2型糖尿病下肢血管病變與DNA氧化損傷的關(guān)系

陳吉海歐陽曉俊婁青林卞茸文

目的探討2型糖尿病合并下肢血管病變與機(jī)體DNA氧化損傷的關(guān)系。方法納入門診85例糖化血紅蛋白<9%的2型糖尿病病人作為研究組,按照踝肱比(ABI)水平將上述病人分為糖尿病合并下肢血管病變組(n=35)及無并發(fā)癥組(n=50);同時(shí)取60例正常人群作為正常對照組。使用ELISA方法測定血液單核細(xì)胞DNA氧化損傷指標(biāo)8羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)水平,并在3組間進(jìn)行比較,同時(shí)采用Logistic回歸分析糖尿病合并下肢血管病變的危險(xiǎn)因素。結(jié)果糖尿病合并下肢血管病變組與無并發(fā)癥組間年齡、病程、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白等指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。糖尿病合并下肢血管病變組血液8-OHdG水平為(4.03±1.89)ng/ml,無并發(fā)癥組血液8-OHdG水平為(2.74±1.64) ng/ml,均較正常對照組[(0.53±0.53) ng/ml]升高(P<0.05),且糖尿病合并下肢血管病變組較無并發(fā)癥組亦升高(P<0.05)。Logistic回歸分析顯示,8-OHdG以及LDL-C是糖尿病合并下肢血管病變的危險(xiǎn)因素。結(jié)論2型糖尿病合并下肢血管病變病人體內(nèi)DNA氧化損傷較正常人及無并發(fā)癥糖尿病病人嚴(yán)重,提示DNA氧化損傷在糖尿病下肢血管病變中發(fā)揮了一定程度的致病作用。

2型糖尿病; 下肢血管病變; 8羥基脫氧鳥嘌呤; DNA氧化損傷

糖尿病下肢血管病變是糖尿病常見的并發(fā)癥之一,也是糖尿病足的致病因素和高危因素。前期研究提示氧化應(yīng)激損傷在糖尿病發(fā)病中起著重要作用,并可能與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但關(guān)于氧化應(yīng)激與糖尿病下肢血管病變的研究,目前較少。且前期研究大多集中在觀察血清中炎癥因子的變化,來間接反映氧化應(yīng)激與糖尿病的關(guān)系。8羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)是DNA的氧化核苷,是DNA氧化損傷最直接、最敏感的生物指標(biāo),可直接反映DNA氧化損傷程度及機(jī)體氧化應(yīng)激水平。我們對比觀察了不同組間病人的8-OhdG水平,分析DNA氧化損傷與糖尿病下肢血管病變的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院門診及住院的2型糖尿病病人85例作為糖尿病組,年齡51～78歲,平均(58.63±14.69)歲,其中男42例,女43例。按照踝肱比(ABI)是否<0.9的標(biāo)準(zhǔn),將糖尿病病人分為糖尿病合并下肢血管病變組及無并發(fā)癥組;其中合并下肢血管病變的糖尿病病人共30例,無并發(fā)癥組55例。同時(shí)選取50例正常人群為正常對照組。

2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn);糖尿病下肢血管病變診斷標(biāo)準(zhǔn)為有糖尿病病史,且ABI<0.9。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)不吸煙的2型糖尿病病人;(2)合并高血壓病人入選前平臥位血壓<180/110 mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)吸煙;(2)長期使用維生素C及維生素E等抗氧化劑;(3)長期使用他汀等降血脂類藥物;(4)長期使用其他影響機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的藥物;(5)長期使用非甾體抗炎藥、激素或免疫抑制劑治療;(6)嚴(yán)重肝功能障礙(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶高于正常上限2倍);(7)合并糖尿病急性并發(fā)癥;(8)合并急性感染、急性心腦血管疾病等。本研究得到江蘇省老年醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA:對于符合條件的糖尿病病人及正常對照組人群各抽取5～10 ml空腹靜脈血,使用鹽析法提取DNA。

