□ 高紅霞 鄂爾多斯市食品藥品監(jiān)督管理局

熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分

□ 高紅霞 鄂爾多斯市食品藥品監(jiān)督管理局

“民以食為天，食以安為先”，肉制品中摻雜摻假是我國(guó)食品行業(yè)中存在的問題之一?，F(xiàn)階段，對(duì)于肉制品的鑒別有以下幾種：DNA分析法、顯微鏡觀察法和特異性蛋白質(zhì)檢測(cè)法等，但這些方法工作量較大，需要通過凝膠電泳、轉(zhuǎn)化以及測(cè)序等流程，并且成本比較高。基于實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，其通過熒光信號(hào)積累，從而做到監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR的進(jìn)程，在日常的應(yīng)用中具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量范圍寬和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，在很多物種鑒定中得以應(yīng)用。本文就熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分做簡(jiǎn)要的分析探討，希望能夠給相關(guān)工作者帶來幫助。

熒光定量PCR方法；肉制品；羊源性成分

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本組實(shí)驗(yàn)中DNA樣品主要來源于以下6種購(gòu)自鄂爾多斯超市的動(dòng)物：羊肉、牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉和魚肉；檢測(cè)材料主要有24︰1的三氯甲烷－異戊醇、滅菌雙蒸水、70%的乙醇、裂解液、TE緩沖液、滅菌雙蒸水與異丙醇；檢測(cè)儀器主要是英國(guó)SYNGENE公司生產(chǎn)的BOX凝膠成像系統(tǒng)、美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的ND-1000NanoDrop核酸蛋白測(cè)定儀與SUB-cellGT核酸電泳儀、熒光定量PCR儀及掌上離心機(jī)與臺(tái)式高速離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板的提取

將取肉類樣品用的剪刀在160 ℃下烘烤2 h，每份樣品單獨(dú)使用一把剪刀，每份樣品隨機(jī)取兩篇，于瘦肉部位多取點(diǎn)樣，每份共取樣30 mg；對(duì)于肉餡類樣品，隨機(jī)兩點(diǎn)取樣；陽(yáng)性、陰性對(duì)照樣品則單點(diǎn)取樣。取樣工作完成后，將樣品置于容積為1.5 mL的EP管中，確保容器經(jīng)過無菌處理。依據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行DNA提取，檢測(cè)其濃度與純度。

1.2.2 樣品的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA樣品羊源性成分時(shí)，均采用國(guó)標(biāo)GB/T20190-2006法和實(shí)時(shí)熒光PCR法，確保每個(gè)樣品所應(yīng)用的DNA模板都為同管等量。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每份樣品在使用以上兩種方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，均需重復(fù)兩次檢測(cè)步驟，每次檢測(cè)需設(shè)置2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。確定檢測(cè)結(jié)果需在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)與所有平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果都一致的前提下，如若不然，則需重新檢測(cè)。檢測(cè)完畢后，對(duì)比與分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率。

2 結(jié)果分析

2.1 DNA模版提取和濃度測(cè)定

6種樣品的DNA提取結(jié)果見表1。2種提取方法處理樣品中鹽分、蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)較為得當(dāng)。通過表1中的數(shù)據(jù)不難看出，6種肉類樣品260/280比值均在1.8～2.0，260/230比值均在2.0以上。利用1%瓊脂糖電泳對(duì)核酸提取質(zhì)量加以檢測(cè)，可得到相對(duì)單一條帶，檢測(cè)結(jié)果與定量檢測(cè)DNA質(zhì)量要求相符，具體見圖1。

表1 不同品種肉源的DNA濃度表

2.2 樣品的鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA樣品羊源性成分時(shí)，均采用國(guó)標(biāo)GB/T20190-2006法和實(shí)時(shí)熒光PCR法。最終檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR法與國(guó)標(biāo)GB/T20190-2006法的檢測(cè)結(jié)果符合率高達(dá)100%，這說明該檢測(cè)方法的特異性較好。

圖1 不同品種肉源的DNA電泳檢測(cè)圖

3 結(jié)論

隨著市場(chǎng)上羊肉價(jià)格的不斷大幅上漲，越來越多的商家為了獲得更多的利潤(rùn)，通過在肉制品中添加其他物質(zhì)來?yè)郊倌怖?，給食品安全帶來了一定的危害。因此，對(duì)于肉制品的鑒定尤為重要。肉制品鑒定的方法有很多，本文在常規(guī)PCR方法基礎(chǔ)上，加入了熒光標(biāo)記探針，建立了實(shí)時(shí)熒光探針PCR方法，這樣可以克服傳統(tǒng)PCR易污染、耗時(shí)長(zhǎng)、監(jiān)測(cè)樣品少等缺點(diǎn)，大大提高了肉制品的鑒定效率，再加上其高通量和低成本的優(yōu)點(diǎn)，在肉制品鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。