韓翠娜 鄒 歌 李丹丹 陳 燕

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河北唐山 063000

不同宮頸病變組織中HPV分型及P16、Ki-67的表達(dá)

韓翠娜 鄒 歌 李丹丹 陳 燕

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河北唐山 063000

①目的 討論不同宮頸病變組織中人乳頭瘤病毒(HPV)的基因分型及多腫瘤抑制基因(P16)、Ki-67的表達(dá)情況。②方法 收集2015年7月～2016年8月因液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)異?；騂PV感染就診于我院的患者91例均行陰道鏡檢查及活檢，包括低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)組、 高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(high-grade squamous intraepithelial lesions,HSIL)組各31例，以及宮頸鱗癌組29例；選擇同期32例慢性宮頸炎患者作為對(duì)照組。采用Cobas4800技術(shù)檢測(cè)高危型HPV(HR-HPV)在不同宮頸病變組織中的感染情況，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)不同宮頸組織中P16和Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度。③結(jié)果 隨著宮頸病變程度的增加，HR-HPV的感染率增高，HR-HPV在不同宮頸組織中的感染率差異顯著(χ2=26.67，P<0.05)；入選患者中主要為單一HR-HPV感染，隨著宮頸病變程度的增加，HR-HPV的多重感染率也增加，且不同宮頸病變組織間的多重感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.934，P<0.05)。P16、Ki-67在不同宮頸組織中表達(dá)水平差異顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且其表達(dá)水平與宮頸病變程度密切相關(guān)，隨著宮頸病變程度的增加，P16、Ki-67的表達(dá)水平和染色范圍逐漸增加，經(jīng)過Spearman相關(guān)分析，計(jì)算結(jié)果分別為γ=0.784、γ=0.840，雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05。④結(jié)論 HR-HPV的感染率及P16、Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸病變程度密切相關(guān)，P16和 Ki-67 有望作為診斷宮頸病變程度的重要輔助指標(biāo)。

宮頸病變 高危型HPV P16 Ki-67

宮頸癌是婦科常見的三大惡性腫瘤之一。近幾年，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人們的思想觀念也發(fā)生改變，導(dǎo)致性生活開放，如初次性生活年齡提前、多個(gè)性伴侶等致病因素的出現(xiàn)，進(jìn)而使患有該病的人群平均年齡日趨年輕化，對(duì)廣大女性的正常生活造成了巨大的影響。據(jù)相關(guān)的研究表明，該病的發(fā)生同高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)之間存在較為密切的關(guān)聯(lián)，通過早期的檢測(cè)可以預(yù)防HPV感染和該病毒所引起的癌前病變。宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程，與多種癌基因及抑癌基因的共同作用相關(guān)。P16是一種抑癌基因，其在宮頸病變及宮頸癌組織中的過度表達(dá)越來越引起人們的關(guān)注，Ki-67可判斷細(xì)胞的增殖活性，本文著重研究不同宮頸病變組織中HPV的感染情況及不同宮頸病變組織中P16和Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2015年7月～2016年8月因液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)異?；騂PV感染就診于我院的患者，均行陰道鏡檢查及活檢。入選的患者均有性生活史，年齡為20～70歲。入選患者分為觀察組和對(duì)照組，其中觀察組91例，包括低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(LSIL)、高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(HSIL)各31例以及宮頸鱗癌患者29例；選擇同期32例慢性宮頸炎患者作為對(duì)照組。收集的宮頸組織標(biāo)本經(jīng)宮頸活檢或手術(shù)所獲取，全部患者均未進(jìn)行過放療或者是化療。

1.2方法

1.2.1HR-HPV的檢測(cè) Cobas4800技術(shù)檢測(cè)HR-HPV。

1.2.2應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)宮頸組織中P16、Ki-67蛋白的表達(dá)

