何軍敏，孫 軍，余 雄，阿依達爾.霍江臺，木合依扎.熱很別克，黃錫霞*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.特克斯縣畜牧獸醫(yī)局，新疆特克斯 835500）

MC1R與Slc7a11基因多態(tài)性與哈薩克羊毛色相關的研究

何軍敏1，孫 軍2，余 雄1，阿依達爾.霍江臺2，木合依扎.熱很別克1，黃錫霞1*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.特克斯縣畜牧獸醫(yī)局，新疆特克斯 835500）

本研究采集新疆伊犁哈薩克自治州特克斯縣4種不同被毛顏色2～3周歲的220只哈薩克母羊血樣用于提取DNA，其中黑色被毛羊52只，棕色被毛羊52只，青灰色被毛羊59只，白色被毛羊57只；并采集綿羊左側(cè)肩胛皮膚樣本，每種毛色各10個，用于組織形態(tài)學觀察。本研究運用PCR-SSCP技術及測序技術對MC1R基因及Slc7a11基因多態(tài)性及其對哈薩克羊毛色的影響進行研究。運用皮膚樣本制作切片用于不同毛色組織形態(tài)學觀察。結(jié)果表明：MC1R基因突變位點在白色和棕色被毛群體中，只存在BB基因型；而在黑色和青灰色被毛群體中，存在AA、AB和BB 3種基因型；且AB基因型均為優(yōu)勢基因型，A等位基因為優(yōu)勢等位基因。由組織形態(tài)學觀察可知，黑色和青灰色被毛組織毛囊分布極為相似，毛囊分布稀疏且皮脂腺發(fā)達；棕色被毛最具特色，毛囊叢分布明顯，皮脂腺分布不發(fā)達；白色被毛毛囊分布最為密集，且皮脂腺分布密集并且最為發(fā)達。經(jīng)χ2檢驗，MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著（P<0.01）。Slc7a11基因位點在伊犁哈薩克羊群體中發(fā)現(xiàn)其不存在多態(tài)性。

哈薩克綿羊；MC1R基因；Slc7a11基因；PCR-SSCP；遺傳多態(tài)性

哈薩克綿羊是我國3大綿羊品種之一，同時也是新疆的優(yōu)秀地方綿羊品種。目前國內(nèi)外對于MC1R基因?qū)_克羊毛色影響的研究報道較少，尤其本研究中哈薩克羊群體存在4種毛色，目前僅在特克斯縣發(fā)現(xiàn)第4種毛色的哈薩克羊。孫浩浩[1]研究報道了TYR基因、ASIP基因多態(tài)性在綿羊中的相關分析。毛色受TYR、ASIP、MC1R、TYRP1等多種基因控制和影響，其通過參與生物合成活性或者調(diào)節(jié)有關黑色素生成細胞的分布過程等來調(diào)控毛色[2-3]。MC1R與黑色素細胞刺激激素α結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶（cAMP），最終增加了黑色素的合成[4]。當Slc7a11基因突變后，導致其編碼的蛋白缺乏，使得氨基酸在轉(zhuǎn)運載體時失去功能，導致細胞不能攝取到足夠的胱氨酸，因此無法還原成半胱氨酸，從而無法滿足細胞中合成偽黑色素的需要，最終導致毛色主要表現(xiàn)為真黑色素的黑顏色，從而缺乏由偽黑色素產(chǎn)生的黃色[5-7]。王樂等[8]總結(jié)了目前MC1R基因在各種動物中的研究，但關于哈薩克羊存在青灰色被毛的研究至今未見報道。本實驗旨在研究特克斯縣哈薩克羊形成4種毛色的原因，從而進一步了解哈薩克羊毛色形成的規(guī)律，完善哈薩克羊毛色基因的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究采集新疆伊犁哈薩克自治州特克斯縣4種不同被毛顏色2～3周歲的220只哈薩克母羊血樣及40個肩胛皮膚組織，所有綿羊毛色均為純色，不含有任何斑點或其他雜色，頭毛與蹄毛均與被毛一致，均為純色。其中黑色被毛樣本52個，棕色被毛樣本52個，青灰色被毛樣本59個，白色被毛樣本57個，血樣-20℃保存用于提取基因組DNA；采集綿羊左側(cè)肩胛皮膚組織每種毛色各10個，用福爾馬林保存用于組織形態(tài)學觀察。

1.2 方法 綿羊血樣基因組DNA運用酚-氯仿法進行抽提。皮膚組織由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院組織切片制作室進行切片制作。運用PCR-SSCP技術分析MC1R基因在不同顏色被毛哈薩克羊的多態(tài)性，以提取的綿羊基因組DNA為模板進行PCR，反應體系參照Taq DNA聚合酶說明書。運用顯微鏡進行組織形態(tài)學觀察并進行圖像采集。

