張 靜,吳秀娟,普雄明*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在卡波西肉瘤中的表達

張 靜1,吳秀娟2,普雄明2*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

目的 探索kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在卡波西肉瘤(KS)組織中的表達意義。 方法 通過在線miRNA靶基因軟件Mirbase、Miranda和Targetscan尋找kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。通過GO和KEGG分析靶基因的信號通路及通路上的關(guān)鍵基因。使用免疫組化的方法檢測靶基因、關(guān)鍵基因(kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因)在卡波西肉瘤組織的表達。 結(jié)果 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因為CDKN1A,CDKN1A信號通路為Cell cycle通路,通路下游關(guān)鍵基因為CyclinD1、CyclinE。CDKN1A、CyclinD1、Cyclin E在腫瘤組織與瘤旁組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),CDKN1A在卡波西肉瘤中的陽性表達率低于瘤旁組織(P<0.05),CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的陽性表達率高于瘤旁組織(P<0.05);在KS中CyclinD1與年齡相關(guān)(P<0.05),CyclinE與民族相關(guān)(P<0.05);在KS中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負相關(guān)(P<0.05)。CyclinD1與CyclinE呈正相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論 kshv-mir-k12-1-5p的相關(guān)基因:CDKN1A、CyclinD1、CyclinE表達異常在KS發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。

卡波西肉瘤; kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

卡波西肉瘤(Kaposis sarcoma, KS)是血管瘤樣結(jié)構(gòu)、梭形細胞增生的惡性腫瘤[1],臨床有4種分型:經(jīng)典型、非洲型、艾滋病病毒(AIDS)相關(guān)型及免疫抑制型。其中經(jīng)典型及艾滋病病毒相關(guān)型在我國新疆地區(qū)報告較多,主要見于維吾爾族、哈薩克族等少數(shù)民族?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)病毒(KSHV)是KS發(fā)生的必需因素和主要因素。KSHV通過編碼的miRNA調(diào)控宿主的生存環(huán)境、宿主細胞的細胞周期和沉默靶基因等諸多途徑影響感染細胞的分化狀態(tài),進而影響宿主細胞的細胞周期,從而促進KSHV誘導(dǎo)KS發(fā)生。在既往的研究中,通過對KS miRNA差異表達譜的篩選和驗證得出在KS中kshv-mir-k12-1-5p表達明顯上調(diào)[2]。本文從病因上研究與kshv-mir-k12-1-5p相關(guān)基因在KS的表達,為研究kshv-mir-k12-1-5p對KS的調(diào)控作用做基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院及烏魯木齊市友誼醫(yī)院病理科卡波西肉瘤患者腫瘤和瘤旁組織40對石蠟組織,使用免疫組化方法對石蠟組織進行檢測。

1.2 主要試劑

試劑來源:購自福州邁新有限公司免疫組化一抗:CDKN1A(細胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑1A)、CyclinD1(細胞周期蛋白D1)、CyclinE(細胞周期蛋白E)。

1.3 確定靶基因

通過在線miRNA靶基因軟件Mirbase,Miranda和Targetscan確定kshv-mir-k12-1-5p靶基因。Mirbase、Miranda、Targetscan網(wǎng)址如下:Mirbase: http://www.mirbase.org/,Miranda: http://www.microrna.org/microrna/home.do/,Targetscan: http://www.targetscan.org/vert-60/。

1.4 分析信號通路及關(guān)鍵基因

通過 GO 和 KEGG 分析靶基因的通路及通路上的關(guān)鍵基因。GO:http://www.geneontology.org,KEGG:http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html。

1.5 免疫組化檢測

使用免疫組化方法檢測石蠟組織中kshv-mir-k12-1-5p的相關(guān)基因:靶基因(CDKN1A)、信號通路關(guān)鍵基因(CyclinD1、CyclinE)的表達情況并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。

1.6 結(jié)果判斷

每張切片隨機選取10個高倍視野(40×10倍),每個視野500-1 000 個細胞。從以下兩方面對切片進行計分: ① 染色強度: 0 分為無著色,1 分為淡黃色,2 分為棕黃色,3 分為棕褐色; ② 陽性細胞數(shù): 1 分為1%-10%,2 分為 11%-50%,3 分為 51%-75%,4 分為≥76%。將兩項評分相乘得出最終結(jié)果，陰性(-): < 3 分,陽性(+):≥3 分。CDKN1A、CyclinD1為腫瘤梭形細胞核陽性著色。CyclinE為腫瘤梭形細胞核/細胞漿陽性著色。高年資病理醫(yī)師進行結(jié)果判定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料的差異性及相關(guān)性采用卡方檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 kshv-mir-k12-1-5p的靶基因

