馮友仁， 劉寶生， 白鵬華

(天津市植物保護研究所，天津 300384)

新型月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件及毒素化學成分分析

馮友仁， 劉寶生， 白鵬華

(天津市植物保護研究所，天津 300384)

為深入揭示月季葉枯病菌(Pestalotiopsisclavispora)的致病機理，本試驗研究了其最優(yōu)產(chǎn)毒條件，測定了含毒濾液中蛋白質(zhì)和可溶性糖含量，并借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對月季葉枯病菌所產(chǎn)毒素中的化學成分進行了分析。結(jié)果表明，不同產(chǎn)毒條件下病菌產(chǎn)毒能力存在明顯差異，最佳產(chǎn)毒條件是： pH 7.0的查彼+液體培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度25℃、晝夜交替條件、連續(xù)振蕩(120 r/min)培養(yǎng)25 d。含毒濾液的蛋白質(zhì)濃度為180 μg/mL，可溶性糖含量為2 057.25 μg/mL，主要化學成分為三氧硅烷、十甲基環(huán)五硅氧烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷、1,4二甲氧基-6,7,8,9四氫環(huán)庚酮、戊二酸、氨基甲酸甲酯。

新型月季葉枯病菌；毒素；產(chǎn)毒條件；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；化學成分

月季(RosachinensisJacq.)屬薔薇科薔薇屬，原產(chǎn)于中國，因其花朵碩大、花瓣鮮艷闊厚、花香清新醉人而深受人們喜愛，被我國多個城市定義為市花[1]，在城市園林綠化中被廣泛應(yīng)用。但在種植生長過程中，易受到病蟲危害，出現(xiàn)生長不良、掉葉、萎蔫、甚至死亡的現(xiàn)象，既影響觀賞效果，又降低了月季本身的經(jīng)濟價值[2]。

2013年在天津市新發(fā)現(xiàn)的月季葉枯病[3]，于2014年5—6月在天津市西青區(qū)某大型花圃全面爆發(fā)，發(fā)病率達到60%以上，引起了月季栽培人員和園林部門的高度重視。 新型月季葉枯病是由半知菌類黑盤孢目黑盤孢科暗色多孢族盤多毛孢屬棒狀擬盤多毛孢Pestalotiopsisclavispora(Arth.)Stey.引起的真菌性病害。病害多發(fā)自月季基部葉片，造成老熟葉片嚴重脫落。由于該病害在天津地區(qū)屬新型病害，有效的防治策略及方法尚不成熟，因此該病害在天津地區(qū)有逐年加重趨勢[4]。

毒素是指由植物病原菌代謝產(chǎn)生的、在生理濃度范圍內(nèi)即可干擾植物正常生理功能、對植物有毒害作用的非酶類化合物[5]。前人研究表明，不同培養(yǎng)基成分對病原菌產(chǎn)毒影響顯著，培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液酸堿度、光照條件等也會造成病原菌產(chǎn)毒能力出現(xiàn)差異[6]。擬盤多毛孢菌分泌的毒素是導致病害發(fā)生及給寄主植物造成傷害的關(guān)鍵影響因子[7]，而有關(guān)新型月季葉枯病菌毒素的產(chǎn)生條件國內(nèi)外均鮮見報道，因此明確月季葉枯病菌分泌毒素的條件以及鑒定其毒素組分的結(jié)構(gòu)，可為深入揭示該病害的致病機理、篩選新型殺菌劑以及制定新的防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試菌株

由天津市植物保護研究所林木病蟲研究室經(jīng)分離、純化、鑒定后保藏的菌種，并進行了致病性測定。

1.2培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選

1.2.1 生物活性測定方法 將含毒原液用無菌水稀釋為原濃度的10%、20%、33.3%、50%、100%5個濃度，采用葉圓片浸漬法進行生物活性測定。接毒后的葉片置于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)(12 h/12 h晝夜更替)，連續(xù)觀察7 d并記錄結(jié)果。

葉圓片浸漬法：分別吸取不同濃度的毒素溶液2 mL于培養(yǎng)皿中(含濾紙)；取月季植株一定部位的葉片，用清水沖洗干凈，先用70%酒精表面消毒，再用無菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸干表面水分，用直徑為8 mm的圓形打孔器打取葉圓片，均腹面向下平放在培養(yǎng)皿中(每皿6片)，用保鮮袋封裝好，以滅菌的純水為對照，重復3次。

