吳霞+艾小紅+彭順清

【中圖分類號】R251 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）10-00-01

胃癌是我國最常見的十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率均居消化道惡性腫瘤之首[1，2][3，4]，是危害人們的健康與生命的重大疾病之一。早期發(fā)現(xiàn)，早期治療對胃癌防治具有十分重要的臨床價(jià)值與意義。課題組前期運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Tissue Transglutaminase，TGM2）蛋白在胃粘膜癌變過程中呈現(xiàn)表達(dá)逐漸升高[5]。然而，TGM2蛋白在胃粘膜癌變過程中的作用及機(jī)制仍需深入研究，本文旨在了解TGM2在永生化胃上皮細(xì)胞GES1增殖中的作用，為闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

永生化胃上皮細(xì)胞GES1和胃癌MGC803細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，用10%血清胎牛的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒與主要試劑

pCDNA3.1真核表達(dá)載體由中南大學(xué)腫瘤研究所饋贈。高保真酶、T4DNALigandmerase購置寶生物工程（大連）有限公司。限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI購置Fermentas公司。一抗與二抗購置SantaCruz公司。

1.3 引物

采用Premier6.0軟件設(shè)計(jì)重組pCDNA3.1-TGM2和β-actin內(nèi)對照引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 構(gòu)建pCDNA3.1-TGM2真核表達(dá)質(zhì)粒

收集胃癌MGC803細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)擴(kuò)增條件：96℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，35循環(huán)，72℃10min?；厥誘GM2基因片斷，純化后用限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI酶切，分離純化后連接。將連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，選取菌落擴(kuò)增，PCR和酶切鑒定，送invitrogen公司進(jìn)行序列測定，即獲得pCDNA3.1-TGM2真核表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 TGM2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的建立

1.5.1 Western-blot檢測TGM2蛋白的表達(dá)

將GES1細(xì)胞接種于6孔板中，采用Lipofactamine2000脂質(zhì)體進(jìn)行pCDNA3.1-TGM2真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（pCDNA3.1為載體對照），G418篩選后匯合克隆，建立TGM2穩(wěn)定表達(dá)的GES1細(xì)胞系，即GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1。提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，以30?g/泳道的蛋白進(jìn)行10%不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉，鼠抗人TGM2單抗（1：1000）與抗β-actin單體（1：2000）4℃孵育過夜，洗膜后羊抗鼠二抗（1：1000）室溫孵育，洗膜、發(fā)光、曝光、顯影與定影，分析TGM2蛋白的表達(dá)。

1.5.2 免疫熒光染色

將GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔板中，制作細(xì)胞爬片，洗滌細(xì)胞，用甲醇與丙酮（1：1）混合液固定；洗滌細(xì)胞，0.1%TritonX-100室溫孵育20min，洗滌細(xì)胞，用鼠抗人TGM2單抗（1：1000）37℃孵育1h，洗滌細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗37℃孵育1h，洗滌細(xì)胞，甘油封片，制備細(xì)胞爬片，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 繪制細(xì)胞生長曲線

將GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)平行孔（設(shè)空白對照孔），培養(yǎng)24h后，每孔加入20?L5mg/mL的MTT，培養(yǎng)4h，加入150?L的DMSO，溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，置于酶標(biāo)儀中用490nm波長測定吸光度值。每天檢測一次，每次重復(fù)測量3次，取平均值進(jìn)行校正（測量值與第一天測量值之商），校正值代表測量值，連續(xù)檢測7天，將測量值繪制在坐標(biāo)紙上，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 細(xì)胞周期和凋亡檢測

將GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1細(xì)胞用無血清RPMI1640培養(yǎng)細(xì)胞24h后，用血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，用4℃預(yù)冷70%乙醇固定2h，PBS洗滌，加入含20mg/LRNA酶Tris-HCl液，37℃孵育30min，用50mg/L碘化丙錠染色，收集送公司進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測細(xì)胞周期中各個(gè)時(shí)相比例與細(xì)胞凋亡率，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)，增殖指數(shù)（PI）=（S+G2）/（G0/1+S+G2）。

1.8 平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)

將GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1細(xì)胞以500個(gè)/孔接細(xì)胞種于6孔板中，每組設(shè)3平行孔，靜置培養(yǎng)1周后，用3：1甲醇與冰乙酸的混合液固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)（大于50個(gè)細(xì)胞），計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.9 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

用瓊脂糖與RPMI1640培養(yǎng)液配制0.5%的底層瓊脂，將GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1細(xì)胞調(diào)整密度為3×103個(gè)/mL，用瓊脂糖與RPMI1640培養(yǎng)液混合加熱溶解后，加入細(xì)胞，調(diào)整密度為5×103個(gè)/孔，配制0.3%頂層瓊脂，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)2周后，觀察集落（≥50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)集落）形成情況，每孔隨機(jī)選擇10個(gè)低倍視野計(jì)數(shù)集落數(shù)，每視野與每孔均重復(fù)3次，計(jì)算每孔形成集落數(shù)平均，計(jì)算細(xì)胞的集落形成率=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以Mean+SD表示（即±s），兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，三組及以上比較采用單因素方差分析（OnewayANOVA），以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-TGM2真核表達(dá)質(zhì)粒的重組

提取MGC803細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，加入TGM2引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，TGM2擴(kuò)增產(chǎn)物回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化，經(jīng)HindIII和XhoI酶切（圖1）和測序鑒定，獲得pCDNA3.1-TGM2真核表達(dá)質(zhì)粒，測序后序列與目的序列完全一致。

