●陳浩寧

一種不動桿菌/鮑曼不動桿菌快速鑒定方法

●陳浩寧

鮑曼不動桿菌是目前臨床最常見的多重耐藥菌，但現(xiàn)有全自動細菌鑒定儀無法將鮑曼不動桿菌從不動桿菌中鑒別出來。本研究基于鮑曼不動桿菌特異性ITS序列和不動桿菌高度保守rA序列建立多重PCR技術(shù)，可以有效地從不動桿菌中篩選出鮑曼不動桿菌，該方法在細菌耐藥機制和醫(yī)院內(nèi)感染的流行病學研究中具有重要使用價值。

不動桿菌;鮑曼不動桿菌;PCR

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是不動桿菌屬中最重要的一個臨床分離病原菌，占臨床分離不動桿菌的80%～90%[1]。與此同時，不動桿菌屬中數(shù)個種與鮑曼不動桿菌生化反應非常相似，目前臨床自全動細菌鑒定儀無法有效區(qū)分，故只能統(tǒng)一稱為醋酸鈣—鮑曼復合不動桿菌[2]。目前臨床感染主要以鮑曼不動桿菌為主，其耐藥性也最顯著，其他不動桿菌在流行病學和耐藥機制與鮑曼不動桿菌存在較明顯差異[3]。因此有必要建立一種快速簡便的技術(shù)，準確鑒定鮑曼不動桿菌，為醫(yī)院內(nèi)感染防治提供指導。

1 材料和方法

1.1 菌株

隨機選取本院分離醋酸鈣—鮑曼復合不動桿菌40株，置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h用于后續(xù)實驗。

1.2 細菌DNA模板制備

使用陳方圓等[4]報道煮沸法制備模板：挑取單個菌落，與100μl滅菌雙蒸水中混勻，煮沸10min后離心10 min，吸取上清即為模板。

1.3 引物合成

根據(jù)鮑曼不動桿菌ITS序列和不動桿菌rA序列設計多重PCR引物。鮑曼不動桿菌ITS基因擴增引物為Ab-ITSF：5’-CATTATCACGGTAATTAGTG-3’ 和 Ab-ITS-R：5’-AGAGCACTGTGCACTTAAG-3’，預測擴增產(chǎn)物長度為208bp。不動桿菌rA基因擴增引物為rA-F：5’-CCTGAATCTTCTGGTAAAAC-3’和rA-R：5’-GTTTCTGGGCTGCCAAA CATTAC-3’，預測擴增產(chǎn)物長度為425bp。引物交由蘇州泓迅生物技術(shù)公司合成。

1.4 PCR擴增

在PCR反應管中依次加入如下成份：PCR預混液(南京Vazyme公司)12.5μl，上下游引物各0.5μl，模板2μl，最終加滅菌雙蒸水至25μl。PCR擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，重復循環(huán)35次，最終72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物通過1%濃度瓊脂糖電泳分析結(jié)果。

2 結(jié)果

經(jīng)1%濃度瓊脂糖電泳后，40株醋酸鈣—鮑曼復合不動桿菌均擴增出425 bp不動桿菌rA條帶，其中4株未擴增出208 bp鮑曼不動桿菌ITS條帶，其他各株均擴增出該條帶(見圖1)。結(jié)果表明，該4株菌不是鮑曼不動桿菌，全自動細菌鑒定儀所鑒定的醋酸鈣—鮑曼復合不動桿菌中有10%菌為其他不動桿菌，而非鮑曼不動桿菌。

圖1 PCR擴增結(jié)果 M：標準DNA分子量標記

3 討論

不動桿菌屬目前至少包含有33種基因型，其中醋酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、不動桿菌菌屬3型以及不動桿菌菌屬13TU的基因型和表型高度的相似性，無法采用常規(guī)方法鑒別。目前臨床感染的不動桿菌中，以鮑曼不動桿菌的耐藥性增強最為迅速，對患者的威脅最大[5]。同時不同種不動桿菌的流行病學仍有較大差異，其耐藥性的獲得機制也存在差異，因此有必要進一步對臨床檢出的醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體做進一步鑒別，為鮑曼不動桿菌耐藥機制研究提供合格的研究樣本[6]。本研究中建立多重PCR法操作簡便，可以迅速完成對臨床標本的鑒定工作，在鮑曼不動桿菌流行病學研究和醫(yī)院內(nèi)感染研究中具有重要作用。

(作者單位：江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科)

[1]羅蘭.陸堅.馬翠萍.聶曉英.廖康.耐亞胺培南鮑曼不動桿菌醫(yī)院內(nèi)感染流行的分子機制研究.中國微生態(tài)學雜志2004,16(4)：218-220.

[2]芮曉艷.胡杰貴.熊自忠.耐亞胺培南鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶檢測及同源性分析.安徽醫(yī)科大學學報2012,47(2)：154-157.

[3]李永麗.應春妹.陳藝升.ERIC-PCR技術(shù)在鮑曼不動桿菌基因分型中的應用評估.檢驗醫(yī)學2013,28(7)：621-624.

[4]陳方圓.馬笑雪.蔡景鈺.王斯.羅恩杰.多重耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)的臨床藥物治療及耐藥機制研究.微生物學雜志2010,30(1)：71-74.

[5]PaganoM,Martins AF, Machado AB, Barin J, Barth AL.Carbapenem-susceptible Acinetobacter baumannii carrying the ISAba1 upstream blaOXA-51-like gene in Porto Alegre, southern Brazil. Epidemiology and infection 2013, 141(2)：330-333.

[6]Ma Z, Zhou L, Wang H, Luo L.Investigation on the genomic diversity of OXA from isolated Acinetobacter baumannii. International journal of clinical and experimental medicine 2015, 8(3)：4429-4432.

陳浩寧(1987～)，男，初級檢驗師，碩士，研究方向為臨床檢驗診斷學。