1.2.2 培養(yǎng)液種類 在無菌條件下，分別采用PD培養(yǎng)液、PS培養(yǎng)液、月季葉煎汁蔗糖培養(yǎng)液(RSB)、月季葉煎汁馬鈴薯培養(yǎng)液(RPB)、查彼+培養(yǎng)液對供試菌株進行培養(yǎng)，置于25℃搖床中，連續(xù)振蕩(120 r/min)暗培養(yǎng)25 d，重復3次。用葉圓片浸漬法進行毒素的生物活性測定(下同)。

1.2.3 培養(yǎng)時間 在無菌、25℃條件下，將接菌的pH 7.0的PD培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速120 r/min恒溫振蕩條件下分別暗培養(yǎng)10、15、20、25、30 d，重復3次。

1.2.4 培養(yǎng)溫度 在無菌條件下，將接菌的pH 7.0的PD培養(yǎng)液分別在10、15、20、25、30℃下，轉(zhuǎn)速120 r/min恒溫振蕩暗培養(yǎng)25 d，重復3次。

1.2.5 通氣量 在無菌、25℃條件下，將接菌的pH 7.0的PD培養(yǎng)液分別在以下3種方式暗培養(yǎng)25 d。靜置培養(yǎng) ：每天振蕩0.5 h；間歇振蕩培養(yǎng)：每天振蕩12 h；連續(xù)振蕩培養(yǎng)：全天振蕩24 h。轉(zhuǎn)速均為120 r/min，重復3次。

1.2.6 光照條件 在無菌、25℃條件下，將接菌的pH 7.0的PD培養(yǎng)液分別置于全光照、晝夜自然交替、全黑3種條件下，轉(zhuǎn)速120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)25 d，重復3次。

1.3月季葉枯病菌粗毒素的提取與化學性質(zhì)初步分析

1.3.1 毒素溶液的制備 用直徑為5 mm的圓形打孔器在活化過的病原菌菌落邊緣打菌絲塊，接入裝有100 mL PD培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶接4個菌塊。置于25℃恒溫、轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床中暗培養(yǎng)14 d后，將培養(yǎng)的菌液先用雙層紗布濾去菌絲，經(jīng)布氏漏斗(含2層濾紙)抽濾，濾液于低溫冷凍離心(5 000 r/min)18 min，上清液即為無菌絲的含毒濾液。在45℃低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為原體積的1/10，于5 000 r/min下離心18 min，取上清液，即為毒素原液[8]。

1.3.2 試驗試劑

①標準蛋白溶液：稱取10 mg牛血清蛋白，溶于純水中，用100 mL容量瓶定容至刻度，即為100 μg/mL標準蛋白溶液。

②考馬斯亮藍溶液：精確稱取100.0 mg考馬斯亮藍G-250溶解于50 mL 95%乙醇溶液中，加入100 mL 85%的磷酸，用純水定容到1 L，貯于棕色瓶中。

③蒽酮乙酸乙酯試劑：取1 g分析純蒽酮，溶于50 mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，放置在黑暗中。

④1%蔗糖標準液：取適量蔗糖于80℃烘箱烘至恒重，先精確稱取1.00 g溶解于少量的純水，再轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中(內(nèi)含0.5 mL濃硫酸)，最后用純水定容至100 mL。

⑤100 μg/mL蔗糖標準液：取1 mL 1%蔗糖標準液于100 mL容量瓶中，加純水稀釋至100 mL。

1.3.3 蛋白質(zhì)濃度測定 考馬斯亮藍法測定含毒濾液的蛋白質(zhì)濃度[10]。

① 標準曲線的繪制。取6支試管并編號，按表1所示分別加入100 μg/mL的標準蛋白和純水。搖勻后，各試管中都加入考馬斯亮藍G-250溶液5 mL，將試管搖勻，放置5 min，用紫外分光光度計比色測定吸光值A(chǔ)595 nm。以A595 nm為縱坐標、標準蛋白質(zhì)含量為橫坐標，繪制標準曲線。

