姜正華 李勁平 石麗穎 謝保平

摘要：目的 建立參積護胃顆粒中積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量測定的HPLC分析方法。方法 采用廣州研創(chuàng)C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-磷酸鹽緩沖液（含磷酸二氫鉀8.34‰、磷酸氫二鉀0.87‰），梯度洗脫（0～15 min，20%A；15～30 min，20%→40%A；30～42 min，40%A；42～45 min，40%→48%A；45～50 min，48%A；50～70 min，48%→50%A），流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果 積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d分別在0.173～2.770 μg（r=0.999 9）、0.021～1.320 μg（r=0.999 2）、0.151～9.660 μg（r=0.999 3）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d平均加樣回收率分別為96.25%、97.02%、97.84%，RSD分別為2.31%、4.51%、1.87%。結(jié)論 該含量測定方法簡便、分離效果好、專屬性強，能同時測定參積護胃顆粒中積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d的含量，為參積護胃顆粒質(zhì)量標準的完善提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：參積護胃顆粒；積雪草苷；延胡索乙素；柴胡皂苷d；高效液相色譜法；質(zhì)量控制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.015

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0064-04

Simultaneous Determination of Contents of Asiaticoside， Tetrahydropulmatine and Saikosaponin d in Shenji Huwei Granules by HPLC JIANG Zheng-hua， LI Jin-ping， SHI Li-ying， XIE Bao-ping （Xiangya School of Pharmaceutical Science， Central South University， Changsha 410013， China）

Abstract： Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of contents of asiaticoside， tetrahydropulmatine and saikosaponin d in Shenji Huwei Granules. Methods The analysis was performed on a R&C; C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） by using the mobile phase of acetonitrile （A） - phosphate buffer （which used potassium dihydrogen phosphate 8.34 g， potassium phosphate 0.87 g dissolved by 1000 mL water） with gradient elution （0–15 min， 20%A； 15–30 min， 20%→40%A； 30–42 min， 40%A； 42–45 min， 40%→48%A； 45–50 min， 48%A； 50–70 min， 48%→50%A）. The flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 210 nm； the column temperature was maintained at 30 ℃. Results Asiaticoside， tetrahydropulmatine and saikosaponin d were in the linear ranges among 0.173–2.770 μg （r=0.999 9）， 0.021–1.320 μg （r=0.999 2）， 0.151–9.660 μg （r=0.999 3）， respectively. The average recovery rates of asiaticoside， tetrahydropulmatine， saikosaponin d were 96.25%， 97.02%， and 97.84%， respectively， and RSD were 2.31%， 4.51%， 1.87%， respectively. Conclusion This method is simple， with good separation effect and strong specificity， and can be used for simultaneous determination of contents of asiaticoside， tetrahydropulmatine and saikosaponin d in Shenji Huwei Granules， which provides references for perfection of quality control of Shenji Huwei Granules.

Key words： Shenji Huwei Granules； asiaticoside； tetrahydropulmatine； saikosaponin d； HPLC； quality control

參積護胃顆粒是由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院莫新民教授的臨床經(jīng)驗方研制而成的顆粒劑，由黨參、延胡索、柴胡等8味藥組成，具有健脾疏肝、活

基金項目：湖南省科技計劃（2009SK3190）

通訊作者：李勁平，E-mail：pjingli@163.com

血止痛功效，主要治療胃潰瘍、慢性胃炎等消化系統(tǒng)疾病。本課題組前期研究顯示，參積護胃顆粒具有抗實驗性胃潰瘍的作用[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參中的黨參炔苷及黨參提取物對胃黏膜損傷有保護作用[2]；柴胡中的柴胡總皂苷對無水乙醇致大鼠胃黏膜損傷具有明顯的抑制作用[3-5]，兩者為方中君藥。延胡索具有很好的活血行氣痛作用，其中以延胡索乙素作用最強[6]，積雪草中的積雪草總苷對乙酸致慢性胃潰瘍有明顯抑制作用[7]。柴胡皂苷a和d、積雪草苷、延胡索乙素分別是2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的柴胡、積雪草、延胡索質(zhì)量控制的特征指標，故選取黨參炔苷、柴胡皂苷a和d、積雪草苷及延胡索乙素作為指標成分進行含量測定，但在專屬性試驗中發(fā)現(xiàn)黨參炔苷、柴胡皂苷a陰性樣品有干擾，通過色譜條件和樣品處理方法的優(yōu)化也未能解決，所以最終選擇測定積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d的含量。為此，本試驗建立同時測定參積護胃顆粒中積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量的HPLC方法，為其質(zhì)量標準的擬定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)易有限公司），R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)易有限公司），島津AUW22OD型分析天平（日本島津公司），DV215CD型電子天平（美國奧豪斯公司），YLD-2000型真空干燥箱（鄭州長城科工貿(mào)易有限公司），島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀（日本SHIMADZU公司），KQ5200型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），ZD-2型酸度計（上海大中分析儀器廠）。

