C＞T），該突變導(dǎo)致第694號(hào)氨基酸序列由脯氨酸P轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼酟（p.P694L）（圖7）。家系2先證者第11號(hào)外顯子中第1538位鳥(niǎo)嘌呤G被腺嘌呤A替代（c.1538G＞A），導(dǎo)致第513號(hào)氨基酸序列由甘氨酸G轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼酓（p.G513D）（圖8）。兩家系中其他患者均檢測(cè)到與先證者相同突變位點(diǎn)，而家庭中健康成員及100例健康對(duì)照無(wú)此發(fā)現(xiàn)。兩家系中突變位點(diǎn)與疾病符合共分離。

圖7 家系1測(cè)序 先證者OSMR基因第15號(hào)外顯子2081位發(fā)生C＞T替代

圖8 家系2測(cè)序 先證者OSMR基因第11號(hào)外顯子1538位發(fā)生G＞A替代

討論

圖9 OSMR-β蛋白結(jié)構(gòu)及迄今已報(bào)道的FPCA患者OSMR基因突變位點(diǎn)示意圖 圖中紅字顯示的突變位點(diǎn)為本研究結(jié)果

Lee等［4］應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記物對(duì)一FPCA家系進(jìn)行基因組掃描，發(fā)現(xiàn)與染色體5pl3.1?gll.2存在連鎖相關(guān)性。Arita等［5］通過(guò)連鎖分析法將FPCA致病基因定位于致瘤素M受體（oncostatin M receptor，OSMR）。OSMR基因編碼制瘤素M特異性受體β（OSMR?β），該蛋白是一種由活化的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，屬于IL?6家族，是OSMⅡ型受體和白細(xì)胞介素31（IL?31）受體組成部分，與一些功能子域共同構(gòu)成跨膜細(xì)胞因子受體的一部分，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)過(guò)程，在調(diào)節(jié)先天免疫、血管生成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用［6］。OSMR?β蛋白分胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞外區(qū)由3個(gè)細(xì)胞因子結(jié) 合 區(qū)（cytokine bingding domain，CBD）、IgG樣區(qū)和纖連蛋白Ⅲ型亞區(qū)（fibronectin typeⅢ?like domain，F(xiàn)NⅢ）組成（圖9），其中細(xì)胞因子結(jié)合區(qū)和IgG樣區(qū)主要用于形成受體并與配體結(jié)合，而FNⅢ區(qū)對(duì)受體域正確的空間構(gòu)型和定位起作用，從而影響受體二聚體的形成［7］。OSMR?β蛋白胞質(zhì)區(qū)包含與JAK?STAT，MAPK以及PI3K∕Akt信號(hào)招募功能相關(guān)的多個(gè)模體，Jak?STAT，MAPK和PI3K∕Akt通路為IL?6的主要通路，并在一些腫瘤細(xì)胞株中發(fā)揮抗凋亡作用［8?9］。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PCA家系迄今已報(bào)道12個(gè)OSMR基因突變位點(diǎn)，包括：p.Gly513Asp［10］、p.Leu613Ser［11］、p.Lys615Asn［12］、p.Gly618Ala［5］、p.Val631Leu［13］、p.Asp647Tyr［13］、p.Asp647Val［3］、p.Ile691Thr［5］、p.Pro694Leu［7，14］、p.Lys697Thr［3］、p.Ty710Cys［15］、p.Gly723Val［10］，突變方式均為錯(cuò)義突變，而突變位點(diǎn)多集中在與跨膜區(qū)相鄰的FNⅢ區(qū)域內(nèi)（圖9），疾病分布未見(jiàn)明顯的地域差異，其中p.Pro694Leu這一突變我國(guó)周云等［14］以及英國(guó)學(xué)者［7］都報(bào)道過(guò)。本研究發(fā)現(xiàn)家系1 c.2081C＞T雜合突變，導(dǎo)致第694號(hào)氨基酸序列由脯氨酸Pro轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼酟eu（p.P694L），此突變位于OSMR?β分子上與跨膜區(qū)相鄰的第3個(gè)纖連蛋白（FNⅢ）控制區(qū)內(nèi)，導(dǎo)致Jak?STAT、MAPK通路的激活受到影響，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和表皮增生起到誘導(dǎo)作用［7］。家系2 c.1538G＞A雜合突變導(dǎo)致第513號(hào)氨基酸序列由甘氨酸Gly轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼酇sp（p.G513D），該突變位點(diǎn)雖不在熱點(diǎn)區(qū)域（圖9），但也同樣位于FNⅢ區(qū)域內(nèi)。該突變位點(diǎn)并未見(jiàn)單獨(dú)報(bào)道，僅在2015年我國(guó)學(xué)者報(bào)道一家族性甲狀腺髓樣癌（RET）合并淀粉樣變的中國(guó)家系時(shí)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中所有患淀粉樣變并攜帶RET p.S891A突變的患者均檢測(cè)出OSMR p.G513D突變，但同時(shí)也有4例OSMR p.G513D攜帶者沒(méi)有皮膚淀粉樣變的臨床表現(xiàn)，據(jù)此推測(cè)OSMR p.G513D可能在攜有RET p.S891A突變的淀粉樣變患者疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到一定的修飾作用，并通過(guò)影響皮膚相應(yīng)的信號(hào)通路而引起FPCA的發(fā)生［10］?？傊?，我們對(duì)2例FPCA家系進(jìn)行OSMR基因突變檢測(cè)，并對(duì)迄今OSMR基因突變情況進(jìn)行分析，此結(jié)果為進(jìn)一步研究亞洲FPCA家系基因型與表型之間關(guān)系提供數(shù)據(jù)。

