杜 斌, 朱 丹, 溫媛婷, 陳俊良, 唐篩娣, 孫潔蕓, 陳 煒, 龐慶豐△
(1. 江南大學無錫醫(yī)學院, 江蘇 無錫 214122; 2. 無錫市第三人民醫(yī)學院急診科, 江蘇 無錫 214041)
小劑量肝素對小鼠淹溺肺損傷SOD、MPO活性和MDA水平的影響*
杜 斌1, 朱 丹1, 溫媛婷1, 陳俊良1, 唐篩娣1, 孫潔蕓1, 陳 煒2, 龐慶豐1△
(1. 江南大學無錫醫(yī)學院, 江蘇 無錫 214122; 2. 無錫市第三人民醫(yī)學院急診科, 江蘇 無錫 214041)
目的探討小劑量肝素對淹溺誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用。方法60只小鼠隨機分為正常組、溺亡組和小劑量肝素組,每組各20只。肝素組在游泳前30 min腹腔注射肝素0.1 U/g。將小鼠放入內壁光滑的離心管內置入水中讓其自由游泳建立小鼠淡水淹溺肺損傷模型。正常組小鼠采用脊椎脫臼法處死,溺亡組和小劑量肝素組溺亡小鼠溺亡9 min后,取肺組織。稱重肺組織計算肺指數及肺濕/干重比;HE染色觀察小鼠肺組織的病理變化;取肺組織檢測肺組織丙二醛(MDA)、肺組織髓過氧化物酶(MPO),超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果與正常組相比,溺亡組小鼠肺指數增加,濕干重比 (W/D)比值增高;肺組織病理形態(tài)學炎癥明顯加重;肺組織勻漿SOD活性明顯降低,MDA含量、MPO活性升高(P<0.05,P<0.01)。與溺亡組相比,肝素組小鼠肺指數降低,濕干重比 (W/D)比值降低;肺組織病理形態(tài)學炎癥明顯減輕;肺組織勻漿SOD活性明顯升高,MDA含量、MPO活性降低(P<0.05,P<0.01)。結論小劑量肝素可以發(fā)揮抗炎和抗氧化作用,減輕淹溺誘導的小鼠急性肺損傷。
肝素; 淹溺; 肺損傷; 小鼠
heparin; drowning; lung injury; mice
淹溺是意外死亡的重要原因之一,每年全球發(fā)生淹溺死亡約40萬人[1]。淡水淹溺對肺的損傷是多方面的。淡水進入肺部后,肺順應性降低,肺泡表面活性物質被稀釋,病理學上主要表現為明顯的肺泡間質水腫、肺泡壁破裂,大量蛋白與紅細胞滲出。研究發(fā)現,肝素具有抗炎和抗氧化、改善微循環(huán)調節(jié)凝血功能紊亂等多種作用[2, 3],對多種原因引起的肺損傷均有較好的治療效果[4, 5], 然而不同劑量肝素抗凝作用是否伴有出血傾向,選用小劑量肝素0.1 U/g能否治療淡水淹溺肺損傷炎癥[6]尚不得知。故本實驗通過建立淡水淹溺肺損傷模型,觀察肺組織形態(tài)學變化以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性,探討小劑量肝素對淡水淹溺引起的急性肺損傷保護作用,為肝素臨床治療溺水患者提供實驗依據。
1.1 儀器與試劑
RM2135石蠟切片機(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司);80i正置熒光顯微鏡(日本尼康公司); ELX800全自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。MDA試劑盒(批號:20141202)、SOD試劑盒(批號:20141201), MPO試劑盒(批號:20141128)、 考馬斯亮蘭(批號:20150109)試劑盒(南京建成生物工程研究所),肝素注射液(批號:1406112),其他試劑為國產分析純。
1.2 實驗動物與分組
ICR 小鼠60 只,SPF 級,體質量(20±2) g,上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(合格證編號2007000564424),許可證號碼SCXK(滬)2012-0002。將實驗小鼠隨機分為3組(n=20):正常組、溺亡組和小劑量肝素組。實驗前一天小鼠禁食,自由飲水。肝素組在游泳前30 min腹腔注射肝素0.1 U/g[6]。
1.3 模型制備
將小鼠放入1個內壁光滑的離心管內(要求:離心管兩端有孔,將小鼠放置于管內并充滿水,此步驟在充滿水的桶內操作。水面高度與離心管上緣距離為10 cm),讓其自由游泳并仔細觀察,其第1次嗆水時按秒表計時,直至小鼠溺死。溺死后即可將小鼠完全從水中取出,建立小鼠溺亡模型[7]。小鼠溺死指征:口唇黏膜蒼白明顯,軀干強直,四肢無游泳動作,頭部不能浮出水面,隨后身體逐漸下沉至容器底部,抓取時無任何反抗動作。
1.4 肺指數及肺濕/干重比 (W/D)檢測
正常組小鼠采用脊椎脫臼法處死,溺亡組和肝素組溺亡小鼠溺亡9 min后,取肺組織進行磷酸鹽緩沖液漂洗后電子天平稱濕質量,將肺濕質量/小鼠體重,計算肺指數;然后將其置于75℃烤箱內烘烤72 h至恒重后稱干質量,計算肺組織W/D重比。
