韓聚強，杜靜華，徐小潔，劉文鵬，梁吉光，，李佳睿，葉棋濃

1.陸軍總醫(yī)院 肝病科，北京 100700；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 a.中西醫(yī)結(jié)合肝病科；b.感染科；河北 石家莊 050051；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 介入科，吉林 長春 130021

小鼠原代肝星狀細胞的分離、鑒定及生物學(xué)功能分析

韓聚強1，3，杜靜華2a，徐小潔3，劉文鵬2b，梁吉光4，3，李佳睿4，葉棋濃3

1.陸軍總醫(yī)院 肝病科，北京 100700；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 a.中西醫(yī)結(jié)合肝病科；b.感染科；河北 石家莊 050051；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 介入科，吉林 長春 130021

目的：探索C57.BL/6J小鼠肝星狀細胞（HSCs）分離、純化的可行方案，并評價該法所得HSCs的生物學(xué)特性。方法：經(jīng)肝門靜脈，先用不含鈣鎂離子的D-Hanks液充分灌注肝臟，再以適宜濃度的鏈霉蛋白酶和Ⅳ型膠原酶順序灌注，隨后Percoll非連續(xù)密度梯度離心分離、純化HSCs，臺盼藍拒染法檢測HSCs活性，光鏡觀察體外培養(yǎng)的HSCs的形態(tài)學(xué)變化，免疫細胞化學(xué)鑒定α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和結(jié)蛋白的表達，Western印跡檢測α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達。結(jié)果：純化后每只小鼠獲得HSCs約5.5×105個，純度及存活率均大于95%；免疫細胞化學(xué)技術(shù)證實培養(yǎng)的HSCs分別表達α-SMA和結(jié)蛋白；Western印跡顯示原代HSCs體外培養(yǎng)7 d時，α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達量達到峰值。結(jié)論：建立的分離、純化方案可獲得高純度、高活率、功能正常的小鼠原代HSCs，為進一步研究肝纖維化的發(fā)病機制提供了技術(shù)保障。

肝星狀細胞；原代培養(yǎng)；細胞分離；小鼠

肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）是引起肝纖維化的關(guān)鍵細胞，主要分布于肝臟竇周間隙（Disse間隙），是合成、分泌細胞外基質(zhì)的重要來源[1-2]。肝炎病毒感染、酗酒、脂肪堆積、藥物毒物損傷等各種因素均可導(dǎo)致HSCs激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞，最后導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[3]。因此，HSCs激活是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年，隨著原代細胞體外分離、培養(yǎng)技術(shù)的逐漸成熟，探索成熟穩(wěn)定的HSCs分離與體外培養(yǎng)技術(shù)平臺，對于明確肝纖維化的發(fā)病機制具有重要現(xiàn)實意義。基于此，我們在既往小鼠HSCs原代分離、培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行適當(dāng)改進，建立了穩(wěn)定、簡便、經(jīng)濟的小鼠HSCs分離方法，為進一步深入研究HSCs的生物學(xué)行為創(chuàng)造了條件。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57.BL/6J小鼠，體重20～25 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食、進飲，實驗前禁食12 h。

Ⅳ型膠原酶、DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）為Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、D-Hank's液、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）為Gibco公司產(chǎn)品；Percoll分離液為GE Healthcare公司產(chǎn)品；小鼠抗結(jié)蛋白（des?min）單克隆抗體、小鼠抗α-平滑肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；熒光標記的羊抗小鼠單抗二抗為Invitrogen公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；離心機為Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 小鼠原代HSCs的分離

