田 芳 羅偉光 郭旭麗 郭 靖 羅奇志 王慧鵬 鄒義洲

(中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫學(xué)系，長沙 410008)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

抗主要組織相容性相關(guān)蛋白MICA/B的單克隆抗體制備及應(yīng)用①

田 芳 羅偉光 郭旭麗 郭 靖 羅奇志 王慧鵬 鄒義洲

(中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫學(xué)系，長沙 410008)

目的制備抗主要組織相容性相關(guān)蛋白A/B(MICA/B)的單克隆抗體并對其特異性進(jìn)行驗證。方法以重組MICA*012蛋白免疫小鼠后將其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合和篩選得雜交瘤細(xì)胞株，并用ELISA對其中9B10細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行效價檢測以及通過Western blot、Luminex、免疫熒光對其特異性進(jìn)行檢測。結(jié)果獲得6株雜交瘤細(xì)胞株，其中9B10細(xì)胞株產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)9B10的最低反應(yīng)濃度為0.02 ng/μl,且mAb 9B10可應(yīng)用于Western blot、Luminex和免疫組化熒光試驗對MICA和MICB分子的檢測。結(jié)論成功獲得可同時檢測MICA和MICB表達(dá)的單克隆抗體9B10。

MICA ；MICB；單克隆抗體；雜交瘤細(xì)胞

主要組織相容性相關(guān)蛋白A和B[Major histocompatibility complex(MHC)class Ⅰrelated chain A and B，MICA/B]是定位于人類第6號染色體短臂上的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類相關(guān)基因A 和B編碼的多態(tài)性細(xì)胞跨膜糖蛋白分子，主要由三個胞外區(qū)(α1，α2，α3)、一個跨膜區(qū)(TM)和一個胞質(zhì)尾區(qū)構(gòu)成[1，2]。MICA/B蛋白主要表達(dá)在上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞膜上[3-5]。 而部分細(xì)胞膜表面的MICA可在蛋白酶的作用下水解片段釋放于細(xì)胞外液形成可溶性MICA(sMICA)，此外MICA還可呈顆粒型分泌到胞外[6，7]。這三種不同形式的MICA分子都沒有抗原提呈作用，膜型MICA蛋白地與NK細(xì)胞上NKG2D受體結(jié)合后為效應(yīng)細(xì)胞的活化提供活化信號，在抗感染、抗腫瘤、移植排斥及自身免疫等方面發(fā)揮效應(yīng)[8]；可溶性MICA(sMICA)競爭性與NK細(xì)胞活化性受體NKG2D結(jié)合阻礙NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用，是腫瘤逃逸機制之一[9]；顆粒型MICA不僅可下調(diào)細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)，而且能降低NK 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[10]。目前國內(nèi)外研究已證實MICA蛋白的表達(dá)水平與腫瘤、自身免疫性疾病、移植排斥等多種炎性疾病相關(guān)[11-13]。顯然，以MICA為靶點的研究已成為免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域的熱點。在科研和已臨床檢測中都需要用到MICA抗體，目前雖然已有商業(yè)化的MICA抗體可用于ELISA、Western blot等實驗，但在實踐中，我們發(fā)現(xiàn)已有的商業(yè)化抗體效價偏低且應(yīng)用范圍窄。因此，我們在制備了12種MICA和4種MICB多態(tài)性重組蛋白的基礎(chǔ)上，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備高效價的抗MICA和MICB的單克隆抗體，為研究MICA/B分子的生物學(xué)功能及其在免疫學(xué)中的應(yīng)用提供更好的工具。

1 材料與方法

1.1材料 4周雌性BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0、rMICA和rMICB、mAb 6B3均為中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系保存；胎牛血清(FBS)、羊血清、次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷酸(HAT)培養(yǎng)基、HT培基、聚乙二醇、完全弗氏佐劑均購自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自GE公司；PE、FITC、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自BioRad公司；mAb AMO1(anti-MICA)購自BAM公司；mAb MAB1599(anti-MICB)購自RD公司；PNGase F試劑盒購自Biolabs公司；Protien A/G購自Invitrogen公司;蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司等。

