鄭 戈，袁一夢

原發(fā)性干燥綜合征患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達(dá)及臨床意義

鄭 戈，袁一夢

目的研究原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren's syndrome, PSS)患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達(dá)水平及臨床意義。方法選擇本院2012年3月—2015年3月收治的50例PSS患者(觀察組)，再根據(jù)疾病活動情況及病情程度分為活動期亞組(30例)、非活動期亞組(20例)和單系統(tǒng)亞組(29例)、多系統(tǒng)亞組(21例)。選擇同期我院行體檢健康者50例作為對照組。兩組均行免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)檢測外周靜脈血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達(dá)情況；比較所有納入研究者間OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1的表達(dá)情況，并記錄觀察組患者治療前后上述指標(biāo)的表達(dá)情況。結(jié)果觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+和CD4+PD-1+及SPD-1表達(dá)均高于對照組，CD14+PD-L1+表達(dá)低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對觀察組亞組進(jìn)行分析，活動期亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+及SPD-1表達(dá)顯著高于非活動期亞組(P<0.05或P<0.01)；單系統(tǒng)亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+及SPD-1表達(dá)明顯低于多系統(tǒng)亞組(P<0.05或P<0.01)。治療前觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+和CD4+PD-1+表達(dá)顯著高于治療后(P<0.05)；CD8+PD-1+、CD14+PD-L1+及SPD-1表達(dá)治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論PSS患者外周靜脈血中OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的異常表達(dá)，和疾病活動情況、組織損害情況有關(guān)聯(lián)，可作為了解病情活動度和嚴(yán)重程度的檢測指標(biāo)。

干燥綜合征；病情評估；OX40；OX40L；PD-1；PD-L1

原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren's syndrome, PSS)是一種自身免疫性疾病，主要以外分泌腺體(淚腺、唾液腺)損傷為特征，眼淚和唾液分泌減少，導(dǎo)致患者出現(xiàn)眼干和口干，同時會累及肺臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)[1-3]。T細(xì)胞、B細(xì)胞不正常激活和PSS的發(fā)生密切相關(guān)，共刺激信號在T細(xì)胞活化過程中起著直接作用。OX40、OX40配體(OX40L)是腫瘤壞死因子超家族成員，OX40表達(dá)于CD4+T細(xì)胞表層，OX40L表達(dá)于激活的B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，能使T細(xì)胞增加和提供刺激信號，阻止T細(xì)胞的生成；還可使Th2細(xì)胞生成細(xì)胞因子，B細(xì)胞成熟增殖分化為漿細(xì)胞，從而導(dǎo)致抗體生成[4-7]。程序性死亡受體1(PD-1)和程序性死亡受體-配體1(PD-L1)是人體重要的免疫抑制分子，是CD28家族的共刺激分子，主要表達(dá)于活化T細(xì)胞的表層；PD-1在CD28家族成員中表達(dá)較多，PD-L1大部分激發(fā)于抗原提呈細(xì)胞表層，主要以B細(xì)胞和單核細(xì)胞構(gòu)成，能傳遞抑制信號，降低T細(xì)胞的增長[8]。研究表明，PD-1、PD-L1共刺激信號在人體許多免疫性疾病的發(fā)展過程中起著重要的作用[9]。研究表明，可溶程序性死亡受體1(SPD-1)具有完全的細(xì)胞外端，能夠和PD-1相結(jié)合，在臨床上被認(rèn)為是PD-1和程序性死亡受體-配體的阻止劑[10-11]。本研究探討PSS患者外周血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達(dá)水平和臨床意義，以期為PSS患者病情評估尋找有意義的檢測指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1納入對象及分組 選擇本院2012年3月—2015年3月收治的50例PSS作為觀察組，均符合2002年國際衛(wèi)生組織頒布的PSS診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，其中男2例(4.0%)，女48例(96.0%)；年齡35～65(47.51±11.51)歲。其中10例為本次入院初診者。同時選取我院體檢健康且自愿參與本研究的志愿者50例為對照組，其中男3例(6.0%)，女47例(94.0%)；年齡34～67(47.61±12.21)歲。兩組在性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