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·讀者·作者·編者·

本刊法定計(jì)量單位的書(shū)寫(xiě)規(guī)則

執(zhí)行GB 3100∕3101∕3102-1993《國(guó)際單位制及其應(yīng)用∕有關(guān)量、單位和符號(hào)的一般原則∕（所有部分）量和單位》的有關(guān)規(guī)定，具體執(zhí)行可參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)雜志社編寫(xiě)的《法定計(jì)量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》第3版（人民軍醫(yī)出版社2001年出版）。凡是涉及人體及動(dòng)物體內(nèi)的壓力測(cè)定，可以使用毫米汞柱（mmHg）或厘米水柱（cmH2O）為計(jì)量單位，但首次使用時(shí)應(yīng)注明mmHg或cmH2O與kPa的換算系數(shù)（1 mmHg=0.133 kPa，1 cmH2O=0.098 kPa）。一般情況下，統(tǒng)一用L（升）作為表示人體檢驗(yàn)組分濃度單位的分母，而不使用ml（毫升）、dl（分升）、mm3（立方毫米）等作分母。但當(dāng)涉及高精度測(cè)試時(shí)，可以用ml、μl等作分母。在一個(gè)組合單位符號(hào)中，斜線(xiàn)不應(yīng)多于1條。例如：mg∕kg∕d；應(yīng)寫(xiě)為mg∕（kg·d）或mg·kg-1·d-1。時(shí)間的表示方法：作為單位修飾詞僅為數(shù)字時(shí)，天（日）用“d”，小時(shí)用“h”，分鐘用“min”，秒用“s”。非單位時(shí)可用天、小時(shí)、分鐘、秒。如：在描述第×天、第×小時(shí)、第×分鐘，或每天、每小時(shí)、每分鐘等時(shí)，均用漢字。表示離心加速作用時(shí)，應(yīng)以重力加速度（g）的倍數(shù)形式表達(dá)。例如：6 000×g離心10 min?；蛘咴诮o出離心機(jī)轉(zhuǎn)速的同時(shí)給出離心半徑，例如：離心半徑8 cm，12 000 r∕min離心10 min。

Mutation analysis of the OSMR gene in two Chinese families with familial primary cutaneous amyloidosis

Guo Duyi,Kang Tianji,Yan Huimin,Zhao Huijuan,Jiang Wei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China（Guo DY,Yan HM, Zhao HJ,Jiang W）;Functional Laboratory,Experimental Center for Teaching and Learning,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Heilongjiang 150040,China（Kang TJ）

Jiang Wei,Email:jiangwei7366@163.com

Objective To detect mutations in the OSMR gene in 2 Chinese families with familial primary cutaneous amyloidosis（FPCA）,and to analyze their relationship with clinical manifestations. Methods Clinical data were collected from 2 families with FPCA,and genomic DNA was extracted from peripheral blood samples.PCR was performed to amplify 18 exons and their flanking sequences of the OSMR gene followed by DNA sequencing in 2 probands and their family members.One hundred healthy individuals served as controls.Results In the first family,a heterozygous mutation（c.2081C＞T）in exon 15 of the OSMR gene,which leads to a codon change at amino acid position 694（p.P694L）,was identified in the proband,as well as in the other 4 patients.In the second family,a heterozygous mutation（c.1538G＞A）in exon 11 of the OSMR gene,which causes a codon change at amino acid position 513（p.G513D）,was identified in the other proband and her mother,suggesting the cosegregation of the gene mutation with the disease.None of the above mutations were detected in the healthy family members or controls.Conclusion The heterozygous mutations p.P694L and p.G513D in the OSMR gene may be associated with primary cutaneous amyloidosis.

Amyloidosis,familial;Pedigree;Mutation;Skin manifestations;Genes,OSMR

姜薇，Email：jiangwei7366@163.com

10.3760∕cma.j.issn.0412?4030.2017.02.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201216）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81201216）

2016?05?18）

（本文編輯：吳曉初）