1.2方法

1.2.1雜交瘤細(xì)胞的制備

1.2.1.1動物免疫 50 μg純化的rMICA*012重組蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化后皮下多點注射到雌性BALB/c小鼠。此后第15、21、28天，依次將50 μg rMICA*012蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化后皮下注入小鼠體內(nèi)以加強免疫。第2次加強免疫1周后，從小鼠尾部取少量靜脈血，通過間接ELISA檢測血清效價。效價檢測合格后，在第3次免疫后的一周或細(xì)胞融合前3天，腹腔內(nèi)注射PBS稀釋的50 μg rMICA*012重組蛋白。無菌分離收集小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞。

1.2.1.2細(xì)胞融合 將增殖期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與新鮮分離的免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞按5:1的比例混勻，離心棄上清后加入50%聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合，然后慢慢加入RPMI1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心棄上清，用HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7～10 d后換用HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.1.3陽性克隆篩選和培養(yǎng) 我們采用ELISA法對細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選。聚苯乙烯板分別用100 μl 500 ng/ml rMICA*012包被4℃過夜。次日所有孔用0.05% Tween20-PBS洗滌3次。再用5%脫脂奶粉-PBS 37℃封閉2 h，如上述洗滌3次。然后37℃孵育100 μl樣本2 h。同上洗滌3次后加入標(biāo)志HPR的羊抗鼠IgG的抗體(1∶5 000稀釋)，37℃孵育1 h。洗滌3次再加入TMB顯色液100 μl/孔，顯色15 min后加入50 μl 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，最后在450 nm處讀取吸光值。將陽性孔雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，直至培養(yǎng)孔僅出現(xiàn)單一細(xì)胞克隆并篩選其上清呈陽性反應(yīng)。

1.2.1.4單克隆抗體收集與純化 對篩選出的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞9B10細(xì)胞采用RPMI1640完全培基擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液-80℃存儲備用。待收集一定量的9B10細(xì)胞培養(yǎng)上清后進(jìn)行離心去沉渣保留上清按說明書要求用Protien A/G進(jìn)行單抗的純化，純化的抗體用蛋白濃縮管(10 kD)、Tis-HCl pH7.4和PBS對單抗進(jìn)行濃縮和緩沖液的置換。

1.2.2雜交瘤細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1抗體效價及濃度測定 采用間接ELISA法對雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清mAb效價進(jìn)行檢測，方法同陽性篩選。用蛋白濃度測定試劑盒對濃縮后的mAb濃度進(jìn)行檢測，標(biāo)記，-80℃保存。

1.2.2.2Western blot 法檢測mAb的特異性 取40 ng rMICA和rMICB經(jīng)10%SDS-PAGE后濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉-PBS液37℃封閉1 h。洗滌后加入1∶100稀釋的9B10細(xì)胞上清，4℃過夜。0.1%Tween20-PBS洗膜3次，每次10 min，加入1∶5 000倍稀釋的羊抗鼠HRP-IgG，37℃孵育2 h，PBST洗膜3次，每次15 min，加入化學(xué)發(fā)光顯色液，立即用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)采集圖像。按照說明書將1 μg的rMICA和rMICB進(jìn)行去糖基化處理，按照上述進(jìn)行Western blot檢測。HeLa、HCT116、L02細(xì)胞采用細(xì)胞裂解液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tis-HCl pH8.0，1%NP-40，1×蛋白抑制劑)冰上裂解30 min，4℃離心15 min后取上清并測濃度，取20 μg總蛋白按說明書進(jìn)行去糖基化處理。40 μg的未去糖基化蛋白和20 μg去糖基化蛋白同上進(jìn)行Western blot檢測。

1.2.2.3Luminex檢測抗體 向Luminex專用板每孔加入25 μl PBS(含10%羊血清)；每個對應(yīng)孔中加入15 μl檢測抗體(9B10、AMO1、MAB1599、W6/32，濃度均為飽和濃度5 μg/ml)。室溫微搖孵育20 min，離心后對應(yīng)孔加入20 μl MICA和MICB微球，混勻后室溫孵育45 min，離心后采用0.05%tween20/PBS洗滌3次，每孔加入60 μl 1%PE-羊抗鼠IgG(PBS稀釋，含10%羊血清)混勻室溫孵育30 min，離心洗滌3次，最后每孔加入60 μl PBS，混勻后上機檢測(Luminex 2000)，計算平均熒光強度。