表1 PCR擴增的引物序列

1.2.1 引物設計 本研究MC1R基因（GenBank登錄號為FN600553）引用李洪濤[9]的引物序列，Slc7a11基因（GenBank登錄號為JQ085938）采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，由上海生工合成，引物序列如表1所示。

1.2.2 PCR擴增程序的建立 PCR擴增條件：經(jīng)94℃預變性3 min；94℃變性30 s，MC1R基因61℃、Slc7a11基因59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。于低溫保存待后續(xù)實驗。

1.2.3 PCR反應體系的建立 PCR擴增反應體系20 μL，其中 10 μL 2× PCR Master Mix，1 μL DNA 模板，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH2O 。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 經(jīng)過普通PCR擴增及2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將PCR產(chǎn)物送到上海生工進行單向測序。

1.2.5 PCR-SSCP過程 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取3 μL的PCR產(chǎn)物，加入7 μL 上樣緩沖液（9.8 mL甲酰胺，10 mg 溴酚藍，10 mg二甲苯青， 0.5 mol/LEDTA 0.2 mL）混合，98℃變性10 min，立即冰浴15 min，并用12%聚丙烯酰胺凝膠（高板）進行電泳檢測。300 V 預電泳5 min 使樣品快速入膠，然后室溫恒壓180 V 電泳16～18 h。銀染液顯色后拍照，統(tǒng)計各基因型的個體數(shù)。

1.2.6 組織切片制作 皮膚組織送往蘭州軍區(qū)總醫(yī)院組織切片制作室進行切片制作，對皮膚組織進行橫切后制成切片，運用顯微鏡進行觀察并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計分析 運用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2獨立性檢驗，并進行多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳純合度（Ho）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne）的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織形態(tài)學觀察 由圖1可知，在白色被毛組織中，毛囊分布密集但并未形成明顯的毛囊叢，毛囊分布均勻。皮脂腺分布密集較為發(fā)達。由圖2可知，在黑色被毛皮膚組織中，毛囊分布較白色稀疏，同樣未有明顯的毛囊叢存在，皮脂腺發(fā)達并且分布均勻。由圖3可知，在青灰色皮膚組織中，與黑色皮膚組織極為相似，毛囊分布稀疏，皮脂腺發(fā)達，分布均勻。由圖4可知，在棕色皮膚組織中，形成了明顯的毛囊叢，單一的毛囊叢中毛囊分布密集，毛囊叢之間分布較為離散，皮脂腺不發(fā)達。

圖1 白色被毛皮膚組織（100×）

圖2 黑色被毛皮膚組織（100×）

圖3 青灰色被毛皮膚組織（100×）

圖4 棕色被毛皮膚組織（100×）

2.2 DNA完整性檢測結(jié)果 將提取的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。結(jié)果表明，實驗提取的基因組DNA模板質(zhì)量良好、純度高、不需要純化，可直接用作模板DNA。

2.3 MC1R基因的PCR擴增結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，可知MC1R與Slc7a11基因引物PCR產(chǎn)物長度為169 bp和237 bp，與生物公司提供片段符合。結(jié)果表明，PCR擴增特異性良好，片段長度一致，引物的片段長度符合預期大小，可直接用于PCR-SSCP的分析。

2.4 MC1R和Slc7a11基因的PCR-SSCP多態(tài)性檢測結(jié)果 如圖5、6所示，MC1R基因存在3種不同的帶型，將其命名為AA、AB、BB型；Slc7a11基因均為AA基因型，不存在多態(tài)性。

圖5 MC1R的SSCP

圖6 Slc7a11基因的SSCP產(chǎn)物

2.5 MC1R序列分析 由測序結(jié)果分析可知，在哈薩克羊群體中發(fā)現(xiàn)此序列在91 bp處發(fā)生突變（圖7）。由AA基因型突變?yōu)锽B基因型，AB為雜合子。通過對氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，其A91T突變點為非同義突變，由甲硫氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?/p>

2.6 MC1R的遺傳多態(tài)性分析 由表2可知，MC1R基因在不同毛色中均有差異。在白色和棕色被毛群體中，只存在BB基因型；在黑色被毛群體中，存在AA、AB和BB 3種基因型，其基因型頻率分別為0.27、0.71和0.02，且BB基因型頻率所占比例極小。由此可知，AB基因型為優(yōu)勢基因型；其A和B等位基因頻率分別為0.63和0.37，可知A等位基因為優(yōu)勢等位基因；而在青灰色被毛群體中，存在AA、AB和BB 3種基因型，其基因型頻率分別為0.32、0.54和0.14，由此可知AB基因型為優(yōu)勢基因型；其A和B等位基因頻率分別為0.59和0.41，可知A等位基因為優(yōu)勢等位基因。經(jīng)χ2檢驗，MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著（P<0.01）。

圖7 MC1R突變點不同基因型測序峰圖

表3 哈薩克羊MC1R基因遺傳參數(shù)