2.2 建立TGM2穩(wěn)定高表達(dá)GES1細(xì)胞系

將pcDNA3.1-TGM2真核表達(dá)質(zhì)粒（pCDNA3.1質(zhì)粒為對照）轉(zhuǎn)染GES1細(xì)胞，經(jīng)G418篩選2周，匯合克隆培養(yǎng)，建立TGM2穩(wěn)定高表達(dá)的GES1細(xì)胞系，即GES1-TGM2細(xì)胞（GES1- pcDNA3.1為對照）。經(jīng)細(xì)胞免疫熒光與Western-blot檢測GES1細(xì)胞中TGM2表達(dá)情況，結(jié)果顯示，GES1-TGM2細(xì)胞中TGM2蛋白表達(dá)明顯高于GES1- pcDNA3.1細(xì)胞（圖2）。

A：細(xì)胞免疫熒光觀察GES1細(xì)胞中TGM2蛋白的表達(dá)。

B：Western-blot檢測GES1細(xì)胞中TGM2蛋白的表達(dá)，1：GES1-TGM2細(xì)胞，2：GES1-pcDNA3.1細(xì)胞。

2.3 TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞生長的影響

將GES1-TGM2、GES1-pcDNA3.1和GES1細(xì)胞接種于96孔板后，采用MTT法測定三組的吸光度值，連續(xù)檢測7天，繪制不同細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果顯示，GES1-TGM2細(xì)胞的生長速度較GES1-pcDNA3.1和GES1明顯加快（圖3，P<0.01）。結(jié)果提示TGM2高表達(dá)可以促進(jìn)GES1細(xì)胞的生長。

2.4 TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞停泊依賴性生長的影響

采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞停泊依賴性生長的影響，結(jié)果顯示，GES1-TGM2細(xì)胞的克隆形成率較GES1-pcDNA3.1和GES1細(xì)胞明顯增多（表2，P<0.01）。結(jié)果提示TGM2高表達(dá)可以促進(jìn)GES1細(xì)胞的增殖。

2.5 TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞非停泊依賴性生長的影響

采用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞非停泊依賴性生長的影響，結(jié)果顯示，GES1-TGM2細(xì)胞形成的集落較GES1-pcDNA3.1和GES1細(xì)胞體積大，集落數(shù)目多，集落形成率高，（表3，P<0.01）。結(jié)果提示TGM2高表達(dá)可以促進(jìn)GES1細(xì)胞的停泊非依賴性生長，提升細(xì)胞的增殖能力。

2.6 TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞周期分布的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測GES1-TGM2細(xì)胞的周期，結(jié)果顯示，GES1-TGM2細(xì)胞群中G0/G1期百分率較GES1-pcDNA3.1和GES1細(xì)胞明顯減少，而S期細(xì)胞的百分率則明顯增加（表4，P<0.01），TGM2高表達(dá)后GES1細(xì)胞的增殖指數(shù)升高。結(jié)果提示，TGM2高表達(dá)后增加細(xì)胞增殖指數(shù)而促進(jìn)GES1細(xì)胞的增殖。

2.7 TGM2高表達(dá)對GES1細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測TGM2高表達(dá)后對GES1細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，GES1-TGM2細(xì)胞的凋亡率明顯低于GES1-pcDNA3.1和GES1細(xì)胞（表5，P<0.01）。結(jié)果表明TGM2高表達(dá)可抑制GES1細(xì)胞的凋亡。

3 討論

組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Tissue Transglutaminase，TGM2）是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族中成員之一，由687個(gè)氨基酸殘基組成、分子量78KD的鈣離子依賴性的多功能蛋白，其包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即含纖維連接蛋白結(jié)合位點(diǎn)的N-端β三明治結(jié)構(gòu)域、含底物結(jié)合位點(diǎn)和催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的α/β催化核心區(qū)及含GTP結(jié)合位點(diǎn)、腎上腺素受體作用位點(diǎn)及磷脂酶Cδ1位點(diǎn)的兩個(gè) C-端β桶狀結(jié)構(gòu)[6]。

近年來，大量的研究表明，TGM2蛋白表達(dá)與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。TGM2蛋白可以激活NF-κB通路，誘導(dǎo)Bcl-xL和BFLI抗凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。TGM2在乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等惡性腫瘤中表達(dá)均升高[8]。有研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TGM2蛋白表達(dá)上調(diào)[9]。TGM2蛋白可被表皮生長因子（EGF）誘導(dǎo)后表達(dá)，導(dǎo)致化療藥物誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡下降 [10]。TGM2表達(dá)激活酪氨酸激酶FAK，活化抗凋亡信號通路如PI3/AKT等，促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。TGM2表達(dá)后促進(jìn)TGF誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象，瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療抵抗，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加，然而，抑制TGM2表達(dá)后，TGF-β則無法誘導(dǎo)使瘤細(xì)胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象[12]。另外，TGM2表達(dá)可促進(jìn)腫瘤間質(zhì)中TGF-β分泌增加，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞產(chǎn)生EMT，提高瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)TGM2 高表達(dá)后，GES1細(xì)胞的生長加速，增殖能力增強(qiáng)，S期細(xì)胞比例明顯增多，G1細(xì)胞比例降低，細(xì)胞增殖指數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率降低，這些結(jié)果表明，TGM2導(dǎo)入GES1細(xì)胞后，通過影響細(xì)胞周期與凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖。與以往研究基本一致，為證實(shí)TGM2為胃癌早期診斷潛在分子標(biāo)志物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？傊?，本研究證實(shí)了TGM2通過增加GES1細(xì)胞增殖指數(shù)，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。然而，TGM2影響細(xì)胞的生物學(xué)表型涉及復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，仍有待后續(xù)的深入研究。

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