1.2.2.4免疫熒光 在24孔板中所用的孔中各放1片無菌專用爬片，以1×105個/孔分別接種HeLa、HCT116、L02細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長至20%左右取出玻璃爬片，用預(yù)冷的洗滌液(含2%FBS和0.1%疊氮化鈉的PBS)洗滌3次后加入200 μl預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定15 min；洗滌3次后用10%羊血清37℃封閉1 h；4℃孵育一抗過夜(W6/32、9B10、mouse-IgG)；次日洗滌后加入HRP-羊抗鼠的IgG 37℃孵育1 h，洗滌3次后加入抗熒光淬滅封片劑封片，盡快進(jìn)行熒光顯微鏡檢。

1.2.2.5流式細(xì)胞 將HeLa、HCT116、L02細(xì)胞用2.5%的胰酶消化后收集至1.5 ml EP管中，并采用洗滌液(含2%FBS和0.1%疊氮化鈉的PBS)離心洗滌3次后，2%FBS-PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)。每種細(xì)胞各以1×106個細(xì)胞分裝至4個EP管中，標(biāo)記。每個對應(yīng)管中加入200 μl對應(yīng)的一抗(9B10、6B3、W6/32，濃度均為500 ng/ml)，4℃孵育30 min后用洗滌液洗滌3次，再向各孔加入200 μl FITC-羊抗鼠IgG(用2%FBS-PBS按1∶200稀釋后使用)。4℃孵育30 min，采用洗滌液洗滌3次后各孔加入400 μl 2%FBS-PBS并吹打均勻，上機檢測熒光強度。

2 結(jié)果

2.1雜交瘤細(xì)胞的制備與克隆篩選 經(jīng)過3次免疫BABL/c小鼠進(jìn)行皮下多點注射rMICA*012和腹腔注射高表達(dá)MICA*001和MICA*002的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞HMY，并用以MICA和MICB重組蛋白作為抗原的間接ELISA方法檢測血清抗體效價，獲得兩只符合用于制備雜交瘤細(xì)胞的免疫小鼠，脫臼處死并取其脾細(xì)胞在50%聚乙二醇中與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，克隆細(xì)胞于10塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第一次陽性克隆篩選從960孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清中篩選出38孔含有抗rMICA*012陽性的細(xì)胞克隆，然后立即對這38株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆篩選，為了驗證這些細(xì)胞株可否與多種MICA和MICB等位基因重組抗原反應(yīng)。我們采用r-MICA*001、r-MICA*002、r-MICA*004、r-MICA*006、r-MICA*007、r-MICA*008、r-MICA*009、r-MICA*012、r-MICA*017、r-MICA*018、r-MICA*019、r-MICA*045、r-MICB*002、r-MICB*004、r-MICB*005、r-MICB*008標(biāo)記的Luminex單抗原懸液芯片進(jìn)行檢測篩選出6株抗MICA、抗MICB和同時抗MICA和抗MICB的單克隆細(xì)胞株，置液氮中保存?zhèn)溆谩１疚膬H以具有抗MICA和抗MICB特異性的雜交瘤細(xì)胞株(9B10)作為研究對象，對其特性進(jìn)行鑒定。

2.2抗MIC單克隆抗體的鑒定

2.2.1單克隆抗體的純化和效價檢測 收集9B10細(xì)胞培養(yǎng)上清用Protien A/G層析柱純化和提取抗MIC的單克隆抗體IgG，再經(jīng)蛋白濃縮管濃縮獲得濃度為5.5 mg/ml的mAb 9B10。采用0.1%考馬斯亮藍(lán)染液對其SDS/PAGE電泳凝膠進(jìn)行染色，結(jié)果顯示在55 kD和25 kD的分子量大小的位置檢出IgG重鏈和輕鏈的蛋白條帶，無其他雜帶(見圖1A)。用羊抗鼠重鏈分子的抗體類型鑒定試劑盒(ELISA)確定mAb 9B10為IgG1亞類。采用500 ng/ml的r-MICA*012重組蛋白包被ELISA酶標(biāo)板對9B10單克隆抗體倍比稀釋后的抗體效價進(jìn)行測定，結(jié)果顯示mAb 9B10稀釋至0.02 ng/μl時仍然呈陽性反應(yīng)，其飽和反應(yīng)濃度≥1.25 ng/ μl(見圖1B)。以相同蛋白稀釋濃度的小牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照。

