朱啟淦,孟加榕,禹 樂,戴太監(jiān),楊立民,陳藝錦,耿月華

(中國人民解放軍第一七五醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;*通訊作者,E-mail:mengjiarong@ sina.com)

新柏氏細(xì)胞清洗液在血性胸腹水細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用

朱啟淦,孟加榕*,禹 樂,戴太監(jiān),楊立民,陳藝錦,耿月華

(中國人民解放軍第一七五醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;*通訊作者,E-mail:mengjiarong@ sina.com)

目的 探討新柏氏細(xì)胞清洗液在血性胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢測中的應(yīng)用及意義。 方法 收集我院2016-12～2017-04血性胸腹水130例,用新柏氏細(xì)胞清洗液處理后行液基細(xì)胞學(xué)制片(TCT)、細(xì)胞塊切片聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)檢測;傳統(tǒng)檢測法未用新柏氏細(xì)胞清洗液處理,直接離心涂片及細(xì)胞塊切片檢測。 結(jié)果 130例血性胸腹水傳統(tǒng)檢測法涂片及細(xì)胞塊切片中細(xì)胞重疊明顯,常成堆分布,因含大量紅細(xì)胞、蛋白黏液,造成背景不清晰;用新柏氏細(xì)胞清洗液處理后TCT及細(xì)胞塊切片中紅細(xì)胞數(shù)量與傳統(tǒng)檢測法相比明顯減少,且間皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等輪廓清楚,細(xì)胞染色清晰。130例血性胸腹水標(biāo)本傳統(tǒng)細(xì)胞涂片腫瘤細(xì)胞檢出率為16.15%(21/130),TCT法腫瘤細(xì)胞檢出率為29.23%(38/130),兩種方法HE染色結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞塊切片結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)法腫瘤細(xì)胞檢出率為36.15%(47/130),與TCT陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 血性胸腹水經(jīng)新柏氏細(xì)胞清洗液去紅細(xì)胞、黏液及蛋白液等處理,并采用TCT法及細(xì)胞塊切片聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)法能有效提高腫瘤細(xì)胞的檢出率。

血性胸腹水; 液基細(xì)胞學(xué); 細(xì)胞塊; 免疫細(xì)胞化學(xué)

脫落細(xì)胞學(xué)檢查是臨床診斷腫瘤的重要方法之一,但血性胸腹水在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制片過程中,由于標(biāo)本中含有大量紅細(xì)胞,使涂片及細(xì)胞塊切片被紅細(xì)胞覆蓋,給細(xì)胞學(xué)診斷帶來困難,特別是含血細(xì)胞較多而癌細(xì)胞又很少時(shí),紅細(xì)胞會(huì)將很少的癌細(xì)胞掩蓋,致使細(xì)胞學(xué)診斷造成漏診[1,2]。氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨[1,2]等可消除紅細(xì)胞,但在消除黏液、蛋白液時(shí)效果較差。而傳統(tǒng)的血性胸腹水細(xì)胞涂片較難為臨床提供腫瘤的準(zhǔn)確來源及分型[3],免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果也令人不滿意[4]。為了提高血性胸腹水細(xì)胞學(xué)陽性檢出率,我科經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn),采用新柏氏細(xì)胞清洗液對(duì)血性標(biāo)本進(jìn)行處理,可以達(dá)到溶血、去黏液及蛋白液等效果,并采用TCT制片及細(xì)胞塊切片聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)法,紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少,腫瘤細(xì)胞顯示更加清晰,消除了背景模糊的現(xiàn)象,從而提高了血性胸腹水標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的檢出率,對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷具有較高的使用價(jià)值及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2016-12～2017-04臨床送檢血性胸腹水130例,其中胸水95例,腹水35例。

1.2 儀器與試劑

400C醫(yī)用低速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司),Thinprep 2000(美國新柏氏),RM2245切片機(jī)(德國萊卡),Leica ST5020染色機(jī),Leica CV5030封片機(jī), 免疫組化一抗CK7、TTF-1、CK5/6、P63、CD56、Syn、Calretinin、WT-1、NapsinA、CDX-2、CA-125、ER等及二抗試劑盒(羊抗鼠/兔)均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本預(yù)處理 新鮮血性胸腹水標(biāo)本靜置30 min,去除上清液,留取近瓶底液體約100 ml,混勻后取標(biāo)本12 ml于4支15 ml尖端離心管內(nèi),2 000 r/min離心[5,6]5 min,去除上清液(若沉淀物少,重復(fù)離心),備用。