延胡索乙素對照品（成都曼斯特生物科技公司，批號16032710，純度99.86%），積雪草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110726-201604，純度99.42%），柴胡皂苷d對照品（成都曼斯特生物科技公司，批號16060106，純度98.55%），參積護胃顆粒（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，批號20160602、20160915、20161216），乙腈、甲醇為色譜純（ACS），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取積雪草苷對照品2.77 mg、延胡索乙素對照品1.32 mg、柴胡皂苷d對照品9.66 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制成混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取參積護胃顆粒5.00 g，置250 mL錐形瓶中，精密加入75%甲醇125 mL，超聲提?。üβ?80 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，濾液減壓濃縮蒸干，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，備用。

2.3 陰性對照溶液制備

分別按供試品溶液制備方法制備缺積雪草、延胡索、柴胡的陰性對照溶液。

2.4 色譜條件

采用廣州研創(chuàng)C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-磷酸鹽緩沖液（含磷酸二氫鉀8.34‰、磷酸氫二鉀0.87‰），梯度洗脫（0～15 min，20%A；15～30 min，20%→40%A；30～42 min，40%A；42～45 min，40%→48%A；45～50 min，48%A；50～70 min，48%→50%A），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 ?L。

2.5 專屬性試驗

分別取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，在上述色譜條件下進行HPLC分析，確定積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d的峰位置，考察其他藥材是否有干擾，色譜圖見圖1。可見，在該色譜條件下，HPLC測定積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d具有較高的專屬性，陰性樣品無干擾。

2.6 線性關(guān)系和定量限考察

依次分別精密量取混合對照品溶液適量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，連同母液，分別得到含積雪草苷277.00、138.50、69.25、34.63、27.70、17.32 μg/mL，延胡索乙素132.00、66.00、33.00、16.50、13.2、8.25 μg/mL，柴胡皂苷d 966.00、483.00、241.50、120.75、96.60、60.38 μg/mL的對照品溶液，進樣10 ?L，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程。積雪草苷：Y=773.82X-1689.6，r=0.999 9；延胡索乙素：Y=31 663X+99 300，r=0.999 2；柴胡皂苷d：Y=1451.9X+19 027，r=0.999 3。以信噪比S/N=3為最低檢測限（LLOD），S/N=10為最低定量限（LLOQ）。結(jié)果表明，積雪草苷在0.173～2.770 μg、延胡索乙素在0.021～1.320 μg、柴胡皂苷d在0.151～9.660 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，LLOD分別為0.026、0.003、0.045 μg，LLOQ分別為0.087、0.010、0.151 μg。

2.7 精密度試驗

連續(xù)重復進樣含積雪草苷、延胡索乙素和柴胡皂苷d的低、中、高濃度混合對照品溶液各5次，進樣體積為10 ?L，每日測定1次，連續(xù)測定3 d，得峰面積，根據(jù)標準曲線計算各待測物含量的平均值及RSD。結(jié)果積雪草苷低、中、高濃度的日內(nèi)精密度及日間精密度含量的RSD分別為1.13%、0.46%、1.03%和1.64%、2.04%、1.57%；延胡索乙素低、中、高濃度的日內(nèi)精密度及日間精密度含量的RSD分別為0.49%、0.42%、0.60%和0.88%、0.86%、1.47%；柴胡皂苷d低、中、高濃度的日內(nèi)精密度及日間精密度含量的RSD分別為0.04%、1.27%、2.10%和0.29%、2.64%、2.48%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，室溫分別放置0、2、4、8、12、18、24 h，進樣10 ?L，得峰面積，計算各待測物含量的平均值及RSD。結(jié)果積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量的RSD分別為0.60%、1.03%、0.34%，表明供試品溶液中各待測物在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗

精密稱取6份同一批號參積護胃顆粒樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 ?L，記錄峰面積，計算得各待測物含量的平均值及RSD。結(jié)果積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量分別為0.499、0.059、3.112 mg，RSD分別為1.87%、0.82%、0.42%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取已測得含量（積雪草苷0.504 mg、延胡索乙素0.059 mg、柴胡皂苷d 3.109 mg）的參積護胃顆粒6份，每份1.00 g，分別精密加入適量積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 ?L，記錄峰面積，計算得各待測物平均回收率及RSD，結(jié)果見表1，表明該方法的準確度良好。

2.11 樣品含量測定

精密稱取3個批號的參積護胃顆粒樣品，每批3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 ?L，測定并記錄峰面積，以標準曲線法分別計算樣品中積雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量及RSD，結(jié)果見表2。

3 討論

將積雪草苷、延胡素乙素和柴胡皂苷d的對照品溶液分別在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果積雪草苷和柴胡皂苷d在205、210 nm處有較大吸收，延胡索乙素在210、262、280 nm處有較大吸收，綜合考慮，延胡索乙素在210 nm處也有很強的吸收，且含量較高，兼顧3個化合物的檢測靈敏度和干擾情況，以及減少3個成分峰之間峰高的差別，選擇210 nm為檢測波長。