2.2.2mAb 9B10單克隆抗體特異性的鑒定 通過Western blot法檢測9B10單抗與多種rMICA和rMICB重組蛋白進(jìn)行反應(yīng)，并用去糖基化酶去除重組蛋白上糖基殘基后再次測定。結(jié)果顯示不管是否去糖基化，9B10均能顯示出MICA和MICB蛋白條帶(見圖2A)，而重組的MICA和MICB的胞外結(jié)構(gòu)域片段經(jīng)去糖基化處理后分子量由45 kD左右下降到38 kD，說明9B10抗體可應(yīng)用于對MICA和MICB變性處理后蛋白的檢測，且具備與MICA和MICB共同反應(yīng)的特性。

用Western blot檢測9B10抗體的反應(yīng)性，說明該抗體可識別MICA和MICB蛋白變性后的抗原表位。將可溶性的MICA和MICB重組蛋白標(biāo)記多種Luminex beads制成懸液芯片，模擬抗原的天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，然后對mAb 9B10的反應(yīng)性進(jìn)行分析。通過檢測9B10分別與單個MICA/B 抗原微反應(yīng)后的平均熒光強度(MFI)，確定抗體的親和力。mAb 9B10、mAb AM01(Anti-MICA)、mAb MAB1599(Anti-MICB)、mAb W6/32(Anti-HLA-Ⅰ)均對單抗原微珠進(jìn)行反應(yīng)測定。結(jié)果顯示9B10具有同時與MICA和MICB共同反應(yīng)的特性。而對照組中，AMO1單抗僅對11種多態(tài)性MICA抗原有反應(yīng)(與r-MICA*001、002、004、006、007、008、009、019、045具有較強的親和力，與r-MICA*017、018只具有較弱的親和力)，而與MICA*012不反應(yīng)。MAB1599單抗僅對4種MICB多態(tài)性抗原有反應(yīng)，而W6/32對MICA和MICB抗原均無反應(yīng)(圖2B)。

圖1 9B10抗體純化和滴度檢測Fig.1 Purification and detection of mAb 9B10Note:A.Purified mAb 9B10 IgG was showed in SDS/PAGE gel with coomassie brilliant blue staining.M.Marker;9B10,mAb 9B10;W6/32.mAb anti-HLA was used,as positive control.B.OD450 value was read by ELISA with antigen of rMICA*012 against a series dilution of mAb 9B10.

圖2 mAb 9B10與重組蛋白rMICA和rMICB反應(yīng)的結(jié)果Fig.2 Reaction of mAb 9B10 against recombinants of rMICA and rMICBNote:A.Recombinant proteins rMICA and rMICB,with PNGase F treated(+)or without treated(-)were tested with mAb 9B10 in SDS/PAGE by Western blot.The glycosylated rMICA and rMICB were detected with apparent molecular weight of 45 kD,after deglycosylation,they were reduced to 38 kD；B.The affinity of mAb 9B10 reacted to rMICA and rMICB with Luminex single antigen mutiplex microsphere-based flow cytometry.Monoclonal antibody AM01(Anti-MICA)，MAB1599(Anti-MICB)and W6/32(Anti-HLAⅠ)were used as control.MFI,the mean fluorescence intensity was used as the index of the amount of mAb 9B10 binding.