1.5 病理學檢測
將小鼠左側肺組織置于10%的中性甲醛固定液中固定24 h,石蠟包埋,4 μm切片,HE染色,鏡下觀察。
1.6 肺組織氧化應激指標測定
取右肺下葉肺組織制成肺組織勻漿(肺組織∶生理鹽水=1∶10),嚴格按照試劑盒說明書檢測MDA、SOD、MPO含量及活性。
1.7 統(tǒng)計學處理
2.1 各組小鼠肺指數的變化
Drown組和Heparin組小鼠肺指數明顯高于Control組(P<0.05,P<0.01),Heparin組小鼠肺指數低于Drown組(P<0.05, 表1)。Drown組和Heparin組小鼠肺W/D比值明顯高于Control組(P<0.05,P<0.01),Heparin組小鼠肺W/D比值低于Drown組(P<0.05, 表1)。
2.2肝素對小鼠淹溺肺損傷的病理組織學影響
正常組肺組織結構完整,肺泡腔清晰,未見炎癥細胞浸潤,肺泡無水腫。溺亡組肺組織損傷嚴重,肺泡破裂,肺間質和肺泡水腫,肺泡壁增厚,肺組織灶性出血, 并有以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤;在給與肝素治療后,溺亡所引起的肺損傷炎癥減輕,肺泡壁雖有水腫增厚,但肺組織未見出血(圖1)。
GroupLung/bodyindexW/DratioControl0.0079±0.00075.26±0.43Drown0.0115±0.0018*7.56±1.08*Heparin0.0096±0.0009##6.45±0.64##
*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsdrown group
Fig.1Histologic changes of mice lung tissues (HE staining)
A: Control group; B: Drown group; C: Heparin group
2.3 小鼠肺組織中MDA含量、MPO、SOD活性測定
與Control組相比,Drown組和Heparin組MDA含量、MPO活力顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.01);與Drown組相比,Heparin組MDA含量、MPO活力顯著降低(P<0.01),SOD活性顯著升高(P<0.01,表2)。
GroupMPO(U/g)MDA(nmol/mg.prot)SOD(U/mg.prot)Control2.11±0.151.19±0.0885.93±2.28Drown4.23±0.20**2.15±0.09**53.18±1.76**Heparin3.76±0.11**##1.74±0.07**##56.54±2.71**##
MPO: Myeloperoxidase; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase
**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsdrown group
淹溺性肺損傷是一種特殊病因引起的肺部疾病。目前認為淹溺性肺損傷是一個復雜的病理過程,炎癥反應和氧化應激在淹溺性肺損傷的作用逐漸受到重視[8,9]。炎癥反應在淹溺性肺損傷發(fā)生過程中有重要作用,有效抑制炎癥反應有利于減輕淹溺性肺損傷[10]。小劑量肝素可減輕氧化應激反應,抑制促炎細胞因子TNF-α和IL-1β釋放[11]。本研究發(fā)現本實驗中,與溺亡組相比,小劑量肝素組的小鼠肺組織中MPO活性降低,提示小劑量肝素能夠減輕小鼠淹溺性肺損傷的炎癥。溺水可以引起嚴重低氧血癥,氧代謝障礙必然會引起氧化應激損傷。氧自由基可破壞表面活性物質,又可損傷肺毛細血管內皮細胞,增加微血管通透性[12]。本研究發(fā)現溺水可引起小鼠肺組織SOD活性降低和MDA及MPO含量增高;肺指數和肺W/D比值明顯增高;肺泡破裂、肺間質和肺泡水腫、肺泡壁增厚等病理形態(tài)學變化,而肝素治療能夠逆轉上述的異常變化和減輕肺組織損傷程度,提示小劑量肝素可以通過抗氧化機制保護小鼠淹溺性肺損傷。
綜上所述,本研究提示小劑量肝素可以通過抗炎和抗氧化作用,減輕淹溺誘導的小鼠急性肺損傷。但是肝素對淹溺性肺損傷的保護作用的分子機制有待進一步研究,且由于其抗凝作用有出血的風險,因此不同劑量肝素對于小鼠淹溺性肺損傷的影響機制以及其是否會有出血風險還有待進一步深入研究。
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A
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10.12047/j.cjap.5510.2017.112
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