表1 繪制標準曲線的各試劑加入量

②樣品的測定及計算。吸取含毒濾液0.2 mL、純水0.8 mL于試管中，再加入考馬斯亮藍G-250溶液5 mL，充分搖勻后，放置5 min，在595 nm下比色，測定吸光值A(chǔ)595 nm，并通過對照標準曲線查得蛋白質(zhì)含量。重復3次。

計算公式：樣品的蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)= 蛋白量x(μg)/0.2 mL。

1.3.4 可溶性糖含量測定 蒽酮比色法測定含毒濾液中可溶性糖含量。 ① 標準曲線的繪制。取6支試管并編號，按表2中的順序依次加入試劑，搖勻后立即放入沸水浴中1 min，取出后自然冷卻，在630 nm下比色，測定吸光值A(chǔ)630 nm，重復3次，以吸光值A(chǔ)630 nm為縱坐標、反應(yīng)蔗糖量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線。

表2 繪制標準曲線的各試劑加入量

② 樣品的測定及計算。將月季葉枯病菌含毒濾液稀釋5倍。在試管中依次加入稀釋后的毒素溶液0.2 mL、純水1.8 mL、蒽酮乙酸乙酯試劑0.5 mL、濃硫酸5 mL，立即放入沸水浴中1 min，取出后自然冷卻。在630 nm下比色，測得吸光值，并將平均值帶入標準曲線求出毒素濾液反應(yīng)蔗糖量。重復3次。

計算公式：樣品的可溶性糖濃度(μg/mL)=稀釋倍數(shù)×可溶性糖x(μg)/0.2 mL。

1.4氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定含毒濾液原液的化學成分

采用安捷倫7890A 氣相色譜，HP-5 石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm); 程序升溫：40℃保持1 min，8℃/min升到160℃，再以12℃/min升到250℃，后運行280℃ 1 min; 柱流量：1.0 mL/min； 進樣口溫度：250℃; 柱前壓：100 kPa；進樣量：1 μL；分流比20∶1； 載氣：高純99.999%氦氣。采用安捷倫7200型氣相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，電離源：EI；掃描質(zhì)量范圍：50～700 m/z；氣質(zhì)接口溫度：280℃；離子源溫度：230℃；采用 NIST11標準譜庫檢索定性[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1毒素生物活性測定

2.1.1 月季葉枯病菌毒素對葉圓片的影響 采用葉圓片浸漬法[9]測定不同稀釋倍數(shù)的毒素溶液對月季離體葉片的影響。月季葉圓片經(jīng)過不同濃度的毒素處理，1 d后邊緣均出現(xiàn)褪綠斑，1倍與2倍稀釋液出現(xiàn)褪綠斑的葉圓片數(shù)量增多，褪綠斑不斷擴大，顏色也相對不斷加深。4 d后所有葉圓片全部出現(xiàn)褪綠斑，并且大部分完全變?yōu)楹诤稚?倍稀釋液的褪綠斑約為葉圓片面積1/2。 5倍釋液處理7 d后，褪綠斑大約為葉圓片面積的1/5；10倍稀釋液處理7 d后，大部分葉圓片基本無明顯變化(圖1)。

2.1.2 月季葉枯病菌毒素對針刺離體葉片的影響 月季葉片經(jīng)過不同濃度的針刺，1 d后無明顯效果, 2 d后1倍與2倍稀釋液處理下，針刺部位出現(xiàn)明顯的褪綠斑，3 d后5倍稀釋液開始出現(xiàn)褪綠斑，6 d后10倍稀釋液處理開始出現(xiàn)褪綠斑，但現(xiàn)象不是很明顯，隨著天數(shù)的增加，病斑并沒有明顯改變。

圖1毒素原液1倍和5倍稀釋液7 d后對月季葉碟的影響

2.2培養(yǎng)條件篩選

2.2.1 最優(yōu)培養(yǎng)液 由表3可以看出，培養(yǎng)液對病原菌產(chǎn)毒有很大的影響，其中以在查彼+液體培養(yǎng)液中產(chǎn)毒量最高，出現(xiàn)褪綠病斑的現(xiàn)象最為明顯，其次是PD培養(yǎng)液和PS培養(yǎng)液，月季葉枯病菌在月季葉煎汁蔗糖培養(yǎng)液中的產(chǎn)毒能力最弱。