1.3.2 傳統(tǒng)的血性胸腹水細(xì)胞學(xué)檢測 取2支預(yù)處理離心管,一支沉淀物直接涂片,95%酒精固定,HE染色;一支加4%中性甲醛[7]12 ml混勻固定,靜置30 min,2 000 r/min離心5 min,棄甲醛液,將沉淀物用濾紙包裹后放入包埋盒進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成細(xì)胞塊,HE染色;觀察涂片及細(xì)胞塊切片細(xì)胞分布及背景清晰度,若發(fā)現(xiàn)可疑腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

1.3.3 新柏氏細(xì)胞清洗液處理標(biāo)本檢測 取2支預(yù)處理離心管,加入新柏氏細(xì)胞清洗液12 ml,1 500 r/min振蕩10 min,使離心管底部沉淀物分散、溶解直至顏色變淺紅,2 000 r/min離心5 min,去除上清液。一支加新柏氏細(xì)胞保存液12 ml,混勻后轉(zhuǎn)移至新柏氏樣本瓶,靜置15 min,使用新柏氏2000自動(dòng)行TCT制片,HE染色;一支加4%中性甲醛12 ml混勻固定,靜置30 min,2 000 r/min離心5 min,棄甲醛液,將沉淀物用濾紙包裹后放入包埋盒進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成細(xì)胞塊,HE染色;觀察涂片及細(xì)胞塊切片細(xì)胞分布及背景清晰度,若發(fā)現(xiàn)可疑腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

1.3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法 采用免疫細(xì)胞化學(xué)MaxVisionTM法染色。細(xì)胞塊切片,65 ℃烤片40 min,脫蠟至水,PBS清洗3次,高溫高壓抗原修復(fù),3% H2O2封閉10 min,PBS清洗3次,分別滴加一抗4 ℃冰箱過液,PBS清洗3次,每張切片加二抗試劑室溫下孵育15 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。用已知細(xì)胞學(xué)陽性標(biāo)本細(xì)胞塊切片做陽性對(duì)照及PBS取代一抗做陰性對(duì)照。

1.3.5 結(jié)果判斷 由診斷醫(yī)生對(duì)HE及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果進(jìn)行判讀。HE鏡下腫瘤細(xì)胞有明顯的異型性,呈腺泡、腺管或團(tuán)狀排列,有的單個(gè)散在,核大深染;免疫細(xì)胞化學(xué)鱗癌CK5/6、P63、P40陽性,腺癌CK7、TTF-1、NapsinA陽性,小細(xì)胞癌CD56、Syn、TTF-1陽性,間皮細(xì)胞Calretinin、WT-1、CK5/6陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析,不同方法腫瘤細(xì)胞檢出率用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血性胸腹水檢測結(jié)果

傳統(tǒng)檢測法:血性胸腹水涂片厚薄不均,細(xì)胞重疊明顯,常成堆分布,因含大量紅細(xì)胞、蛋白黏液,造成背景不清晰(圖A1);細(xì)胞塊切片及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法細(xì)胞成堆或散在分布,背景不夠清晰,免疫細(xì)胞化學(xué)因含大量紅細(xì)胞、蛋白黏液,造成背景淺棕色,陽性定位模糊,影響結(jié)果判讀(圖B1、C1)。

新柏氏細(xì)胞清洗液處理后檢測法:TCT中紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少,腫瘤細(xì)胞、間皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等輪廓清楚(圖A2),細(xì)胞塊切片及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法細(xì)胞分布均勻,染色鮮艷,核質(zhì)對(duì)比清晰,免疫細(xì)胞化學(xué)染色定位清晰準(zhǔn)確(圖B2、C2),效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測法。

A1.涂片背景紅染,癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示不清;B1.細(xì)胞塊切片背景紅染,癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示不清;C1.細(xì)胞塊切片癌細(xì)胞CK7胞質(zhì)表達(dá),定位較模糊;A2.TCT背景清晰,癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示清楚;B2.細(xì)胞塊切片背景清晰,癌細(xì)胞散在、團(tuán)狀分布;C2.細(xì)胞塊切片癌細(xì)胞CK7胞質(zhì)表達(dá),定位準(zhǔn)確圖1 傳統(tǒng)檢測法與新柏氏細(xì)胞清洗液處理后血性胸腹水檢測結(jié)果對(duì)比 (×200)

2.2 不同方法腫瘤細(xì)胞檢出率比較

130例血性胸腹水標(biāo)本傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片腫瘤細(xì)胞檢出率為16.15%(21/130),TCT法腫瘤細(xì)胞檢出率為29.23%(38/130),兩種方法HE染色結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞塊切片結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)法腫瘤細(xì)胞檢出率為36.15%(47/130),與TCT陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1),但TCT對(duì)一些可疑細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的來源及腫瘤分型無法確定,在加做細(xì)胞塊聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)后,可以判斷類型及來源。