2.7 MC1R基因遺傳參數(shù)分析 由表3可知，MC1R基因在該哈薩克羊群體中黑色與青灰色均處于中度多態(tài)（0.25

3 討 論

大量研究表明，多數(shù)脊椎動物MC1R基因的突變能夠引起毛色的變化，如小鼠、牛、馬、雞、狐貍、豬、綿羊、山羊和狗，均發(fā)現(xiàn)毛色由淺變深；對人的研究亦是如此[10]。對小鼠進行遺傳學研究表明 ，MCIR是一種獨特的具有雙功能控制的受體。對豬的 MC1R 基因已經(jīng)定位 ，并且已建立了PCR-RFLP技術來檢測不同豬種的等位基因的多肽。研究發(fā)現(xiàn)綿羊中的extension 等位基因為ED， 從而導致顯性的黑色毛色。Vage等[11]分析了黑色被毛綿羊的MC1R基因，發(fā)現(xiàn)其存在2個突變即Asp121Asn 與Met73Lys。而對引進鼠的相對應的MC1R 基因進行藥理學分析發(fā)現(xiàn)，Met73Lys突變點是組成型活性的MC1R，其可能是導致綿羊的黑色毛色的主要原因[8]。姜俊兵等[12]實驗證明，羊駝MC1R基因中存在著單鏈構(gòu)象多態(tài)性，存在AA和AB 2種基因型。

表2 MC1R基因頻率和基因型頻率的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC1R基因突變的AB基因型與黑色被毛極顯著相關，說明該位點對黑色被毛有顯性作用，這與Vage等[11]報道的顯性黑等位基因（ED）控制黑色被毛的結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克羊被毛的顏色與MC1R基因有密切聯(lián)系，它的突變決定著黑色和青灰色被毛的性狀，且在黑色與青灰色被毛中AB基因型所占頻率大。MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著。黑色與青灰色被毛中存在AA、AB和BB 3種基因型，與李洪濤等[9]的結(jié)果有一定差異；而在白色和棕色群體中僅存在BB基因型，與李洪濤等[9]的結(jié)果有一定的相似性。李洪濤等[9]將MC1R和ASIP進行基因型聯(lián)合分析時沒有發(fā)現(xiàn)對毛色有互補效應，說明控制哈薩克綿羊黑色被毛的主要基因是MC1R。對于綿羊的白色和棕色可能存在著其他位點的調(diào)控。有報道稱，Spotting位點決定著綿羊的白色被毛[13]，Slc7a11 位點與綿羊的棕色被毛相關。而本研究Slc7a11基因位點在本實驗中運用PCR-SSCP技術并未檢測到其多態(tài)性，有待進一步研究。

經(jīng)皮膚組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)在白色被毛組織中，毛囊分布密集且均勻；皮脂腺分布密集較為發(fā)達[14]。在黑色被毛皮膚組織中，毛囊分布較白色分布稀疏，皮脂腺發(fā)達并且分布均勻。在青灰色皮膚組織中，與黑色皮膚組織極為相似，毛囊分布稀疏，皮脂腺發(fā)達，分布均勻。在棕色皮膚組織中，形成了明顯的毛囊叢，單一的毛囊叢中毛囊分布密集，毛囊叢之間分布較為離散，皮脂腺不發(fā)達[15]。黑色與青灰色皮膚組織觀察極為相近，而白色與棕色各具特色，白色毛囊密集或許因白色毛發(fā)吸收光的能力較弱因而保暖更為密集，而其他顏色相對白色對光的吸收能力強，棕色形成了明顯的毛囊叢，此原因有待進一步研究。棕色皮脂腺較其他顏色不發(fā)達，也許與毛囊叢的形成在組織學中有一定的關系，有待專業(yè)人士進一步分析。

4 結(jié) 論

本研究分析了MC1R和 Slc7a11基因多態(tài)性與哈薩克綿羊被毛顏色之間的關系。結(jié)果表明，哈薩克羊被毛顏色與MC1R基因有密切聯(lián)系，且在黑色與青灰色被毛中AB基因型所占頻率大。MC1R基因的基因型頻率在4種毛色羊中的分布差異極顯著。Slc7a11基因位點在此群體中運用PCR-SSCP技術未檢測到多態(tài)性。由組織形態(tài)學可知，黑色與青灰色被毛組織毛囊分布極為相似；棕色被毛最具特色，毛囊叢分布明顯，皮脂腺分布不發(fā)達；白色被毛毛囊分布最為密集，且皮脂腺分布密集并且最為發(fā)達。

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S826.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-039

2017-03-31；

2017-04-05

農(nóng)業(yè)部體系項目（CARS-40）；疆農(nóng)業(yè)大學產(chǎn)學研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項目（xjaucxy-yjs-20152011）

何軍敏（1991-），女，新疆烏蘇人，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種的研究，E-mail: 1415230131@qq.com

*通訊作者：黃錫霞（1963-），教授，博士生導師，主要從事動物遺傳育種的研究，E- mail：au- huangxixia@163.com