進(jìn)一步將觀察組按照不同病情程度進(jìn)行亞組分組：①依據(jù)2009年歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)PSS活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)將觀察組再分為活動期亞組30例和非活動期亞組20例，該評分共9個類目(全身病癥、關(guān)節(jié)病癥、淋巴結(jié)、腺體、關(guān)節(jié)、腎臟病變、肺部、外周神經(jīng)病變和骨骼肌情況)12個方面，每方面分為4個檔次(不存在活動、輕微活動、中度活動和高度活動)，測評分值≥2分為活動期，<2分為非活動期。②根據(jù)器官累及情況[13]將觀察組再分為單純累及外分泌腺體亞組(單系統(tǒng)亞組)29例和多系統(tǒng)累及外分泌腺體亞組(多系統(tǒng)亞組)21例。

1.2研究方法

1.2.1OX40、OX40L、PD-1和PD-L1檢測：采集研究對象清晨空腹靜脈血3 ml，應(yīng)用CD004-1流式細(xì)胞儀，采用EDTA-K2鉀鹽抗凝法檢測OX40、OX40L、PD-1和PD-L1的表達(dá)。試劑盒購自上海銳賽生物有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2SPD-1檢測：采集研究對象清晨空腹靜脈血5 ml，1500～1800 r/min離心5 min，取上清，于-40℃的冰箱中保存。采用SPD-1 ELISA檢驗試劑盒(購于上海羽朵生物科技有限公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。反應(yīng)后采用酶標(biāo)儀檢測400～500 nm位置的吸光度值。

1.3觀測指標(biāo) 比較兩組及各亞組外周靜脈血OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的表達(dá)情況；并比較觀察組患者治療前和治療后2周時各項指標(biāo)表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1兩組觀測指標(biāo)比較 觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+和CD8+PD-1+及SPD-1表達(dá)均高于對照組，CD14+PD-L1+表達(dá)明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 原發(fā)性干燥綜合征與健康對照者OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達(dá)情況比較

注：觀察組為原發(fā)性干燥綜合征患者組，對照組為體檢健康者組

2.2PSS活動期與非活動期患者觀測指標(biāo)比較 PSS活動期亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+及SPD-1表達(dá)顯著高于非活動期亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 原發(fā)性干燥綜合征活動期和非活動期患者OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達(dá)比較

2.3PSS不同系統(tǒng)累及患者觀測指標(biāo)比較 PSS單系統(tǒng)亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+及SPD-1表達(dá)明顯低于多系統(tǒng)亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 原發(fā)性干燥綜合征不同系統(tǒng)累及者OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達(dá)比較

2.4PSS患者治療前后觀測指標(biāo)比較 觀察組患者治療前CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+和CD4+PD-1+表達(dá)顯著高于治療后，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD8+PD-1+、CD14+PD-L1+及SPD-1表達(dá)治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 原發(fā)性干燥綜合征患者治療前后OX40、OX40L、PD-1、PD-L1及SPD-1表達(dá)水平比較

3 討論

PSS患者血清中出現(xiàn)抗體和異常γ-球蛋白血癥的具體病理機制還未研究清楚，但相關(guān)研究認(rèn)為與CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞不正常激活有密切的聯(lián)系[14-16]。共刺激信號在T細(xì)胞的激發(fā)進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，負(fù)刺激信號強度的升高能阻止人體發(fā)生反應(yīng)變化的T細(xì)胞激發(fā)和增長，阻止免疫性疾病的發(fā)生[17]。OX40、OX40L超家族屬正共刺激分子，相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)證明其能夠促進(jìn)T細(xì)胞的移動、增長、繁殖和分解，同時能記錄T細(xì)胞的形成，阻止T細(xì)胞死亡，并且T細(xì)胞能夠幫助B細(xì)胞的生長成熟和自身抗體的形成[18-19]。OX40和OX40L水平的明顯升高和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthrtis， RA)、過敏性哮喘等自身免疫性疾病的存在和發(fā)展有著緊密的聯(lián)系[19-20]。近年來相關(guān)研究表明，給膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型小鼠注射OX40單克隆抗體時，能夠阻止γ干擾素(IFN-γ)和IgG的分泌，甚至能對T細(xì)胞進(jìn)行極化，對CIA小鼠模型的RA癥狀有緩解作用，提示OX40、OX40L和自身免疫性疾病有著緊密的聯(lián)系[21]。