1.2.2.1免疫組化方法 標(biāo)本經(jīng)4%的多聚甲醛固定,石蠟包埋,每份標(biāo)本連續(xù)制做3張切片,1張切片進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)HE染色，另外2張切片分別進(jìn)行 P16、Ki-67染色。免疫組化染色按SP法進(jìn)行,嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.2.2免疫組化染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) P16 陽性顆粒呈棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞漿；Pl6的結(jié)果判定：綜合顏色深度和陽性細(xì)胞數(shù)量的百分比來進(jìn)行評(píng)估，參照下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：①依照染色的深淺度來進(jìn)行評(píng)判:沒有顯著顏色表現(xiàn)的即為0分，顏色不深或者稍微強(qiáng)于背景顏色的即為1分，中度染色或者為黃色的即為2分，顏色很深或者為棕褐色即為3分；②依照陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)量的百分比進(jìn)行評(píng)估:宮頸組織當(dāng)中陽性細(xì)胞數(shù)量比重<10%的即為0分，占10%～25%即為1分，占26%～50%即為2分，占>50%即為3分。最后以兩者計(jì)分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)：(-)0分 陰性；(+)1～4分 弱陽性；()5～8分 陽性；()9～12分 強(qiáng)陽性。

Ki-67陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ki-67根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量的百分比來進(jìn)行評(píng)估：宮頸組織當(dāng)中陽性細(xì)胞數(shù)量比重小于5%的即為陰性(-)；比重占5%～25%的即為弱陽性(+)；比重占到26%～50%為陽性()；陽性細(xì)胞數(shù)大于50%為強(qiáng)陽性()。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對(duì)所得到的實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)(如果不滿足該檢驗(yàn)的要求則使用 Fisher法進(jìn)行檢測(cè))，采用卡方分割的方法來進(jìn)行兩種不同樣本間的相互檢測(cè)。等級(jí)資料相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析，當(dāng)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同宮頸病變組織中HPV的感染情況 123例患者中發(fā)現(xiàn)HPV陽性者95例，HR-HPV感染率為77.24%，其對(duì)照組17例，HR-HPV的感染率為53.13%，LSIL組20例，感染率為64.52%，HSIL組29例，感染率為93.55%，宮頸鱗癌組29例，感染率為100.00%，隨著宮頸病變程度的增加，HR-HPV的感染率增高，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.67，P<0.05)，見表1。

表1 不同宮頸組織中HR-HPV的感染率比較(n,%)

2.2HR-HPV感染類型與宮頸病變的關(guān)系 123例患者中HR-HPV單一感染者83例，占總例數(shù)的67.48%，多重(雙重及以上)感染12例，占總例數(shù)的9.76%，其中對(duì)照組、LSIL組、HSIL組及宮頸鱗癌組中的單一感染率分別為53.13%、61.29%、83.87%及72.41%；多重感染率分別為0、3.23%、9.68%及27.59%。HR-HPV的多重感染率在不同宮頸病變組織間的感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.934，P<0.05)，由此可見，隨著宮頸病變程度的增加，HR-HPV的多重感染率增加，考慮可能與HR-HPV各基因型之間的相互作用促進(jìn)高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌的發(fā)展有關(guān),見表2。

表2 不同宮頸組織中單一及多重HPV感染情況(n,%)

2.3P16蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá) P16陽性表達(dá)為棕黃色顆粒分布于細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)，P16蛋白的免疫組化染色在對(duì)照組和LSIL中大部分為陰性表達(dá)，在HSIL組及宮頸鱗癌組中P16表達(dá)主要呈陽性和強(qiáng)陽性，見圖1。經(jīng)過卡方檢驗(yàn)，得出對(duì)照組分別與LSIL組、HSIL組及宮頸鱗癌組比較差異顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LSIL組分別與HSIL組、宮頸鱗癌組進(jìn)行比較差異顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HSIL級(jí)與宮頸鱗癌組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著宮頸病變程度的增加，P16的表達(dá)水平增加，經(jīng)過Spearman相關(guān)分析，得出γ=0.784，雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05，可見P16的表達(dá)強(qiáng)度和染色范圍與宮頸病變程度密切相關(guān)，見表3。

圖1 P16在不同宮頸組織中的表達(dá)及定位

2.4Ki-67在不同宮頸組織中的表達(dá) 在對(duì)照組和LSIL組中Ki-67為弱陽性表達(dá)，主要為宮頸上皮層下1/3的細(xì)胞核著棕黃色；在HSIL組、宮頸鱗癌組中主要為宮頸上皮層下2/3乃