2.3應(yīng)用9B10單抗檢測腫瘤細(xì)胞株上MICA和MICB的表達(dá) 確定9B10單抗具有與MICA和MICB抗原反應(yīng)的特性后，用9B10單抗對人細(xì)胞株進(jìn)行MICA和MICB的檢測。選擇3種細(xì)胞株(腫瘤細(xì)胞株HeLa、HCT116以及永生化細(xì)胞株L02)分別用Western blot、免疫組織化學(xué)熒光、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，HeLa細(xì)胞和HCT116細(xì)胞有MICA/B的表達(dá)，而L02細(xì)胞為正常的肝臟細(xì)胞，沒有MICA/B的表達(dá)。在免疫印跡反應(yīng)中，9B10檢測變性的MICA/B蛋白質(zhì)，未經(jīng)N glycanase處理，反應(yīng)條帶顯彌散狀；而經(jīng)去糖基化處理后，反應(yīng)條帶呈纖細(xì)狀(圖3A)。結(jié)果表明9B10具有檢測腫瘤細(xì)胞株上MICA/B變性狀態(tài)蛋白的能力。

圖3 單抗9B10檢測腫瘤細(xì)胞株上MICA和MICB的結(jié)果Fig.3 Detection of MICA and MICB expression in tumor cell lines with mAb 9B10Note:A.Detection of MICA and MICB molecules in the cell lysates with mAb 9B10 by Western blot.HeLa(human cervical cancer cell),HCT116(Human colon cancer cell),and L02(human normal liver cell)were used as test cells；B.Detections of MIC expression on the cell surface with immunofluorescence assay.IgG from normal mice was used as negative contol;W6/32,mAb of anti-HLA,was used as positive control.C.Detection of MIC on the surface of cells by flow cytometry.Normal mice IgG(black lines)was as isotype control;mAb 9B10(blue lines)and mAb 6B3(green lines)were used to detect MICA expression;W6/32(red line),mAb of anti-HLA-I was used as positive control.

另外，我們用9B10對固定在玻片培養(yǎng)的HeLa、HCT116和L02細(xì)胞進(jìn)行免疫組織熒光實驗檢測細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，HeLa和HCT116細(xì)胞膜上顯現(xiàn)較強的熒光反應(yīng)，而L02細(xì)胞無熒光反應(yīng)。其結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致(圖3B)。說明9B10可以應(yīng)用于對組織細(xì)胞免疫組織化學(xué)的染色和MICA/B定位測定。

由于上述兩種免疫反應(yīng)均檢測變性的MIC蛋白分子。用細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)對HeLa、HCT116和L02活細(xì)胞膜上的自然狀態(tài)(未變性)的MICA/B蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。W6/32顯示三種細(xì)胞有較高的HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)。然后9B10單克隆抗體對HeLa和HCT116細(xì)胞膜上的MICA/B分子均無反應(yīng)(圖3C)。說明9B10抗體對自然狀態(tài)的MIC膜蛋白分子反應(yīng)性明顯偏低，不能應(yīng)用于細(xì)胞流式反應(yīng)。

3 討論

MIC屬于MHC-Ⅰ類基因中參與調(diào)節(jié)免疫功能相關(guān)基因之一，該基因編碼的MIC蛋白在結(jié)構(gòu)上與HLA-Ⅰ類分子相似，但其不和β-2微球蛋白結(jié)合，功能上不參與抗原提呈。MIC蛋白主要集中表達(dá)在腸道上皮中，其他正常組織脾臟、心臟、肝臟等無表達(dá)[14]。隨著對MIC的深入研究發(fā)現(xiàn)MIC蛋白與移植排斥、腫瘤逃逸、自身免疫性疾病等眾多疾病相關(guān)[1,10,15]。

