●許朋 余蘭 馮昆

一種快速提取質(zhì)粒DNA的方法

●許朋1余蘭1馮昆2

分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛，提取質(zhì)粒DNA方法向著高通量、快速高效、廣泛適用的方向發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)采用二氧化硅修飾的磁珠設(shè)計(jì)了一種快速分離質(zhì)粒DNA的試劑盒，并設(shè)計(jì)了多種引物，探索同一質(zhì)粒DNA對(duì)兩對(duì)引物，同一基因組DNA對(duì)兩對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明：含磁性磁珠的試劑盒能夠在10min內(nèi)完成提取，產(chǎn)量較高；且樣品對(duì)PCR無(wú)抑制作用，并適用于多種樣品，應(yīng)用此方法提取的DNA還可用于多重PCR。

提??；質(zhì)粒

質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外并以超螺旋狀態(tài)于細(xì)菌和酵母等多種生物中的環(huán)狀的DNA分子。也是基因工程主要載體，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)領(lǐng)域、免疫檢驗(yàn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。堿裂解法、酚裂解法、煮沸法是傳統(tǒng)的提取質(zhì)粒DNA的方法，但傳統(tǒng)的方法中使用了有多種有毒試劑、提取效率不穩(wěn)定、步驟繁瑣而且耗時(shí)長(zhǎng)[6]。

隨后發(fā)展了陰離子交換層析、疏水層析法和凝膠層析等方法，但是耗時(shí)且昂貴，不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。因此尋求一種穩(wěn)定、高效、高通量、安全環(huán)保、自動(dòng)化DNA提取方法越來(lái)越重要。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，磁性納米微球近幾年來(lái)成為分子生物學(xué)領(lǐng)域矚目的新星，其表面可以被多種活性基團(tuán)包被修飾，表面積大，在磁場(chǎng)下的超順磁作用等使得其應(yīng)用廣泛[9]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)質(zhì)粒DNA的提取，探索采用二氧化硅包被的磁性磁珠，在傳統(tǒng)的試劑盒原理上，通過(guò)提取體系的優(yōu)化，探索并設(shè)計(jì)多種引物用于PCR驗(yàn)證并適用，建立了高效、快速、安全、普適的質(zhì)粒DNA提取方法，為質(zhì)粒的提取分離純化提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種：大腸桿菌的質(zhì)粒pEGFP-N1來(lái)自實(shí)驗(yàn)室自存

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：鹽酸胍、Rnase酶、胰蛋白胨、檸檬酸鈉、乙酸鉀、β一巰基乙醇、羧芐青霉素、吐溫-20、無(wú)水乙醇、異丙醇、Tris堿、硼酸、酵母浸出液、溴化乙錠，LIris—HCl、RNase A、SDS、NaOH、KAc、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：微型分光光度計(jì)Nanodrop ND—2000、凝膠成像系統(tǒng)、混合反應(yīng)器、磁性分離架、恒溫電熱股風(fēng)干燥箱、酸度計(jì)、水平電泳儀、PCR擴(kuò)增儀、漩渦混合器、電熱恒溫振蕩水槽、臺(tái)式高速離心機(jī)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 質(zhì)粒DNA提取

1）選取單菌落在3mL LB培養(yǎng)液（pH 7.0-7.2，0.5%酵母浸出液、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉）中并振蕩過(guò)夜，用1.5ml在離心管集細(xì)菌培養(yǎng)液，于室溫以12000rpm離心30s后，棄上清[1,4]。

2)細(xì)菌裂解：將細(xì)胞沉淀懸于100μL菌體懸浮液(10mmol/L EDTA，50mmol/LIris—HCl(pH 7.5)，50mg/m1RNase A)中，劇烈振蕩使之充分混勻。接著加入150μL裂解液(裂解液：1%SDS、0.2mol/L NaOH)連續(xù)數(shù)次上下來(lái)回顛倒至澄清狀溶液，于樣品裂解液中加入300μL吸附液I(100mMTris 50mMEDTA，0.1M K+，4.2M鹽酸胍，0.25MNa+，1/10V異丙醇，pH5.10）連續(xù)上下來(lái)回顛倒試管至混合均勻于室溫12000rpm離心3min[5]；

3）吸附：吸取上清液置于潔凈離心管內(nèi)，取適量磁性納米微球加入，上下來(lái)回5—10次顛倒試管充分混合使核酸吸附；

4）洗滌：磁性分離架上放上離心管，施加外磁場(chǎng)，在接近磁場(chǎng)一側(cè)將吸附DNA的磁性微球富集從而分離出原溶液，加入70%的乙醇500μl，反復(fù)2次洗滌將染色體DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)除去；

5）洗脫：靜置于2～3分鐘將乙醇揮發(fā)，加入洗脫液100μL（0．5mmolEDTA、10mmolTris、pH=8.0）連續(xù)上下反復(fù)吹打沉淀將微球懸浮充分后置于室溫3min洗脫DNA，得到純化后的質(zhì)粒DNA。