1.2.2 DNA的酶消化:溶解200 μg DNA至135μl水中;加入乙酸鈉及核酸酶P1至DNA溶解液中,37 ℃下孵育后,加入1 mmol Tris-HCl緩沖液及2 U 堿性磷酸酶。水解產(chǎn)物過純化柱,離心并收集離心的液體,取50 μl DNA消化產(chǎn)物用于ELISA試劑盒檢測。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測:使用ELISA試劑盒(IMKOGNW 050915E,Catalog No. KOG200S/E)檢測提取的DNA中8-OHdG的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 18.0軟件。統(tǒng)計(jì)分析前,使用Kolmogorov-Smirnov檢測數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)將進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本間t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;轉(zhuǎn)換后仍為偏移數(shù)據(jù)的將采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線對比 將入選對象按照正常對照組、糖尿病無并發(fā)癥組及糖尿病合并下肢血管病變組進(jìn)行基線資料比較。結(jié)果提示,3組間資料除年齡外,糖化血紅蛋白、病程、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對照組年齡較糖尿病組偏低,但糖尿病組內(nèi)2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.099)。

表1 3組間基線資料比較()

2.2 正常對照組與糖尿病組8-OHdG水平的比較 正常對照組血8-OHdG水平為(0.62±1.04) ng/ml,糖尿病無并發(fā)癥組為(2.84±1.59) ng/ml,糖尿病合并下肢血管病變組為(4.08±2.05) ng/ml,3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.3 下肢血管病變與8-OHdG的關(guān)系 將是否合并下肢血管病變作為因變量,以血清8-OHdG水平、年齡、性別、糖尿病病程、糖化血紅蛋白水平、LDL-C為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果提示,8-OHdG水平、LDL-C水平與糖尿病下肢血管病變有關(guān)。見表2。

表2 下肢病變與8-OHdG關(guān)系的Logistic回歸分析

3 討論

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病并發(fā)癥的重要發(fā)病機(jī)制之一[1-3]。在糖尿病病人中,DNA的斷裂、嘧啶環(huán)的氧化及嘌呤位點(diǎn)的改變較正常對照組均明顯升高,而這些改變均提示糖尿病與氧化應(yīng)激有著重要聯(lián)系[4-5]。在高血糖環(huán)境中,一方面,體內(nèi)抗氧化酶表達(dá)受到抑制[6];另一方面,線粒體電子傳遞鏈生成的電力學(xué)梯度產(chǎn)生的活性氧(ROS)和超氧自由基增多[7]。過多的ROS可以直接導(dǎo)致DNA的損傷[8],同時(shí)還可激活與糖尿病并發(fā)癥有關(guān)的己糖胺途徑、多元醇通路等的激活;此外還可導(dǎo)致氧化性更強(qiáng)的過氧化硝酸鹽合成增加,從而使硝化酪氨酸水平增高,造成DNA的損傷和組織細(xì)胞的凋亡,進(jìn)一步促使糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[9]。

8-OHdG是DNA中鳥嘌呤氧化損傷的特異產(chǎn)物,被認(rèn)為是內(nèi)源性氧自由基引起DNA損傷的一種標(biāo)志[10]。Leinonen等[11]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病中,尿中的8-OHdG較正常對照組水平明顯升高。本文作者既往研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管并發(fā)癥與血清8-OHdG水平密切相關(guān),但對于糖尿病大血管病變與DNA氧化損傷水平的關(guān)系,目前尚不明確,且研究較少,尤其是在糖尿病合并下肢血管病變的病人中。

本研究著重探討上述病人間血清8-OHdG水平的差異,并同時(shí)對病程、糖化血紅蛋白、LDL-C、血8-OHdG與糖尿病合并下肢血管病變的關(guān)系進(jìn)行分析。并且,本次試驗(yàn)是通過ELISA方法測定血單核細(xì)胞DNA提取液中8-OHdG的含量,分析方法較目前的高效液相色譜法電化學(xué)檢測法特異度、靈敏度更高;而且與以往以尿液作樣本相比,本實(shí)驗(yàn)所采用的靜脈抽血的提取樣本的方式更為方便,利于現(xiàn)場及大型人群分析,同時(shí)也能排除尿液中多種代謝產(chǎn)物及雜質(zhì)對結(jié)果的干擾。

