潘孫雷， 林 輝， 駱杭琪， 高飛丹， 孟立平， 郭 艷， 郭航遠(yuǎn)， 池菊芳△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江 溫州 325000； 2. 紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科， 浙江 紹興 312000)

黃酒多酚對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響*

潘孫雷1,2， 林 輝1,2， 駱杭琪2， 高飛丹2， 孟立平2， 郭 艷2， 郭航遠(yuǎn)1,2， 池菊芳1,2△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 浙江 溫州 325000； 2. 紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科， 浙江 紹興 312000)

目的探究黃酒多酚對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control組)、糖尿病心肌病組(DCM組)、糖尿病心肌病+黃酒多酚組(DCM+ YWP組)(n=10)。采用單次腹腔注射65 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建糖尿病心肌病大鼠模型，對(duì)照組采用相同劑量的枸櫞酸緩沖液進(jìn)行單次腹腔注射，DCM+YWP組建模后用18 mg/kg黃酒多酚灌胃。12周后觀察大鼠一般情況，用多普勒心超評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能，用電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)，用ELISA法檢測(cè)心肌組織炎癥指標(biāo)，用氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌組織氧化應(yīng)激水平，用Westen blot檢測(cè)心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3(cleaved)的表達(dá)水平。結(jié)果與DCM組相比，DCM+YWP組大鼠血糖水平及體重未出現(xiàn)明顯變化；心臟超聲顯示左室舒張末期直徑，左室收縮末期直徑降低(P<0.05)，而左室縮短率、左心室射血分?jǐn)?shù)、E/A比值以及Ea/Aa比值均升高(P<0.05)；心肌組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)以及白介素6(IL-6)水平下降(P<0.05)；心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)水平下降、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平上升(P<0.05)；心肌組織Bax、Caspase-3(cleaved)蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)。結(jié)論: 黃酒多酚能改善糖尿病心肌病大鼠的心臟功能，降低心肌組織炎癥因子和氧化應(yīng)激水平，抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

黃酒多酚；糖尿病心肌病；心肌凋亡；大鼠

糖尿病是一種胰島素分泌減少或其生物作用受損所引起的代謝紊亂性疾病。心血管并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的主要原因[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是重要的糖尿病心血管并發(fā)癥，表現(xiàn)為患者心肌功能障礙，而無冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓疾病[2]。越來越多的研究證據(jù)表明，炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活以及心肌細(xì)胞凋亡參與到糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制中[3]。凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)展中扮演重要角色。

多酚具有抗炎、抗氧化等生理作用，能降低心血管事件的發(fā)生，對(duì)心血管具有保護(hù)作用[4]。黃酒富含多酚這一物質(zhì)，因此本研究旨在觀察黃酒多酚對(duì)糖尿病心肌病心肌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體重約為200～250 g。購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。試劑：黃酒多酚(由上海中藥制藥技術(shù)公司分離提取)，ELISA試劑盒(由美國R&D Systems公司提供)，氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)盒(由南京建成生物科技有限公司提供)，Bax、Bcl-2、Caspase-3(cleaved)以及GAPDH抗體(由英國Abcam公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 造模和給藥 SD大鼠總共30只，隨機(jī)挑選20只SD大鼠通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 65 mg/kg進(jìn)行構(gòu)造I型糖尿病大鼠模型，剩余10只作為空白對(duì)照組(Control組)，Control組采用相同劑量的枸櫞酸緩沖液進(jìn)行單次腹腔注射。造模后采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠空腹血糖，血糖>16.7 mmol/L認(rèn)為造模成功，本研究中20只SD大鼠均造模成功。隨后，隨機(jī)挑選10只糖尿病心肌病大鼠作為糖尿病心肌病+黃酒多酚組(DCM+YWP組)，予黃酒多酚18 mg/kg灌胃[5]，而另外10只糖尿病心肌病大鼠作為糖尿病心肌病組(DCM組)，予生理鹽水18 mg/kg灌胃。12周后腹腔注射麻醉后進(jìn)行心臟超聲心功能檢測(cè)之后處死大鼠取心肌組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 心功能的超聲檢查 各組SD大鼠造模干預(yù)12周后，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉后進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，主要檢測(cè)左室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)，左室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic diameter, LVSd)，左室縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、E/A比值(E/A ratio)以及Ea/Aa比值(Ea/Aa ratio)。