用5%水合氯醛（0.01 mL/g）腹腔麻醉小鼠，仰臥位固定，腹部打開暴露門靜脈及下腔靜脈，將9號輸液針插入門靜脈結(jié)扎固定，用D-Hank's液（含肝素25 U/mL）灌注肝臟，當(dāng)肝臟充盈后反復(fù)打開、關(guān)閉下腔靜脈，充分灌注3 min；更換鏈霉蛋白酶溶液（0.05%）繼續(xù)灌注5 min，再換Ⅳ型膠原酶溶液（1%）灌注7 min；當(dāng)肝臟表面呈龜背樣變時，摘除肝臟置于無菌器皿中，剔除肝臟背膜，剪碎肝臟組織，加入含1%DNaseⅠ的鏈霉蛋白酶/膠原酶溶液 5 mL，37℃消化 25 min，用 70 μm孔徑的細胞篩濾除未消化組織；將上清細胞懸液低溫40 r/min離心3 min，繼續(xù)低溫580 r/min離心8 min，取細胞沉淀，加入8 mL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸混勻；將2 mL細胞懸液按同等比例分別緩慢加到50%、25%Percoll分離液中，低溫900 r/min離心20 min，小心吸取25%與50%Percoll之間的細胞層，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)900 r/min離心10 min，最終將上清液加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 原代HSCs的培養(yǎng)

原代 HSCs以 2×105～5×105/mL 的濃度接種至培養(yǎng)瓶，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，36～48 h首次換液，之后每2 d更換1次培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。

1.4 原代HSCs的活率鑒定

用0.04%臺盼藍溶液鑒定細胞存活率，普通光鏡下未著色者為活細胞。

1.5 原代HSCs的免疫組化鑒定

將分離的原代HSCs培養(yǎng)于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，分別于1、3、7 d收集細胞，用4%冷的多聚甲醛固定15 min，0.5%Triton X-100覆蓋細胞10 min，前后分別用小鼠抗結(jié)蛋白抗體（1∶200）、小鼠抗α-SMA抗體（1∶200）于4℃避光過夜，用熒光標記的二抗室溫避光孵育1 h，DAPI染核，封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 HSCs標志分子免疫印跡鑒定

將體外培養(yǎng)的原代HSCs裂解后提取蛋白，隨后行Western印跡，步驟大致如下：將細胞裂解物用PBS清洗后加入SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，一抗室溫作用1 h，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG二抗室溫作用1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 HSCs的得率、存活率和純度鑒定

每只C57.BL/6J雄性小鼠分離純化所得HSCs約為5.5×105個，存活率和純度均大于95%。

2.2 倒置顯微鏡細胞形態(tài)學(xué)觀察

新分離的HSCs在倒置顯微鏡下呈球形，折光性強，懸浮于培養(yǎng)液中（圖1A）；4 h后大部分細胞已貼壁，呈扁圓型，內(nèi)含光亮的脂滴，少量細胞已開始伸突；至48 h可見大量細胞伸展生長（圖1B）；培養(yǎng)7 d后，HSCs已充分展開，體積明顯增大，細胞呈典型的星形或多邊形，細胞內(nèi)顆粒明顯減少，細胞逐漸融合，增殖細胞形態(tài)較大，并呈局灶性生長，被完全激活（圖1C）；培養(yǎng)14 d，細胞由局灶性生長轉(zhuǎn)為單層生長，鋪滿培養(yǎng)板孔，細胞呈典型的成纖維細胞形態(tài)（圖1D）。

圖1 體外分離、培養(yǎng)的HSCs在普通光鏡下的形態(tài)學(xué)變化（×200）

2.3 免疫細胞化學(xué)染色監(jiān)測

結(jié)蛋白和α-SMA為HSCs激活的分子標志。免疫細胞化學(xué)技術(shù)進一步證實，培養(yǎng)7 d時，結(jié)蛋白和α-SMA共定位與細胞質(zhì)（圖2）。

圖2 體外培養(yǎng)7 d時HSCs表達α-SMA和結(jié)蛋白標志分子（×200）

2.4 Western印跡檢測HSCs特異性標志蛋白

Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA是HSCs成熟活化后分泌產(chǎn)生的標志分子。Western印跡證實，原代HSCs在體外培養(yǎng)7 d時，2種標志分子即可達到分泌峰值（圖3）。