表3不同培養(yǎng)液對月季葉枯病菌產(chǎn)毒的影響

培養(yǎng)液褪綠斑大小(mm)第3d第7dPD4.50±0dC7.20±0.35abABPS5.63±0.13bB6.66±0.38bBCRPB5.10±0.10cB5.73±0.05cCRSB1.33±0.30eD4.23±0.23dD查彼+7.80±0.56aA8.00±0aA

注：經(jīng)Duncan’s 新復極差法檢驗，同列數(shù)據(jù)中不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著，大寫字母表示0.01水平上差異顯著。

2.2.2 最優(yōu)培養(yǎng)時間 不同培養(yǎng)時間對月季葉枯病菌毒素的產(chǎn)生有很大影響。圖2結(jié)果表明，培養(yǎng)時間少于25 d 毒素各處理對葉圓片褪綠程度隨毒素培養(yǎng)時間增加而加重，說明毒素的產(chǎn)生量隨培養(yǎng)時間的增加而增加。培養(yǎng)30 d的含毒培養(yǎng)液1 d就可以使全部葉碟出現(xiàn)褪綠病斑，與培養(yǎng)25 d的含毒培養(yǎng)液效果相同，從而推斷25 d后毒素含量基本保持在25 d的水平上。

2.2.3 最優(yōu)培養(yǎng)溫度 月季葉枯病菌在試驗設(shè)定的溫度范圍內(nèi)均能產(chǎn)毒，溫度對該菌的產(chǎn)毒能力影響顯著。培養(yǎng)溫度低于20℃時，毒素產(chǎn)量隨溫度的升高而增加；在25℃和30℃條件下得到的含毒培養(yǎng)液2 d后產(chǎn)生褪綠病斑的大小基本相同。

圖2不同培養(yǎng)時間對月季葉枯病菌產(chǎn)毒的影響

圖3不同培養(yǎng)溫度對月季葉枯病菌產(chǎn)毒的影響

2.2.4 最佳通氣量 在其他條件一定的情況下，全天振蕩培養(yǎng)的產(chǎn)毒量最大，葉碟浸泡3 d后平均產(chǎn)生5.4 mm左右的褪綠病斑；間歇振蕩培養(yǎng)的產(chǎn)毒量次之，葉碟浸泡3 d后平均產(chǎn)生4.9 mm左右的褪綠病斑；靜置培養(yǎng)的產(chǎn)毒量最低，葉碟浸泡3 d后平均產(chǎn)生4.7 mm左右的褪綠病斑。結(jié)果表明，全天振蕩培養(yǎng)的情況下，月季葉枯病菌產(chǎn)毒能力較強。

2.2.5 最優(yōu)光照條件 在其他條件一定的情況下，自然晝夜交替條件下月季葉枯病菌產(chǎn)毒能力最強，含毒培養(yǎng)液7 d可造成5.8～6.5 mm的褪綠病斑；全黑培養(yǎng)條件下產(chǎn)毒能力有所下降，含毒培養(yǎng)液7 d可造成4.9～5.9 mm的褪綠病斑；全光照條件下產(chǎn)毒能力最差，7 d所造成的褪綠病斑大小為4.7～5.0 mm左右。說明，光照對于該菌的產(chǎn)毒積累具有一定程度的抑制作用，自然晝夜交替條件最有利于產(chǎn)毒。

2.3月季葉枯病菌含毒濾液中蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的測定

2.3.1 含毒濾液蛋白質(zhì)含量 經(jīng)測定，月季葉枯病菌毒素的吸光值為0.657，根據(jù)圖4蛋白質(zhì)標準線性回歸方程求得毒素中蛋白質(zhì)含量為36 μg，代入公式(1)，計算出毒素原液中蛋白質(zhì)濃度為180 μg/mL。

圖4蛋白質(zhì)的標準曲線

2.3.2 含毒濾液可溶性糖含量 經(jīng)測定，月季葉枯病菌毒素5倍稀釋液的吸光值平均值為0.581，根據(jù)圖5可溶性糖的標準線性回歸方程求得毒素中可溶性糖含量為82.29 μg，代入公式(2)求得毒素原液中可溶性糖濃度為2 057.25 μg/mL。