表1血性胸腹水不同方法檢測結(jié)果比較

檢測方法n陽性陰性可疑陽性陽性確認(rèn)率(%)傳統(tǒng)涂片法13021931616.15TCT法1303887529.23*細(xì)胞塊免疫組化法1304783036.15

TCT法與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)涂片法比較,*P<0.05;細(xì)胞塊免疫組化法與TCT法比較,P>0.05

3 討論

胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)常規(guī)涂片檢查惡性腫瘤細(xì)胞因具有快速、準(zhǔn)確、簡便、易行以及患者痛苦少等優(yōu)點(diǎn),在臨床上得以廣泛應(yīng)用。然而脫落細(xì)胞學(xué)檢查中HE涂片質(zhì)量是制約其陽性檢出率的關(guān)鍵因素之一,加強(qiáng)涂片制片過程的質(zhì)控,引用新制片技術(shù)(如TCT的應(yīng)用及細(xì)胞塊的制備),可顯著提高其陽性檢出率和分型診斷的準(zhǔn)確性[8],且在日常細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制片中,常有血性胸腹水標(biāo)本,傳統(tǒng)涂片法因存在大量血液和蛋白液[9],造成涂片厚薄不均,細(xì)胞重疊,染色效果不佳,常致涂片在染色水洗過程中掉片,使觀察結(jié)果受到限制和影響,干擾了脫落細(xì)胞學(xué)的診斷。由于紅細(xì)胞的大量存在,會(huì)掩蓋部分腫瘤細(xì)胞,極易造成漏診或誤診。我科經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),采用新柏氏細(xì)胞清洗液對(duì)血性胸腹水進(jìn)行溶血、去黏液及蛋白液等處理,再結(jié)合TCT法制片,發(fā)現(xiàn)涂片中紅細(xì)胞量明顯減少,腫瘤細(xì)胞相對(duì)集中,分布均勻,形態(tài)清晰,明顯提高血性胸腹水中腫瘤細(xì)胞的檢出率。

TCT法制片也有缺點(diǎn),如反應(yīng)性增生或退變的間皮細(xì)胞與某些腫瘤細(xì)胞尤其是腺癌細(xì)胞在形態(tài)上相似, 以及惡性腫瘤細(xì)胞的分型僅靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)很難做出正確的診斷,且惡性腫瘤在組織形態(tài)上時(shí)常無法區(qū)分其來源和發(fā)生部位,因此我科聯(lián)合胸腹水沉渣石蠟包埋切片法。該法因多次離心而增加了細(xì)胞數(shù)量,切片上細(xì)胞更加集中,而且細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加清晰。細(xì)胞塊制成后可以連續(xù)切片,避免了單一涂片取材的局限性。與常規(guī)組織切片相比,無明顯差異,可根據(jù)診斷及研究需要開展類似組織學(xué)的各種檢查[10],并能長期保存。與涂片及TCT相比,不會(huì)出現(xiàn)掉片,使染色定位準(zhǔn)確、可靠,背景清晰,易于作出準(zhǔn)確診斷,可得到相對(duì)一致的細(xì)胞學(xué)切片[11],彌補(bǔ)TCT制片的不足。

血性胸腹水在檢測過程中,需要注意以下事項(xiàng):①標(biāo)本30 min內(nèi)送檢，60 min內(nèi)完成標(biāo)本處理和固定為脫落細(xì)胞學(xué)檢查的必要條件, 增加送檢次數(shù)可提高腫瘤細(xì)胞檢出率。②離心后需用吸管輕輕吸去上清液，勿用傾倒法。③血性胸腹水中紅細(xì)胞含量高，可在新柏氏細(xì)胞清洗液中適當(dāng)增加冰乙酸量。④細(xì)胞塊固定液的選擇，使用4%中性甲醛切片定位準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)，且重復(fù)性高。⑤胸腹水沉渣提取時(shí)，離心力選用2 000 r/min，能有效權(quán)衡細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞損傷程度。

綜上所述,血性胸腹水經(jīng)過溶血、去黏液及蛋白液等處理,并采用TCT制片及細(xì)胞塊的制備結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等診斷技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,可使陽性檢出率大大提高,同時(shí)其細(xì)胞學(xué)診斷還可以用于判斷腫瘤的來源部位、分型、分期甚至評(píng)估預(yù)后等,為臨床診治提供重要依據(jù)[12-14],值得在實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

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1007-6611(2017)10-1079-04

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中國人民解放軍第一七五醫(yī)院青年苗圃基金資助項(xiàng)目(16Y020)

朱啟淦,男,1988-03生,學(xué)士,主管技師,E-mail:694095459@qq.com

2017-06-01