3 討論

HSCs為肝臟主要非實質(zhì)細胞之一，正常情況下位于Disse間隙，緊貼肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞，形態(tài)上常伸出星狀突起。靜息狀態(tài)下，HSCs內(nèi)富含脂滴，主要發(fā)揮貯存維生素A、脂肪滴及合成和分泌膠原等胞外基質(zhì)成分的作用；當(dāng)肝臟受到損傷時，星狀細胞逐漸激活，胞質(zhì)中脂滴消失，α-SMA表達增多，細胞外基質(zhì)分泌增加。目前認為，HSCs持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]，因此，研究HSCs各種生物學(xué)行為意義重大。由于HSCs在肝臟中比例較低，且小鼠體積較小，分離HSCs的操作難度較大鼠要大，因此以往有關(guān)分離、體外培養(yǎng)HSCs的研究相對集中于大鼠。但對于各種研究而言，操作小鼠的重復(fù)性及經(jīng)濟性要高很多，因此建立簡便、經(jīng)濟、高效的小鼠HSCs分離、體外培養(yǎng)及鑒定技術(shù)，對探討各種致病因素引起肝臟纖維化發(fā)生的分子機制具有重要的現(xiàn)實意義。

圖3 Western印跡檢測HSCs體外培養(yǎng)不同時間表達α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的規(guī)律

本研究采用在體原位肝臟灌注并結(jié)合非連續(xù)密度梯度離心技術(shù)，建立了分離、純化與體外培養(yǎng)小鼠HSCs的方法。通過多次試驗發(fā)現(xiàn)，影響HSCs分離及培養(yǎng)成功的主要因素包括：①門靜脈插管灌流。門靜脈插管要迅速、準確，進針切勿過深，灌流時應(yīng)盡可能勻速，以保證肝臟每葉均能很好地灌注。我們采用的灌注速度為5 mL/min，無論是灌注D-Hank's液還是消化液，灌注時都應(yīng)避免氣泡進入門靜脈在肝內(nèi)血管中形成空氣栓塞，導(dǎo)致灌注不充分。②鏈霉蛋白酶的應(yīng)用。鏈霉蛋白酶可以選擇性消化肝細胞[6]，因此傳統(tǒng)分離HSCs時都以鏈霉蛋白酶作為主要消化酶液，但如用量不當(dāng)同樣對HSCs有一定的損傷。我們經(jīng)過多次摸索，在體灌注時先行用鏈霉蛋白酶灌注5 min破壞肝細胞，隨后改為膠原酶繼續(xù)灌注7 min，最后再用兩者混合液繼續(xù)消化，發(fā)現(xiàn)可以很好地保證HSCs的純度和活力。③密度梯度分離介質(zhì)。密度梯度分離介質(zhì)的選擇及密度梯度離心體系的建立，是純化HSCs并提高獲得率的重要步驟。與其他密度梯度介質(zhì)相比，我們選用的Percoll分離介質(zhì)具有價廉、梯度易制備及可直接觀測等優(yōu)點，同時易于從黏附的其他細胞上洗脫下來。④游離肝臟時應(yīng)盡量去除肝臟包膜。肝組織機械分離時應(yīng)盡量清除肝臟被膜，盡可能減少內(nèi)皮細胞的污染。由于HSCs與Kuppfer細胞密度相近，特別容易造成污染，因此密度梯度離心后切忌貪多，禁止過度吸取界面下的細胞導(dǎo)致Kuppfer細胞污染[7]。⑤體外消化。酶液消化不充分可導(dǎo)致肝細胞與HSCs黏附在一起不易洗脫，最終降低了細胞純度。如酶液消化過度，必然導(dǎo)致細胞損傷，進而引起分離后細胞體外存活能力下降。⑥小鼠的周齡和體重。小鼠周齡越小，細胞增殖力越好，但此時往往因體重較低不易操作；如周齡過大，分離操作確實容易，但由于細胞增殖能力較低，會影響后續(xù)實驗進行。經(jīng)過多次摸索，我們一般選擇8～12周齡、體重22 g左右的小鼠作為實驗對象。⑦細胞接種數(shù)量。HSCs分離后接種濃度和數(shù)量非常重要，接種濃度太低或數(shù)量太少，都會減弱細胞自分泌和旁分泌細胞因子的刺激作用，使細胞難以生長。我們的經(jīng)驗，一般接種濃度2×105/mL左右為宜。