PD-1和PD-L1是一組負(fù)共刺激分子，PD-1主要表達(dá)于激發(fā)的抗原提呈細(xì)胞(APC)表面，能夠阻止T細(xì)胞激發(fā)白細(xì)胞介素-2(IL-2)和IFN-γ的分泌，并且能引導(dǎo)T細(xì)胞的死亡[22]。PD-1和PD-L1信號出現(xiàn)異常時，和人體發(fā)生系統(tǒng)性紅斑狼瘡、RA、胰島素依賴型糖尿病等自身免疫性疾病有著緊密的聯(lián)系[23]。在PSS患者的唾液腺體標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞中存在高表達(dá)的PD-1分子，其導(dǎo)管與腺泡肌上皮細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)，并經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證實，50%以上的患者唾液腺淋巴細(xì)胞中PD-1為高表達(dá)，60%以上的患者導(dǎo)管與腺泡肌上皮細(xì)胞中PD-L1存在高表達(dá)，進(jìn)一步提示PD-1和PD-L1的信號異常與PSS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[24-27]。

本研究觀察PSS患者的外周靜脈血T細(xì)胞、B細(xì)胞中的OX40、OX40L、PD-1和PD-L1共刺激分子的表達(dá)情況，同時依據(jù)患者的臨床特征、疾病活動情況進(jìn)行亞組分析。結(jié)果顯示：①觀察組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+和CD8+PD-1+及SPD-1表達(dá)均高于對照組，CD14+PD-L1+明顯低于對照組，說明PSS患者T細(xì)胞中的OX40、PD-1明顯上升，并且血清中的OX40L、PD-L1也顯著上升，提示4種因子和PSS的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。②活動期亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+、CD4+PD-1+表達(dá)顯著高于非活動期亞組，說明上述因子水平的高低與疾病的活動情況密切相關(guān)。③單系統(tǒng)亞組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+表達(dá)明顯低于多系統(tǒng)亞組，說明上述因子水平的高低與PSS臟器損害情況密切相關(guān)。

本研究表示：觀察組SPD-1表達(dá)均高于對照組，非活動期亞組患者SPD-1表達(dá)較活動期亞組患者明顯降低，單系統(tǒng)亞組患者SPD-1表達(dá)明顯低于多系統(tǒng)亞組患者，可推測PSS患者分泌的SPD-1和多余的PD-L1相組合，阻止了T細(xì)胞表層的PD-1和PD-L結(jié)合，從而使激發(fā)的T細(xì)胞“躲過”了PD-1和PD-L的控制信號，使T細(xì)胞一直激發(fā)和增長，人體免疫應(yīng)答持續(xù)，從而加重了PSS的免疫病理損傷。針對PSS的治療能使T細(xì)胞PD-1表達(dá)下降，使患者病情得到緩解，但SPD-1和治療效果無相關(guān)性[28-29]。本研究PSS患者治療后CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+和CD4+PD-1+表達(dá)顯著低于治療前，說明治療后能夠減少患者自身反應(yīng)，阻止了T細(xì)胞的激發(fā)和B細(xì)胞的分裂，自身抗體分泌情況減少，臨床癥狀緩解。

綜上，PSS患者外周靜脈血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1的異常表達(dá)，和疾病活動情況、組織損害情況有關(guān)聯(lián)，提示可將OX40、OX40L、PD-1、PD-L1和SPD-1作為PSS的臨床免疫指標(biāo)，但其病理機制還需進(jìn)一步深入研究。

[1] 江維,趙毅,林輝,等.艾拉莫德治療原發(fā)性干燥綜合征療效觀察[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(6):719-721,724.