圖5可溶性糖的標準曲線

2.4含毒濾液的化學成分

借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對毒素原液中的主要化學成分進行分析，采用 NIST11標準譜庫檢索定性，檢測出以下6種主要化學成分，分別為三氧硅烷、十甲基環(huán)五硅氧烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷、1,4二甲氧基-6,7,8,9四氫環(huán)庚酮、戊二酸、氨基甲酸甲酯，每種化學物質(zhì)的質(zhì)譜圖見圖6～圖10。

圖6月季葉枯病菌毒素原液中三氧硅烷質(zhì)譜圖

圖7月季葉枯病菌毒素原液中十甲基環(huán)五硅氧烷質(zhì)譜圖

圖8月季葉枯病菌毒素原液中十二甲基環(huán)六硅氧烷質(zhì)譜圖

圖9月季葉枯病菌毒素原液中1,4二甲氧基-6,7,8,9四氫環(huán)庚酮質(zhì)譜圖

圖10月季葉枯病菌毒素原液中戊二酸質(zhì)譜圖

圖11月季葉枯病菌毒素原液中氨基甲酸甲酯質(zhì)譜圖

3 討論與結(jié)論

本試驗分別采用葉圓片浸漬法和離體葉片針刺法對月季葉枯病菌進行生物活性測定，發(fā)現(xiàn)葉圓片浸漬法效果較為顯著，且操作相對簡便；含毒濾液濃度越高，毒素致病力越強。與于麗娜等[12]研究冬棗黑疔病病原菌毒素致病機制及黃秀萍[8]研究雷公藤角斑病毒素致病機理的結(jié)果相近，均發(fā)現(xiàn)毒素濃度越大，對植物組織的傷害越大。

培養(yǎng)條件對真菌毒素活性影響明顯，不同的培養(yǎng)條件如：培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、通氣條件及光照條件等都是影響產(chǎn)毒的重要因素。前人對致病真菌毒素的培養(yǎng)條件做了大量研究。李小波等[13]研究發(fā)現(xiàn)番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)液為PS培養(yǎng)液，高洪敏和陳捷[14]發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌在Richard培養(yǎng)基產(chǎn)生毒素的活性最高，彭建華等[15]發(fā)現(xiàn)橡膠多主棒孢病菌最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基是改良的Fries3號培養(yǎng)基，可見不同菌株對培養(yǎng)基存在選擇性。蔣繼志[16]、朱天輝[17]、潘陽[18]等分別對石楠擬盤多毛孢菌、暗孢節(jié)菱孢菌、大豆毛口殼葉斑病菌的產(chǎn)毒條件做了研究，均發(fā)現(xiàn)不同病原真菌的最佳產(chǎn)毒條件不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)月季葉枯病菌產(chǎn)毒條件為：最佳培養(yǎng)液查彼+，最佳培養(yǎng)時間25 d，最適產(chǎn)毒溫度大約在25～30℃之間，通氣量越充足產(chǎn)毒越好，在晝夜交替條件下最有利于產(chǎn)毒。由于作者之前已研究過該菌的生物學特性，因此本試驗未對產(chǎn)毒pH條件進行研究。

該菌的最佳產(chǎn)毒條件為溫度25℃，與其生物學特性研究中該菌的最適生長溫度相一致，證明溫度對于新型月季葉枯病的發(fā)病條件有很強的制約性。當溫度達到適宜溫度左右，病害便可以在月季葉片上迅速生長，這也符合2014年的田間調(diào)查結(jié)果，即該病害在當年的5月下旬到6月上旬和9月中旬前后在天津花圃大規(guī)模爆發(fā)。