通過靶基因軟件確定CDKN1A基因為kshv-mir-k12-1-5p的靶基因。

2.2 kshv-mir-k12-1-5p的信號通路及通路上關(guān)鍵基因

通過GO和KEGG分析得出kshv-mir-k12-1-5p及靶基因CDKN1A參與Cell cycle信號通路,CyclinD1、CyclinE為通路下游的關(guān)鍵基因。

2.3 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤與瘤旁組織中的表達

卡波西肉瘤與瘤旁組織中CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的表達情況見圖1。CDKN1A在卡波西肉瘤的陽性表達率(30.0%)明顯低于瘤旁組織中的陽性表達率(75.0%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);CyclinD1在卡波西肉瘤的陽性表達率(80.0%)明顯高于瘤旁組織中的陽性表達率(40.0%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);CyclinE在卡波西肉瘤的陽性表達率明顯高于瘤旁組織中的陽性表達率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(82.5%vs37.5%，P<0.05，見表1)。

表1CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤及瘤旁組織中的表達

Table1ExpressionofCDKN1A，CyclinD1，CyclinEinKSandadjacenttissue

類型nCDKN1ACyclinD1CyclinE+χ2P+χ2P+χ2P腫瘤4012(30.0)16.240.0032(80.0)13.330.0033(82.5)16.880.00瘤旁4030(75.0)16(40.0)15(37.5)

2.4 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE與卡波西肉瘤臨床參數(shù)的關(guān)系分析

分析CDKN1A、CyclinD1、CyclinE與患者性別、發(fā)病年齡、民族、臨床類型的關(guān)系。CyclinD1與年齡有關(guān)(P<0.05),CyclinE與民族有關(guān)(P<0.05,見表2)。

A. CyclinD1在腫瘤細胞核陽性表達;B. CDKN1A在腫瘤細胞核陽性表達;C. CyclinE在腫瘤細胞核陽性表達; D. CyclinD1在瘤旁組織陰性表達;E. CDKN1A在瘤旁組織細胞核陽性表達;F. CyclinE在瘤旁組織陰性表達圖1 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中免疫組化染色 (40×10)Figure 1 Expression of CDKN1A,CyclinD1,CyclinE in KS by immunohistochemistry (40×10)

表2CDKN1A、CyclinD1、CyclinE同卡波西肉瘤臨床參數(shù)的關(guān)系

Table2TherelationshipsofCDKN1A,CyclinD1,CyclinEwiththeclinicalfeaturesofKS

因素nCDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P+-χ2P 性別1.090.300.001.000.620.43 男35926287305 女5324132 年齡0.050.835.010.030.020.965 >4526719242224 ≤45145986113 民族0.001.000.360.554.180.04 維族351025296314 其他5233223 臨床類型0.001.001.230.271.230.27 CKS4133122 AIDS-KS361125297315

2.5 CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在卡波西肉瘤中的相關(guān)性分析

在KS中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負相關(guān)(P<0.05,見表3)。CyclinD1與CyclinE呈正相關(guān)(P<0.05,見表4)。

表3卡波西肉瘤中CDKN1A與CyclinD1、CyclinE的相關(guān)性

Table3ThecorrelationwithCDKN1AandCyclinD1,CyclinEinKS

CDKN1ACyclinD1CyclinE+-χ2P+-χ2P陽性667.150.007754.750.029陰性262262

表4卡波西肉瘤中CyclinD1與CyclinE的相關(guān)性

Table4ThecorrelationwithCyclinD1andCyclinEinKS

CyclinECyclinD1+-χ2P陽性2934.770.029陰性44

3 討論

卡波西肉瘤相關(guān)病毒(KSHV,即人皰疹病毒8型)[2]首先從AIDS相關(guān)型KS患者的肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)。隨后,在各型的KS中均發(fā)現(xiàn)了KSHV的高表達。KSHV與KS的發(fā)生關(guān)系密切。KSHV致瘤過程主要發(fā)生在病毒感染的潛伏期[3]。

本文通過在線miRNA靶基因軟件確定kshv-mir-k12-1-5p的靶基因CDKN1A。通過GO和KEGG分析kshv-mir-k12-1-5p和靶基因的信號通路為Cell cycle信號通路及通路下游的關(guān)鍵基因CyclinD1、CyclinE。因此，CDKN1A、CyclinD1、CyclinE為kshv-mir-k12-1-5p的相關(guān)基因,共同參與細胞周期的調(diào)控。