1.2.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 取心尖部心肌組織，心肌組織每塊1 mm×1 mm×1 mm，用PBS洗滌1遍，用2.5%戊二醛4℃固定2 h，磷酸緩沖液漂洗，再用1%鋨酸固定1 h，經(jīng)乙醇和丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋切成超薄切片，鉛鈾雙染，用日立H-7650透射電鏡觀察并拍照。

1.2.4 炎癥指標(biāo)的檢測(cè) 取心肌組織，于冰上加入適量生理鹽水搗碎，5 000 r/min離心10 min，取上清液。用ELISA試劑盒檢測(cè)炎癥因子指標(biāo)，檢測(cè)指標(biāo)有腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)以及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，按照說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 氧化應(yīng)激水平的檢測(cè) 取心肌組織，于冰上加入適量生理鹽水搗碎，5 000 r/min離心10 min，取上清液。用氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激水平，檢測(cè)指標(biāo)有脂質(zhì)過氧化物丙二醛(malondiadehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)，按照說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax以及Caspase-3(cleaved)表達(dá)水平的檢測(cè) 取心肌組織，于冰上剪碎裂解提取蛋白， BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE膠每孔加入30 μl蛋白樣品，120 V電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部時(shí)停止。250 mA電轉(zhuǎn)膜2 h，將膜放入5%脫脂奶粉的TBST中封閉30 min。分別加Bcl-2、Bax、Caspase-3(cleaved)一抗于搖床上4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，于室溫中置于搖床上孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。用Ecl液于暗室曝光、顯影。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝像，以GAPDH為內(nèi)參照，對(duì)所得圖像進(jìn)行灰度值分析。用Quantity one軟件定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、血糖水平的變化

造模干預(yù)12周后，各組大鼠的基本指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，DCM組SD大鼠體重下降，空腹血糖升高(P<0.05)；DCM組和DCM+YWP組SD大鼠體重和空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

Tab.1Changes of body weight and blood glucose in each gruop

Weight(g)Fastingglucose(mmol/L)Control347±15.64.5±0.7DCM275±13.4*19.7±1.8*DCM+YWP283±14.7*18.6±1.6*

DCM: Diabetic cardiomyopathy; YWP: Yellow wine polyphenols

*P<0.05vscontrol group

2.2 各組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和心功能的改變

造模干預(yù)12周后，各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)顯示，與Control組相比，DCM組SD大鼠左室舒張末期直徑增加(P<0.05)，而左室縮短率、左心室射血分?jǐn)?shù)、E/A比值以及Ea/Aa比值均降低(P<0.05)；與DCM組相比，DCM+YWP組SD大鼠左室舒張末期直徑，左室收縮末期直徑降低(P<0.05)，而左室縮短率、左心室射血分?jǐn)?shù)、E/A比值以及Ea/Aa比值均升高(P<0.05，表2)。

2.3 各組大鼠的心肌組織超微結(jié)構(gòu)的改變

電鏡觀察各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Control組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，線粒體豐富；DCM組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，線粒體腫脹，空泡樣變，大小不一；DCM+YWP組大鼠心肌損傷減輕，心肌細(xì)胞排列較整齊，線粒體腫脹減少，有少量空泡(圖1)。

Tab. 2 Yellow wine polyphenols improves cardiac structure and function in diabetic cardiomyopathy rats(±s， n=10)

DCM: Diabetic cardiomyopathy; YWP: Yellow wine polyphenols; :LVDd: Left ventricular end-diastolic diameter; LVSd: Left ventricular end-systolic diameter; FS: Fractional shortening; LVEF: Left ventricular ejection fraction

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsDCM group

Fig.1Ultrastructure alteration of rat myocardium in different groups (×15 000)

2.4 各組大鼠的心肌組織炎癥因子指標(biāo)的改變

造模干預(yù)12周后，各組大鼠心肌組織炎癥因子指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，DCM組SD大鼠心肌組織炎癥因子指標(biāo)TNF-α、IL-1β以及IL-6上升(P<0.05)；與DCM組相比，DCM+YWP組SD大鼠心肌組織炎癥因子指標(biāo)TNF-α、IL-1β以及IL-6下降(P<0.05，表3)。