對病原菌毒素溶液中蛋白質(zhì)和可溶性糖含量的初步研究發(fā)現(xiàn)，毒素粗提液中可溶性糖含量較高，但后期仍需通過ɑ-萘酚反應(yīng)、班乃德反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)等化學測定和薄層層析等手段進一步分析確定毒素中所含的具體是哪種或哪幾種多糖[19]。氣相色譜和質(zhì)譜儀對毒素粗提液的化學成分的檢測發(fā)現(xiàn)，主要有6種化學物質(zhì)，分別為三氧硅烷、十甲基環(huán)五硅氧烷、十二甲基環(huán)六硅氧烷、1,4二甲氧基-6,7,8,9四氫環(huán)庚酮、戊二酸、氨基甲酸甲酯。近年來國內(nèi)外從內(nèi)生擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)中發(fā)現(xiàn)了許多活性代謝產(chǎn)物，其中有些甚至具備抗氧化、抗高血壓、抗真菌等生物活性，具有很好的藥用開發(fā)潛質(zhì)。其代謝產(chǎn)物復雜多樣，除產(chǎn)生一些常見的化合物如齊墩果酸、2-羥基-3-苯基丙酸甲酯、菜油甾醇、過氧麥角甾醇、D-阿洛醇、 烏蘇酸、3-羥基-4-甲氧基苯乙烯、鄰苯二甲酸二異丁酯、3,4-二羥基苯乙醇、對羥基苯乙醇[20]等，還有許多結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的代謝產(chǎn)物，但大致可以將這些代謝產(chǎn)物分為萜類、生物堿類、異香豆素和香豆素類、醌類和半醌類、色酮類和脂類等[21]。但本研究對象是從月季病葉上分離出來的致病真菌，非月季本身內(nèi)生的擬盤多毛孢菌，因此，本研究發(fā)現(xiàn)的6種主要化學物質(zhì)對于擬盤多毛孢菌代謝產(chǎn)物的化學成分研究是一個很好的補充。此外，鄭永標等[22]2011年從一株擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)的靜置發(fā)酵培養(yǎng)液中通過硅膠和凝膠柱層析法分離和純化化合物，然后借助核磁共振波普分離到一個倍半萜的新化合物和一個已知化合物 4-羥基苯乙醇。早在1997年董金皋和李正平[23]就對一些病原菌的致病毒素及其可能的化學結(jié)構(gòu)進行了總結(jié)，但其中并未涉及到由棒狀擬盤多毛孢菌引起的植物病害，因此弄清不同化學物質(zhì)在對寄主植物毒害作用中所發(fā)揮的不同作用，對今后進一步深入探討棒狀擬盤多毛孢菌毒素的致病機理具有十分重要的意義。此外毒素對月季生理生化的影響還需深入研究，主要是含毒濾液處理月季葉片后，月季葉片受到脅迫并誘導自身產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，體現(xiàn)為超氧化物歧化酶、過氧化物酶等防御酶活性的變化。

真菌毒素的穩(wěn)定性是毒素產(chǎn)生和積累的重要因素。熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性以及耐儲穩(wěn)定性等對于病原真菌毒素的活性都有較大影響，這可能與毒性物質(zhì)的化學組成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，月季葉枯病菌毒素中可溶性糖含量要比蛋白質(zhì)含量高，因此推測該菌的毒素穩(wěn)定性可能相對比較穩(wěn)定，但具體結(jié)論仍需進一步穩(wěn)定性試驗結(jié)果的支持。

本研究內(nèi)容對于天津市新型月季葉枯病菌發(fā)病規(guī)律和防控措施的制定提供了重要的參考依據(jù)，具有重要的理論意義。隨著月季葉枯病菌致病機理的進一步深入研究，本文涉及的相關(guān)研究內(nèi)容略顯淺顯，仍需后人進一步研究。

[1] 于紅革,崔紅.兩類月季病害的防治[J].中國花卉盆景,2002(8):32.

[2] 嚴桂華,曹萍.月季主要病蟲害及其防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007(22):94-97.

[3] Feng Y R, Liu B S, Sun B B. First report of leaf blotch caused by PestalotiopsisclavisporaonRosachinensisin China[J].Plant Disease,2014,98(7):1009

[4] 馮友仁,劉寶生,白鵬華.天津市新型月季葉枯病病原菌鑒定及生物學特性研究[J].北方園藝,2015(14):125-129.

[5] 許志剛.普通植物病理學(第三版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2003.

[6] 張淑珍.植物病原菌毒素研究進展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學,2001(2):42-43.

[7] 李向彬,蔣繼志,郭會婧.草莓根腐病菌致病物質(zhì)的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2008，31(2):42-43.