目前，HSCs的鑒定尚無特異性指標，因此形態(tài)學(xué)觀察顯得尤其重要。新分離的HSCs胞漿中含有大量脂滴，在紫外光激發(fā)下可見藍綠色熒光，該熒光觀察雖簡便快捷，但容易淬滅，不能長時間觀察。隨著生長貼壁，細胞進入活化階段，此時HSCs具有肌成纖維細胞的一些特征，因此常用肌成纖維細胞特有的標志蛋白α-SMA和結(jié)蛋白進行鑒定[8]。本實驗中，我們在體外培養(yǎng)7 d后分別對分離所得HSCs進行了免疫細胞化學(xué)染色，結(jié)果證實了HSCs同時表達α-SMA和結(jié)蛋白。業(yè)已證實，激活的HSCs分泌的細胞外基質(zhì)主要成分為膠原蛋白。為了進一步驗證分離所得細胞的生物學(xué)功能，我們分別對分離培養(yǎng)不同時間的HSCs進行蛋白印跡，發(fā)現(xiàn)常規(guī)培養(yǎng)7 d，HSCs分泌膠原蛋白及α-SMA的能力即達峰值，這為今后體外研究HSCs的活化時間及相應(yīng)的分子、生物學(xué)功能等提供了有力的生物學(xué)依據(jù)。

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Isolation,Identification and Evaluation of Hepatic Stellate Cells from C57.BL/6J Mouse

HAN Ju-Qiang1,3,DU Jing-Hua2a,XU Xiao-Jie3,LIU Wen-Peng2b,LIANG Ji-Guang4,3,LI Jia-Rui4*,YE Qi-Nong3*
1.Department of Liver Disease,PLA Army General Hospital,Beijing 100700;2.a.Department of Traditional and Western Medical Hepatology;b.Department of Infectious Disease;Third Hospital of Hebei Medical University,Shi?jiazhuang 050051;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;4.Department of Interventional Radiogra?phy,First Hospital of Jilin University,Changchun 130021;China

Objective:To investigate and evaluate the feasible methods of isolating and purifying hepatic stellate cells（HSCs） from C57.BL/6J mousein vitro.Methods:Mouse's liver was infused with D-Hank fluids via portal veinin situ.Subsequently,HSCs were isolated by discontinuous Percoll gradient centrifugation after liver was di?gested with pronase E,Ⅳtype collgenase and DNase,the cell viability was determined by trypan blue exclusiontest.The morphological character of HSCs was observed by microscope.Both α-SMA and desmin were identified by immunocytochemistry staining.Both α-SMA andⅠtype collagen was detected by Western blot.Results:The yield amount of HSCs was about 5.5×105per mouse's liver.Both viability and purity were more than 95%.Immu?nocytochemistry staining demonstrated that α-SMA and desmin were positive in HSCs culturedin vitro.Western blot assay showed that α-SMA andⅠtype collagen were expressed extremely at 7thday.Conclusion:The estab?lished protocol is so successful in isolating and culturing the primary mouse HSCs that provides a technical sup?port for research of relevant liver fibrogenesis in the future.

hepatic stellate cell;primary culture;cell isolation;mouse

Q24

A

1009-0002（2017）05-0600-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com;LI Jia-Rui,E-mail:jiaruili1971@sina.com

2017-04-17

首都醫(yī)學(xué)特色發(fā)展基金（z141107002514057）

韓聚強（1973- ），男，博士，主任醫(yī)師，（Email）hanjuqiang2014@126.com；杜靜華（1985- ），女，博士，主治醫(yī)師；二者為共同第一作者