GroupTNF-αIL-1β IL-6 Control51±1123±319±5DCM352±16*75±5*81±6*DCM+YWP203±14#50±4#53±4#

DCM: Diabetic cardiomyopathy; YWP: Yellow wine polyphenols; TNF-α: Tumor necrosis factor； IL: Interleukin-1

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsDCM group

2.5 各組大鼠的心肌組織氧化應(yīng)激水平的改變

造模干預(yù)12周后，各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，DCM組SD大鼠心肌組織MDA水平上升、SOD以及GSH-Px水平下降(P<0.05)；與DCM組相比，DCM+YWP組SD大鼠心肌組織MDA水平下降、SOD以及GSH-Px水平上升(P<0.05，表4)。

GroupMDA(nmol/mg)SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)Control6.5±1.118.0±2.025±1DCM15.7±1.5*6.8±1.5*10±2*DCM+YWP12.3±1.2#12.5±1.5#15±1#

DCM: Diabetic cardiomyopathy; YWP: Yellow wine polyphenols; MDA: Malondiadehyde; SOD: Superoxide dismutase; GSH-Px: Glutathione peroxidase

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsDCM group

2.6各組大鼠的心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變

造模干預(yù)12周后，提取各組大鼠心肌組織，Western blot檢測(cè)3組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2和Caspase-3(cleaved)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。WB結(jié)果顯示，與Control組相比，DCM組SD大鼠心肌組織中的Bax、Caspase-3(cleaved)蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)；與DCM組相比，DCM+YWP組SD大鼠心肌組織中的Bax、Caspase-3(cleaved)蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05，圖2)。

DCM: Diabetic cardiomyopathy; YWP: Yellow wine polyphenols

*P<0.05vsControl group；#P<0.05vsDCM group

3 討論

既往已有研究表明，單次腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素構(gòu)造I型糖尿病大鼠，糖尿病造模成功后4周大鼠心肌損傷明顯，8周即為糖尿病心肌病[6,7]。本研究采用單次腹腔注射65 mg/kg鏈脲佐菌素構(gòu)造I型糖尿病大鼠，心臟超聲顯示糖尿病心肌病大鼠的心功能明顯下降，符合糖尿病心肌病的心功能改變[8]。電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Control組，DCM組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，線粒體腫脹，空泡樣變，心肌的超微結(jié)構(gòu)損傷與楊銳和賈振等報(bào)道的糖尿病心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相一致[6,9]，由此可以認(rèn)為本研究糖尿病心肌病大鼠造模成功。

糖尿病心肌病是糖尿病重要的一種并發(fā)癥，表現(xiàn)為左心室功能不全，最終導(dǎo)致心力衰竭[10]。糖尿病心肌病可以通過炎癥、氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡從而引起心臟收縮功能和舒張功能障礙[11]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病患者左心室舒張末直徑和左心室收縮末期直徑增加，心臟射血分?jǐn)?shù)降低[8,12,13]。Sulaiman等研究表明Resveratrol通過上調(diào)肌漿鈣ATP酶，有效的改善糖尿病心肌病大鼠的心功能[14]。Resveratrol是一種多酚類化合物，有抗炎、抗氧化等作用，在心血管疾病中具有保護(hù)心血管作用[15]。與上述報(bào)道相一致，在本研究中發(fā)現(xiàn)黃酒多酚能夠改善糖尿病心肌病大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能。