本研究結(jié)果顯示,糖尿病組與正常對照組相比,血8-OHdG水平顯著升高(P<0.001),與既往研究結(jié)果一致[12]。這也證實(shí)了在糖尿病病人中,由于血糖的升高,超氧化物、糖基化產(chǎn)物等高糖代謝產(chǎn)物的蓄積,以及多元醇等氧化通路的激活,使糖尿病病人機(jī)體DNA氧化損傷較正常對照組明顯增多。此外,糖尿病合并下肢血管病變組與無并發(fā)癥糖尿病組相比,除LDL-C水平外,兩者間2組年齡、病程、糖化血紅蛋白均無顯著性差異(P>0.05),但其血清8-OHdG水平較無并發(fā)癥組顯著升高,提示DNA的氧化應(yīng)激損傷在糖尿病下肢血管病變的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。此外,為進(jìn)一步排除其他因素對結(jié)果的影響,我們將下肢血管病變與血清8-OHdG水平、糖化血紅蛋白、LDL-C等因素進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果提示血清8-OHdG水平與下肢血管病變間有獨(dú)立的相關(guān)關(guān)系,提示當(dāng)DNA氧化損傷逐步加重時(shí),會(huì)促進(jìn)糖尿病病人下肢血管病變的發(fā)生和發(fā)展。此外,結(jié)果也提示,LDL-C水平與下肢血管病變也密切相關(guān),這也提示在糖尿病下肢血管病變的發(fā)病中,血脂紊亂也發(fā)揮了很大的作用。

總之,糖尿病合并下肢血管病變的病人體內(nèi)8-OHdG較正常人及無并發(fā)癥的糖尿病病人明顯升高,提示在糖尿病合并下肢血管病變的病人中,DNA氧化損傷較正常人及無并發(fā)癥糖尿病病人嚴(yán)重。這也為抗氧化應(yīng)激治療在糖尿病下肢血管病變病人中的應(yīng)用提供了依據(jù),并可通過監(jiān)測8-OHdG水平評(píng)估治療效果。

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RelationshipbetweendiabeticperipheralvasculardiseaseandoxidativedamagetoDNA

CHENJi-hai,OUYANGXiao-jun.

DepartmentofGeriatrics;LOUQing-lin.DepartmentofEndocrinology;BIANRong-wen.DepartmentofChronicDiseaseandHealthManagementCenter,JiangsuGeriatricHospital,Nanjing210024,China

ObjectiveTo investigate the relationship between diabetic peripheral vascular disease and oxidative damage to DNA in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM).MethodsPatients with diabetes mellitus were divided into peripheral vascular disease group (n=35) and non-complication group (n=50). At the same time, 60 healthy subjects were enrolled as normal control group. DNA was extracted from mononuclear cells from whole blood, and the level of serum 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) was detected and compared between the three groups. Logistic regression analysis was used to identify the relationship between 8-OHdG and diabetic peripheral vascular disease.ResultsT2DM patients had significantly higher level of 8-OHdG than control group. In addition, the level of 8-OHdG in peripheral vascular disease group was significantly higher than that of the patients without complication(P<0.05)). Logistic regression showed that 8-OHdG and low density lipoprotein cholesterol were risk factors of diabetic peripheral vascular disease.ConclusionsT2DM patients with diabetic peripheral vascular disease showed greater oxidative damage to DNA, which is a risk factor of diabetic peripheral vascular disease.

type 2 diabetes mellitus; diabetic peripheral vascular disease; 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine; oxidative damage

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(71373132)

210024 江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)院干部保健科一區(qū)(陳吉海，歐陽曉俊)；內(nèi)分泌科(婁青林)；慢病及健康管理中心(卞茸文)

卞茸文，Email：bianrw@126.com

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.10.012

2016-11-08)