1.4.2 基因組DNA提取

100μL肺組織于試管，加入10μL混合酶工作液（10～40mg/mL的蛋白酶K，10～40mg/mL的溶菌酶），56℃水浴5min；加入750μL裂解液（Gu-Hcl的濃度為 3～8mol/L，Tris-Hcl的濃度為 10～30mmol/L，EDTA的濃度為1～10mmol/L、異丙醇的體積比為1/2～1/6，SDS為0.1～0.5%，Triton-100為0.5～2%，β-巰基乙醇為0.5～2%，Nacl的濃度為800mmol/L，pH6.8的檸檬酸鈉濃度為200mmol/L）以及磁性納米微球，連續(xù)5-10次上下來(lái)回顛倒試管以充分混合，置室溫3min后將上清用磁分離架分離棄去；用800μL洗滌液（800mmol/LLicl，100mmol/LNacl，50mmol/LMOPS，乙醇的體積比為60%，其中乙醇的pH=7.0）洗2次，分離磁珠棄上清；用1000μL漂洗液（70%乙醇）漂洗2次再次分離磁珠棄上清；室溫放置3min，揮干乙醇，加入100μL洗脫液（0.5mmol/LEDTA，10mmol/LTris-Hcl，其中Tris-Hcl的pH=8.0）上下吹打沉淀，充分將微球懸浮，靜置室溫3min，得到純化后的基因組DNA。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖0.4g于錐形瓶，加50ml l× TBE，加熱使瓊脂糖溶解，取出后置冷，加入3μL EB，混勻，排氣泡倒入模具中并插入樣品梳，冷卻凝固撤梳子，將凝膠放入電泳槽中。將得到的樣品提取液取5μL與lμL Loading buffer混勻后，分別加入點(diǎn)樣孔中。另外取3μl marker，加入點(diǎn)樣孔中。打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電壓為110V，電泳30min。30min后，取出凝膠，拍照[2,3,7,8]。

1.4.4 PCR

1.4.4.1 PCR引物：Forward Primer CTGGACACTTGGACATGGTCA

Reverse Primer CATAGCCAGAATTGAAGCCCA

Forward Primer AGTCACCACGGTTCATGGAAA

Reverse Primer CATGCTGGCTCCAGTATAATTGA

1.4.4.2 PCR體系：體系如下表1（：以25μl為例）

表1 25μlPCR體系

1.4.4.3 PCR反應(yīng)條件：三步法PCR，98℃ 10 sec.，60℃ ＊ 30 sec.，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果

利用該磁性磁珠試劑盒提取質(zhì)粒DNA結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示，該方法提取的質(zhì)粒DNA條帶明顯，純度高，條帶顯示清晰，即無(wú)蛋白質(zhì)和RNA污染，該方法純化所得質(zhì)粒DNA可用于酶切、PCR等實(shí)驗(yàn)。

2.2 同一質(zhì)粒DNA對(duì)兩對(duì)引物

為了檢驗(yàn)樣品純度以及對(duì)PCR的作用。將同一樣品應(yīng)用于兩對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。由圖2、3，結(jié)果表明，提取的質(zhì)粒DNA對(duì)于引物一、引物二都能夠擴(kuò)增。引物一擴(kuò)增后的條帶大小在100-250bp。引物二擴(kuò)增后的條帶大小在400-500bp之間。同一樣品用不同引物均能擴(kuò)增出來(lái)，表明該提取方法得到的產(chǎn)物，無(wú)PCR抑制作用，適用廣泛。

2.3 同一基因組DNA對(duì)兩對(duì)引物

利用磁性磁珠法提取的基因組DNA用于PCR擴(kuò)增，由圖4得到，不同引物均能成功地?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小400-500bb，且清晰可見(jiàn)。此結(jié)果表明，該磁珠提取法提取的基因組DNA對(duì)于PCR無(wú)抑制作用。

3 討論

蛋白質(zhì)、細(xì)胞、多肽以及核酸等生物分子的分離、純化、精制在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尤為重要，分離純化技術(shù)的發(fā)展直接影響著生物學(xué)的發(fā)展水平。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的磁性磁珠法質(zhì)粒DNA提取試劑盒與目前市售的多種質(zhì)粒DNA提取試劑盒相比較，能夠解決目前存在的耗時(shí)長(zhǎng)、試劑毒性大、產(chǎn)率不穩(wěn)定等問(wèn)題，再將其比較硅膠膜離心柱及同類(lèi)型磁性分離試劑盒，有如下的特點(diǎn)：首先，操作簡(jiǎn)便，提取高效，實(shí)驗(yàn)在一個(gè)離心管內(nèi)操作完成，減少了相互污染，減少了產(chǎn)物丟失，所得質(zhì)粒DNA產(chǎn)物純度高，無(wú)RNA以及蛋白質(zhì)污染，產(chǎn)物可應(yīng)用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。其次，耗時(shí)短，能夠在室溫10min內(nèi)完成提取，不使用有毒試劑，操作流程簡(jiǎn)略、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、安全化。第三，價(jià)格低廉，實(shí)驗(yàn)儀器簡(jiǎn)單，試劑均為國(guó)產(chǎn)，且磁性磁珠為實(shí)驗(yàn)室合成，緩沖液自己設(shè)計(jì)。第四，本試劑盒對(duì)多種樣品均適用，且多種樣品對(duì)于兩種引物無(wú)PCR抑制，適用廣泛。

（作者單位：1遵義醫(yī)學(xué)院,2遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū),珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

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A Rapid Method for Preparation of Plasmid DNA

XuPeng1YuLan1＊FengKun2＊
1.Zunyi Medical College, Zunyi, 563000 2.Zhuhai Campus of Zunyi Medical College Zhuhai Key Laboratory of Fundamental and Applied Research of Traditional Chinese Medicines, Zhuhai, 519000

the fast development of molecular biology techniques, the method of extraction of plasmid DNA toward high flux are widely used in the direction of development and efficiently This experiment adopts the silicon dioxide modified magnetic beads to design a kind of quick separation of plasmid DNA kit, and designed a variety of primers, explore the same plasmid DNA of two pairs of primers, the same genome DNA of two pairs of primers for PCR test results show that the kits containing magnetic beads can finish extracted in 10 min, yield is higher; The sample has no inhibitory effect on PCR and is applicable to multiple samples. The DNA extracted from this method can also be used in multiple PCR.

extraction; plasmid

余蘭 馮昆

許朋，男，研究生；余蘭，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化及其活性研究；馮昆，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。