炎癥因子和氧化應(yīng)激水平誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)展中扮演至關(guān)重要的角色[16]。血糖控制不佳容易導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，因?yàn)楦哐腔蛘卟▌?dòng)的葡萄糖水平能誘導(dǎo)急性氧化應(yīng)激，而這可能會(huì)最終導(dǎo)致糖尿病心肌病的發(fā)展。高血糖、葡萄糖自氧化以及糖基化終產(chǎn)物被報(bào)道在糖尿病血管和心肌中能增加活性氧水平[17]。炎癥因子能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激水平和導(dǎo)致左心室功能下降[18]。Rajesh等研究顯示抗炎治療通過減輕炎癥外也能降低氧化應(yīng)激水平和心肌細(xì)胞的凋亡，改善糖尿病心肌病的心臟功能[19]。Huang等報(bào)道外源性的Hydrogen Sulfide 通過抑制TLR4/NF-kB通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥和活性氧水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡[20]。Li等報(bào)道抗氧化劑α-LA通過增加Mn-SOD活性和增加GSH含量，有效的抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用[21]。Roslan等研究發(fā)現(xiàn)Quercetin通過降低心肌組織氧化應(yīng)激水平和炎癥因子，減輕心肌細(xì)胞凋亡，延緩糖尿病心肌病的發(fā)展[10]。楊銳等報(bào)道外源性H2S通過減輕糖尿病心肌病大鼠的氧化應(yīng)激水平，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡途徑，發(fā)揮保護(hù)心肌作用[6]。本研究結(jié)果提示黃酒多酚可能通過減輕心肌組織炎癥和氧化應(yīng)激水平，從而抑制糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過單次腹腔注射鏈脲佐菌素對(duì)SD大鼠進(jìn)行造模，通過灌胃給予黃酒多酚，發(fā)現(xiàn)黃酒多酚改善糖尿病心肌病大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其作用可能與黃酒多酚減輕糖尿病心肌病大鼠的心肌組織炎癥和氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

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Effectsofyellowwinepolyphenolsoncardiomyocyteapoptosisindiabeticcardiomyopathyrats

PAN Sun-lei1,2, LIN Hui1,2, LUO Hang-qi2, GAO Fei-dan2, MENG Li-ping2, GUO Yan2,GUO Hang-yuan1,2, CHI Ju-fang1,2△

(1. The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000;2. Department of Cardiology， Shaoxing People’s Hospital， Shaoxing Hospital of Zhejiang University, Shaoxing 312000, China)

Objective: To investigate the effects of yellow wine polyphenols on the apoptosis of cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy rats.MethodsThirty SD rats were randomly divided into control group (Control), diabetic cardiomyopathy group (DCM) and diabetic cardiomyopathy treated with yellow wine polyphenols group (DCM+YWP). A single intraperitoneal injection of 65 mg/kg streptozotocin (STZ) was utilized to establish a rat model of DCM. The rats in control group were treated with citrate buffer at the same dose of a single intraperitoneal injection. DCM+YWP group were treated with 18 mg/kg Yellow wine polyphenols by ig after modeling. After treated for 12 weeks, the general condition of rats were observed. The cardiac structure and function of the rats were observed by Doppler echocardiography. The ultrastructure of myocardium were observed using electron microscopy. The inflammation index of myocardial tissue was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The oxidative stress in myocardial tissues was assessed by oxidative stress detection kits. The expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 (cleaved) in myocardial were detected by Western blot.ResultsCompared with DCM group, the blood glucose levels and body weight of rats in the DCM+YWP group were not changed significantly. Echocardiography showed that left ventricular end-diastolic diameter, left ventricular end-systolic diameter were decreased (P<0.05), while fractional shortening and E/A ratio and Ea/Aa ratio were elevated (P<0.05). The levels of tumor factor-α(TNF-α), interleukin 1β(IL-1β) and interleukin 6(IL-6) in myocardium were decreased (P<0.05). The levels of oxidative stress malondiadehyde(MDA) were decreased and Superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSH-Px) were increased in myocardial tissue (P<0.05). The expression levels of Bax and Caspase-3 (cleaved) protein in myocardium were decreased (P<0.05), and the expression of Bcl-2 protein was increased (P<0.05).ConclusionYellow wine polyphenols can improve the diabetic cardiomyopathy rat cardiac function, attenuates inflammation and oxidative stress in diabetic rats, inhibit the apoptosis of cardiomyocytes in diabetic cardiomyopathy.

yellow wine polyphenols; diabetic cardiomyopathy; cardiomyocyte apoptosis; rat

R542.2；R587.1

A

1000-6834(2017)05-431-05

10.12047/j.cjap.5553.2017.104

浙江省科技廳公益項(xiàng)目(2016C33227)；浙江省自然科學(xué)基金(LY14H020002)；紹興市公益項(xiàng)目(2015B70046)；紹興市公益項(xiàng)目(2014B70068)

2017-01-16

2017-06-21

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Tel： 0575-88228888； E-mail： jf_chi@163.com