本試驗分別考察了廣州研創(chuàng)C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜柱為廣州研創(chuàng)C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）時，延胡索乙素峰形對稱且分離度良好；再通過對甲醇-水[8]、乙腈-水[9-12]、甲醇-磷酸溶液-三乙胺[13-15]、乙腈-醋酸溶液-三乙胺[16]、甲醇-磷酸鹽緩沖液[17]、乙腈-磷酸鹽緩沖液不同比例和流速的考察，發(fā)現(xiàn)單獨用甲醇-水、乙腈-水為流動相時延胡索乙素峰拖尾嚴重，而用甲醇-磷酸溶液-三乙胺、乙腈-醋酸溶液-三乙胺為流動相時積雪草苷、柴胡皂苷d在60 min內(nèi)均未出峰。所以最后優(yōu)選出色譜條件為廣州研創(chuàng)C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（含磷酸二氫鉀8.34‰，磷酸氫二鉀0.87‰），梯度洗脫，流速1.0 mL/min，此時所測組分色譜峰得到良好分離，同時縮短了分析時間。

本研究采用單因素試驗對供試品溶液制備中的提取溶劑、提取時間和溶劑用量進行了考察。分別考察了不同體積分數(shù)的甲醇、水、乙醇等溶劑的提取效果，結(jié)果采用75%甲醇為提取溶劑時各指標成分提取率均較高，且分離度更佳；對不同提取時間進行了考察，以75%甲醇為提取溶劑分別超聲提取15、30、45 min，結(jié)果表明超聲提取30 min與45 min的提取結(jié)果基本一致，表明超聲提取30 min時基本提取完全；對提取溶劑用量為15、20、25、50倍（V/M）量時進行比較，結(jié)果表明使用25倍溶劑即可。最終得到最優(yōu)化的提取方法為用25倍量75%甲醇超聲提取30 min。

本試驗建立了HPLC同時測定參積護胃顆粒中積雪草苷、延胡索乙素和柴胡皂苷d含量的方法，該方法簡單快速，準確可靠，重復性好，且在各組分適宜波長處分別測定其含量，大大提高了檢測靈敏度，可作為參積護胃顆粒多組分含量測定方法，為其質(zhì)量控制和質(zhì)量標準的建立提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1] 王慧，甘超汝，李勁平，等.參積護胃顆粒對無水乙醇誘導大鼠實驗性胃潰瘍的保護作用研究[J].中南藥學，2014，12（4）：315-318.

[2] 王濤，葛睿，楊飛，等.黨參提取物對大鼠胃黏膜損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床，2015，31（4）：138-141.

[3] 張巖，王帥，孟憲生，等.基線覆蓋融合結(jié)合相對校正因子對柴胡抗?jié)冇行ЫM分的質(zhì)量控制方法研究[J].藥物分析雜志，2013，33（7）：1185- 1189.

[4] 馬海燕，馬玉奎.柴胡皂苷治療胃潰瘍作用的研究[J].齊魯藥事， 2011，30（6）：318-319.

[5] 王帥，包永睿，孟憲生，等.柴胡皂苷對無水乙醇致胃黏膜損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（8）：191-194.

[6] 楊鑫寶，楊秀偉，劉建勛.延胡索物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].中國中藥雜志， 2014，39（1）：20-27.

[7] 施之琪，杜建平，杜鐵良.積雪草總苷抗乙酸致大鼠胃潰瘍的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（12）：122-124.

[8] 李軍，姜華，張延萍，等.柴胡湯劑中?；窈碥誥、b2的含量測定[J].藥物分析雜志，2016，36（1）：74-80.

[9] 周平，謝東浩，陳俊，等.HPLC法測定春柴胡中柴胡皂苷a、d的含量[J].中藥材，2011，34（12）：1903-1906.

[10] 黃健，車曉平，陳志峰，等.不同產(chǎn)地黨參中黨參炔苷的含量測定[J].北京中醫(yī)藥，2011，30（6）：467-468.

[11] 竇霞，靳子明，狄留慶.黨參超微粉碎工藝優(yōu)選及溶出度考察[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（9）：23-25.

[12] 閆婕，衛(wèi)瑩芳，古銳，等.HPLC測定4種川產(chǎn)柴胡地上與地下部分柴胡皂苷a，c，d的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（13）：73-76.

[13] 馬月光，岳顯可，曹崗，等.不同產(chǎn)地延胡索飲片炮制前后有效成分含量的測定[J].中藥材，2013，36（11）：1754-1758.

[14] 王緒穎，賈曉斌，陳彥.延胡索總生物堿的提取純化工藝研究[J].中成藥，2010，32（11）：1899-1904.

[15] 鄭加豪，李笑慧，周曙華，等.HPLC測定“冬病夏治”貼膏中延胡索乙素的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（12）：1610-1612.

[16] 張宏梅，崔佰吉，張秀榮.HPLC同時測定燈延顆粒中燈盞乙素、原阿片堿、芹菜素和延胡索乙素[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（24）：57-60.

[17] 鄒薇，張鶴，包永睿，等.延胡索提取工藝的優(yōu)化及化學成分與藥效指標相關(guān)性分析[J].中草藥，2012，43（4）：694-698.

（收稿日期：2017-03-14）

（修回日期：2017-04-19；編輯：陳靜）