[8] 黃秀萍.雷公藤角斑病菌的毒素提取及致病機理的初步研究[D].福州:福建農(nóng)林大學,2012.

[9] 朱濤,楊會敏,盧東升.茶樹輪斑病病原菌毒素生物測定方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2009，37(5):1991-1994.

[10] 杜化仿,張茹琴,夏淑春,等.花生葉腐病菌毒素提取及致病性研究[J].青島農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2011，28(2):99-102.

[11] 蔣瀟,田靜.三個產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油的化學成分分析[J].中國民族民間醫(yī)藥,2015，24(17)：19-22.

[12] 于麗娜,閆紅飛,宗淑萍,等.冬棗黑疔病病原菌毒素致病機制研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2008，31(1):33-36.

[13] 李小波,康立功,路盼,等.番茄葉霉病菌產(chǎn)毒條件研究[J].植物保護,2010，36(1):83-86.

[14] 高洪敏,陳捷.玉米莖腐菌毒素的產(chǎn)生條件和化學特征的初步研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,1999，30(3):223-226.

[15] 彭建華,鄭春耀,潘羨心,等.橡膠樹多主棒孢病菌強致病菌株的篩選及產(chǎn)毒條件優(yōu)化[J].熱帶作物學報,2009，30(4):520-524.

[16] 蔣繼志,李向彬,桂春爽,等.石楠擬盤多毛孢毒素產(chǎn)生條件初探[J].微生物學通報,2009，36(1):46-50.

[17] 朱天輝,李姝江,車冠男.暗孢節(jié)菱孢菌蛋白類毒素產(chǎn)生條件研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報,2011，29(4):518-523.

[18] 潘陽,朱曉峰,王媛媛,等.大豆毛口殼葉斑菌產(chǎn)毒素的研究[J].植物病理學報,2011，41(6):596-603.

[19] 王明旭，葉茂，羅寬,等.毛竹枯梢病病原菌毒素的生物測定及成分研究[J].湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學院學報,2001，7(1):28-32.

[20] 鄧慧穎，邢建廣，羅都強. 海蓮內(nèi)生真菌Pestalotiopsisclavispora代謝產(chǎn)物研究[J]. 菌物學報, 2011,30(2): 263-267.

[21] 白志強,林秀萍,劉永宏.內(nèi)生擬盤多毛孢菌化學成分研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013(25):706-715.

[22] 鄭永標, 陳丹霞, 李軍進,等. 擬盤多毛孢菌中新倍半萜的分離與結(jié)構(gòu)解析[J].中國天然藥物，2011(9):421-424.

[23] 董金皋，李正平. 寄主選擇性植物病原真菌的毒素化學[J].微生物學通報，1997(24):247-250.

AnalysisonProductionConditionandChemicalCompositionofToxininPestalotiopsisclavispora

Feng Youren, Liu Baosheng, Bai Penghua

(TianjinInstituteofPlantProtection,Tianjin300384,China)

To deeply reveal the pathogenesis ofPestalotiopsisclavispora, the toxin production conditions were optimized, the contents of protein and soluble sugar in toxin filtrate were measured, and the toxin chemical compositions were analyzed by GC-MS. The results showed that the toxin production ability varied significantly under different conditions. The best toxin production conditions were Czapek liquid culture medium with pH value of 7.0, 25℃, day alternates with night, continuously shaking for 25 days with the rotational speed of 120 r/min. Moreover, the protein content of toxin was 180 μg/mL. The soluble sugar content of toxin was 2 057.25 μg/mL. The chemical compositions of toxin were tripropoxysilane, decamethyl cyclopentasiloxane, dodecamethyl cyclohexasiloxane, 1,4 dimethoxy-6,7,8,9 tetraheptone, glutarate, methyl carbamate.

Pestalotiopsisclavispora; Toxin; Toxin production condition; Gas chromatogram and mass spectra; Chemical composition

S685.12

A

1001-4942(2017)10-0081-07

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.017

2017-02-06

天津市農(nóng)業(yè)科學院院長基金項目(15003)

馮友仁(1983—)，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向為植物保護及病蟲害生物防治。E-mail：znlfyr@126.com