[2] 杜雪梅,蘇毅,王曉燕,等.小鼠來源的OX40融合蛋白的表達(dá)鑒定及優(yōu)化表達(dá)[J].山東醫(yī)藥,2015,58(35):25-27,28.

[3] 劉鵬,汪茜,姜樹軍.原發(fā)性干燥綜合征合并周圍神經(jīng)損害臨床及病理特點分析[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,21(7):536-538.

[4] 黃志芳,李新倫,李紅霞,等.Th17細(xì)胞及白介素-17在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用[J].空軍醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(1):28-30.

[5] 袁正洲,李作孝,馬勛泰,等.來氟米特對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠T細(xì)胞亞群及Th1型細(xì)胞因子的影響[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(1):19-22.

[6] Awada A, Nicaise C, Ena S,etal. Potential involvement of the IL-33-ST2 axis in the pathogenesis of primary Sjogren's syndrome[J].Ann Rheum Dis, 2014,73(6):1259-1263.

[7] 姜德訓(xùn),白云靜,趙麗萍,等.艾拉莫德聯(lián)合治療原發(fā)性干燥綜合征臨床效果觀察[J].臨床誤診誤治,2016,29(8):90-93.

[8] 陳雪雯,李桂珍,趙俊芳,等.外周血 OX40/OX40L 及抗 C1q 抗體水平對狼瘡腎炎的診斷價值[J].山東醫(yī)藥,2015,58(13):31-32.

[9] 黃萍,劉芬,曾振國,等.微小RNA-146a調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6的表達(dá)[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué),2014,26(5):300-303.

[10] 蔡尚,田野,徐波,等.放射治療聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1通路腫瘤免疫治療的新進(jìn)展[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2016,36(3):235-240.

[11] 王笑顏,鄒偉華,吳泉,等.原發(fā)性干燥綜合征患者IL-17測定及臨床意義[J].中華全科醫(yī)學(xué),2014,12(4):620-621.

[12] Baldini C, Pepe P, Quartuccio L,etal. Primary Sjogren's syndrome as a multi-organ disease: impact of the serological profile on the clinical presentation of the disease in a large cohort of Italian patients[J].Rheumatology (Oxford), 2014,53(5):839-844.

[13] 趙俊山,王勤,溫鵬強,等.白細(xì)胞介素35+調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞在川崎病免疫發(fā)病機制中的作用[J].中華實用兒科臨床雜志,2015,30(9):662-666.

[14] Kyriakidis N C, Kapsogeorgou E K, Tzioufas A G. A comprehensive review of autoantibodies in primary Sjogren's syndrome: clinical phenotypes and regulatory mechanisms[J].J Autoimmun, 2014,51:67-74.

[15] 逯朝陽,嚴(yán)金川,伍超,等.OX40-OX40L相互作用對小鼠平滑肌細(xì)胞親環(huán)素A表達(dá)的影響[J].中國動脈硬化雜志,2014,22(6):558-562.

[16] 苗同艷,宮曉飛,李春穎,等.熱毒清口服液對老年肺炎大鼠血清中白細(xì)胞介素1β和腫瘤壞死因子α水平的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,30(2):611-613.

[17] 馬祥,劉洪,李群英,等.地塞米松對哮喘小鼠CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及IL-4 TGF-β水平的影響[J].西部醫(yī)學(xué),2016,28(6):768-771,777.

[18] Mavragani C P, Fragoulis G E, Rontogianni D,etal. Elevated IgG4 serum levels among primary Sjogren's syndrome patients: do they unmask underlying IgG4-related disease?[J].Arthritis Care Res (Hoboken), 2014,66(5):773-777.

[19] 馬繼慈.腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體在前列腺癌治療中的研究進(jìn)展[J].中華男科學(xué)雜志,2015,21(10):941-944.

[20] 吳巧珍,湯穎,張劍峰,等.甘草酸對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響機制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(42):3338-3344.

[21] Meiners P M, Vissink A, Kroese F G,etal. Abatacept treatment reduces disease activity in early primary Sjogren's syndrome (open-label proof of concept ASAP study)[J].Ann Rheum Dis, 2014,73(7):1393-1396.