細胞周期異常調(diào)控導(dǎo)致細胞異常增殖,是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。細胞周期(cell cycle)信號通路中的關(guān)鍵基因CDKN1A、CyclinD1、CyclinE的異常表達和卡波西肉瘤的發(fā)生密不可分。CyclinE和CyclinDl是細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的正性重要調(diào)控因子。表達上調(diào)使G1/S轉(zhuǎn)換時間變短,促進了細胞周期進程,細胞增殖過度,最終細胞癌變。本實驗中CyclinD1、CyclinE在KS中高表達?？úㄎ魅饬鼋M明顯高于對照組。CDKN1的生物學(xué)功能是抑制細胞生長、DNA復(fù)制;調(diào)控發(fā)育、分化等過程,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實驗中CDKN1A陽性表達率在卡波西肉瘤組明顯低于對照組。因為CDKN1A是一種罕見突變的抑癌基因,它在KS發(fā)展過程中,逐漸失去對細胞增殖的抑制作用,其蛋白水平降低參與KS的發(fā)生發(fā)展。本實驗在KS中CyclinD1與年齡相關(guān)(P<0.05);CyclinE與民族相關(guān)(P<0.05);CDKN1A與CyclinD1、CyclinE均呈負相關(guān);CyclinD1與CyclinE呈正相關(guān)。正常情況下CDKN1A的表達對停滯增長起重要作用。CDKN1A表達上調(diào)可抑制CDK的活性,抑制CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物及CyclinE-CDK2復(fù)合物活性,使蛋白表達下調(diào);表達受抑。細胞不能進入S期,導(dǎo)致細胞周期停滯。研究證實CyclinD1、CyclinE在多種腫瘤中出現(xiàn)過度表達[10]。兩者具有協(xié)同作用,和本實驗結(jié)論相似。因為在腫瘤的進展中,CDKN1A表達下調(diào),對CyclinD1、CyclinE的抑制減弱,導(dǎo)致CyclinD1、CyclinE表達失控。

本研究為kshv-mir-k12-1-5p通過信號通路調(diào)控靶基因及關(guān)鍵基因的研究做基礎(chǔ),接下來將構(gòu)建kshv-mir-k12-1-5pmimic、kshv-mir-k12-1-5p inhibitor等,轉(zhuǎn)染到卡波西肉瘤細胞株中,研究過表達或低表達kshv-mir-k12-1-5p后,采用qRT-PCR及WB檢測信號通路靶基因、關(guān)鍵基因(CDKN1A、CyclinD1、CyclinE)的mRNA和蛋白表達情況,明確kshv-mir-k12-1-5p對信號通路主要的調(diào)控作用，確定kshv-mir-k12-1-5p能否作為一個藥物靶標(biāo)。因此，先行檢測在未調(diào)控下CDKN1A、CyclinD1、CyclinE在KS中的表達,了解其表達的意義。

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Expressionofkshv-mir-k12-1-5p-relatedgeneinKaposi’ssarcoma

ZHANG Jing1，WU Xiujuan2，PU Xiongming2*

(1DepartmentofPathology,AffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofDermatology,People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion;*Correspondingauthor,E-mail:puxiongming@126.com)

ObjectiveTo explore the expression of kshv-mir-k12-1-5p-related gene in Kaposi’s sarcoma (KS) and its significance.MethodsThe kshv-mir-k12-1-5p target gene was detected through Mirbase, Miranda and Targetscan of the online miRNA target gene software. GO and KEGG were used to analyze signaling pathway and key gene in the pathway of the target gene. The expression of target gene and key gene(kshv-mir-k12-1-5p-related gene) was detected in Kaposi’s sarcoma by immunohistochemistry.ResultsThe target gene of kshv-mir-k12-1-5p was CDKN1A, CDKN1A signaling pathway was the cell cycle pathway, and the downstream key genes were CyclinD1 and CyclinE. Positive expression rate of CDKN1A in KS was lower in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05). Positive expression rates of CyclinD1,CyclinE in KS were higher in tumor tissues than that of adjacent tissues(P<0.05).Expression of CyclinD1 in KS was associated with age(P<0.05). Expression of CyclinE in KS was associated with nation(P<0.05). There was a negative correlation between the expression of CDKN1A and CyclinD1,CyclinE in KS(P<0.05).There was a positive correlation between the expression of CyclinD1 and CyclinE in KS(P<0.05).ConclusionThe expression of kshv-mir-k12-1-5p-related genes CDKN1A, CyclinD1, and CyclinE may play an important role in the occurrence and development of KS.

Kaposis sarcoma； kshv-mir-k12-1-5p; CDKN1A; CyclinD1; CyclinE

R739.5

A

1007-6611(2017)10-1044-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.014

國家自然科學(xué)基金資助項目(81660454);新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院級課題(ZYY201702)

張靜,女,1979-12生,在讀博士,主治醫(yī)師

2017-07-10