在本研究中采用雜交瘤技術(shù)制備多株雜交瘤細(xì)胞，并對9B10細(xì)胞株分泌的單克隆抗體進(jìn)行鑒定。在研究中我們只采用重組蛋白rMICA*012免疫小鼠，但是在篩選和9B10抗體鑒定中發(fā)現(xiàn)該抗體具有同時與γMICA和MICB反應(yīng)的特性，經(jīng)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)Zou等[16]用rMICA*008制備的抗MICA單抗(mABb 6B3)也同時與多個MICA多態(tài)性蛋白結(jié)合。國內(nèi)外研究顯示MICA和MICB基因編碼區(qū)間序列同源性大于90%，MICA和MICB蛋白間具有相同或相似的保守區(qū)域[17]，同時國內(nèi)研究者通過抗體吸附和洗脫實驗也證實了不同的MICA多態(tài)性蛋白間共享抗原表位[18]。因此，利用MICA和MICB蛋白具有相似保守區(qū)域的特性成功地制備能同時與MICA和MICB結(jié)合的抗體。為了更接近天然蛋白，我們的r-MICA和r-MICB重組蛋白也為重組糖蛋白。而在異源表達(dá)系統(tǒng)中蛋白的糖基化存在不均一性，受多種因素影響如細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件[19]。有學(xué)者認(rèn)為在真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中N-聚糖為復(fù)合型和雜合型，糖基化程度強于原核表達(dá)系統(tǒng)[20]。在本研究中用到的多種重組MICA和MICB也為糖基化蛋白，rMICA*001、004、006、007、008、009、012、017、018、019均在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)[16,21]，而rMICA045、MICB004為本實驗采用真核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)純化的蛋白。因此在免疫印跡檢測9B10抗體與不同MICA和MICB反應(yīng)時，未去糖基化的MICA/B分子量大小不一，rMICA*045和rMICB*004分子量高于其他蛋白，但是一旦去糖基化，分子量大小相近。

通過Western blot和Luminex實驗顯示9B10單克隆抗體具有能同時與MICA和MICB結(jié)合的特性，于是我們進(jìn)一步擴(kuò)大該抗體在其他實驗中的應(yīng)用，研究指出9B10抗體還可應(yīng)用于免疫組織化學(xué)檢測，但不可用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。這也預(yù)示著9B10單克隆抗體有可能只與變性的以及半變性的MIC蛋白抗原反應(yīng)，而不與天然的MIC蛋白抗原結(jié)合。mAb 9B10在免疫組化中的應(yīng)用將為我們臨床檢測MIC蛋白提供重要的檢測手段，我們可以采用組織化學(xué)染色直觀地顯示MIC蛋白分子的檢測，同時還可以對MIC蛋白表達(dá)進(jìn)行定位檢測。

總之，相對于昂貴的商品化試劑，9B10單克隆抗體具有高效價、易獲取的特點。同時，9B10單克隆抗體可同時運用于Western blot、Luminex、免疫熒光等實驗中，有助于我們在科研和臨床上對MIC蛋白抗原的檢測和研究。

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[收稿2017-05-05 修回2017-06-03]

(編輯 許四平 劉格格)

Productionandapplicationofmonoclonalantibodyagainstmajorhistocompati-bilitycomplexclassⅠrelatedchainAandB

TIANFang,LUOWei-Guang,GUOXu-Li,GUOJing,LUOQi-Zhi,WANGHui-Peng,ZOUYi-Zhou.
DepartmentofMedicalImmunology,SchoolofBasicMedicalScience,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China

Objective:Generation and identification of hybridoma to produce monoclonal antibody against MICA/B.MethodsSP2/0 cells were fused with murine splenocyte immunized with recombinant protein rMICA*012 to get hybridoma cell lines.The titer of the monoclonal antibody produced by 9B10 cell line was determined by ELISA and its specificity was tested by Western blot,Luminex mutiplex microsphere-based immunoassay and immunofluorescence assay.ResultsSix hybridoma cell lines were selected by ELISA screening test.The minimum reaction concentration of mAb 9B10 was 0.02 ng/μl,and the specificity of mAb 9B10 was determinated by Western blot,Luminex mutiplex microsphere-based immunoassay and immunofluorescence.ConclusionThe monoclonal antibody 9B10 was available to apply for the detection of MICA and MICB expression.

MICA ;MICB;Monoclonal antibody;Hybridoma cells

①本文受國家自然科學(xué)基金面上項目(81273265，81571562)和湖南省自然科學(xué)基金重點項目(2013FJ2005)資助。

R392.4

A

1000-484X(2017)10-1514-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.015

田 芳(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫學(xué)的研究。

及指導(dǎo)教師：鄒義洲(1963年-) ，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事移植免疫學(xué)和免疫遺傳學(xué)研究，E-mail:zouyizhou@hotmail.com。