[22] 諶雙君,龐國進(jìn),張棟,等.OX40在免疫耐受中的調(diào)節(jié)作用[J].國際免疫學(xué)雜志,2015,38(4):362-364.

[23] Liang Y, Yang Z, Qin B,etal. Primary Sjogren's syndrome and malignancy risk: a systematic review and meta-analysis[J].Ann Rheum Dis, 2014,73(6):1151-1156.

[24] 崔金元,陶凱雄.生物標(biāo)志物在阻斷PD-1/PD-L1通路治療腫瘤中的預(yù)測性作用[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2016,43(6):452-454.

[25] Nezos A, Papageorgiou A, Fragoulis G,etal. B-cell activating factor genetic variants in lymphomagenesis associated with primary Sjogren's syndrome[J].J Autoimmun, 2014,51:89-98.

[26] 王麗娜,張薇.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜分析[J].西部醫(yī)學(xué),2014,26(12):1637-1640.

[27] 孔冰,劉艷輝.PD-1/PD-L1在膠質(zhì)瘤研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2016,15(3):284-285.

[28] 陳雪雯,李桂珍,趙俊芳,等.外周血 OX40/OX40L 及抗 C1q 抗體水平對狼瘡腎炎的診斷價值[J].山東醫(yī)藥,2015,58(13):31-32.

[29] Yan J, Li Y, Wang Z,etal. Effects of OX40-OX40 ligand interaction on the levels of ROS and Cyclophilin A in C57BL/6J mice atherogenesis[J].Int J Cardiol, 2014,176(2):405-412.

ExpressionsandClinicalSignificancesofOX40,OX40L,PD-1,PD-L1andSPD-1inPeripheralBloodofPatientswithPrimarySjogren'sSyndrome

ZHENG Ge， YUAN Yi-meng

(Department of Blood Rheumatology, the First People's Hospital of Zigong City, Zigong, Sichuan 643000, China)

ObjectiveTo investigate expressions and clinical significances of OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 in peripheral blood of patients with primary Sjogren's syndrome (PSS).MethodsA total of 50 patients with PSS (observation group) admitted during March 2012 and March 2015 were divided into active period subgroup (n=30) and inactivity period subgroup (n=20) according to disease activity conditions, and single system subgroup (n=29) and multisystemic subgroup (n=21) according to active stages. Other 50 healthy people taking medical examinations at the same period were selected as control group. OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 expressions in peripheral venous blood were detected by immunofluorescence labeling and flow cytometry methods in two groups. OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 expressions were compared in groups and subgroups, and changes of the above indexes before and after treatment were recorded in observation group.ResultsIn observation group, CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+, CD4+PD-1+and CD4+PD-1L+and SPD-1 expressions were significantly higher, while CD14+PD-L1+was significantly lower than those in control group (P<0.01). CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+, CD4+PD-1+and SPD-1 expressions in active period subgroup were significantly higher than those in inactivity period subgroup (P<0.05 orP<0.01); CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+and SPD-1 expressions in single system subgroup were significantly lower than those in multisystemic subgroup (P<0.05 orP<0.01). In 10 preliminary diagnosis patients in observation group, CD4+OX40+, CD14+OX40L+, CD19+OX40L+and CD4+PD-1+expressions before treatment were significantly higher than those after treatment (P<0.05); there were no significant differences in CD8+PD-1+, CD14+PD-L1+and SPD-1 expression between before and after treatment (P>0.05).ConclusionAbnormal expressions of OX40, OX40L, PD-1, PD-L1 and SPD-1 in peripheral venous blood of PSS patients relate to disease activity and tissue damage, and the expressions can be used as detection indexes for learning disease activity conditions and severe degree.

Sjogren's syndrome; Pathogenetic condition； OX40； OX40L； PD-1； PD-L1

四川省衛(wèi)生廳科研課題資助(120003)

643000 四川 自貢，自貢市第一人民醫(yī)院血液風(fēng)濕科

R593.22

A

1002-3429(2017)10-0083-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.10.028

2017-01-12 修回時間：2017-05-14)