至宮頸上皮全層細(xì)胞核著棕黃色，呈中度陽性乃至強(qiáng)陽性，其中宮頸早期浸潤(rùn)癌中可見到突破基底膜的點(diǎn)滴狀浸潤(rùn)灶，見圖2。經(jīng)過卡方檢驗(yàn)，得出對(duì)照組分別與LSIL組、HSIL組及宮頸鱗癌組進(jìn)行比較，差異顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LSIL組分別與HSIL組、宮頸鱗癌組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HSIL組與宮頸鱗癌組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ki-67免疫組化染色隨著宮頸病變程度的加重其表達(dá)水平逐漸增加，經(jīng)過Spearman相關(guān)分析，計(jì)算得到γ=0.840，雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05，由此可見，Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度和染色范圍與宮頸病變程度密切相關(guān)，見表4。

表3 不同宮頸病變組織中 P16 上皮細(xì)胞的表達(dá)

表4 不同宮頸病變組織中 Ki-67上皮細(xì)胞的表達(dá)

圖2 Ki-67在不同宮頸組織中的表達(dá)及定位

3 討論

宮頸癌是目前臨床上常見的婦科惡性腫瘤，宮頸癌有一個(gè)較長(zhǎng)的癌前病變期，絕大部分宮頸癌是由宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)即宮頸癌前病變逐漸發(fā)展形成的，宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展為宮頸癌需要一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的演變過程。目前認(rèn)為，持續(xù)性的HR-HPV感染與宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，目前已確定基因組全序列的有200多種亞型[1]，其中40余種亞型感染與生殖系統(tǒng)疾病有關(guān)，近20種亞型感染可誘發(fā)宮頸上皮內(nèi)病變或?qū)m頸癌[2]，尤其以HPV16、HPV18 感染最為常見。如果能夠做到早期篩查，可以早期發(fā)現(xiàn)癌前病變，在CIN期如能及時(shí)治療，可防止病情的發(fā)展，是防治宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變程度的增加，HR-HPV的感染率增加，多重感染率也增加，考慮可能與HR-HPV各基因型之間的相互作用促進(jìn)高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌的發(fā)展有關(guān)，進(jìn)而增加了宮頸癌的發(fā)病率。

近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室分子生物技術(shù)的進(jìn)步，人們通過尋找和應(yīng)用一些具有高度敏感性和特異性的細(xì)胞標(biāo)志物來替代或輔助傳統(tǒng)的單純的以細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)的診斷方法。在CIN的發(fā)生和發(fā)展過程中有多種分子出現(xiàn)異常表達(dá)，如P16、Ki-67等。P16基因是一種新型的抑癌基因，最早是由美國學(xué)者Kamb報(bào)道的，有研究顯示許多惡性腫瘤中存在P16基因的異常表達(dá)[3]。P16基因的表達(dá)水平在許多原發(fā)性腫瘤中發(fā)生改變, 如頭頸部腫瘤、食管癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等均發(fā)現(xiàn)，P16蛋白在這些腫瘤組織中的陽性表達(dá)水平均較非腫瘤組織中的陽性表達(dá)水平低，并且發(fā)現(xiàn)P16基因的失活率較高。而在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌病例中存在P16蛋白的高表達(dá),且會(huì)隨著宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌病情的發(fā)展而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，且與其抑癌基因的形象并不相符。有學(xué)者認(rèn)為P16蛋白在宮頸癌中表達(dá)水平增加的原因可能與HPV感染有關(guān)[4]，因?yàn)閷m頸癌患者90%以上伴有HPV感染，HPV病毒表達(dá)E7蛋白，E7蛋白與pRb蛋白結(jié)合并使之失活，失活的Rb基因可以反饋性的刺激P16蛋白的表達(dá)水平升高。Munoz等在對(duì)HR-HPV感染的宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)，P16蛋白的表達(dá)水平與HPVl6 /18表達(dá)呈正相關(guān)[5]，說明P16的過表達(dá)與HPV感染有關(guān)。本研究中P16蛋白在慢性宮頸炎組織中絕大多數(shù)呈陰性表達(dá), 而在 CIN、宮頸鱗癌組織中主要呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá), 隨著宮頸病變程度的增加，P16蛋白的表達(dá)強(qiáng)度及染色范圍也逐漸升高，與文獻(xiàn)的報(bào)道一致[5,6]。經(jīng)過Spearman相關(guān)分析，得出γ=0.784，雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05，顯示P16蛋白的表達(dá)強(qiáng)度和染色范圍表達(dá)與宮頸病變發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制存在密切關(guān)系。

Ki-67抗原是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，已有研究表明其增值指數(shù)是提示宮頸病變程度的一個(gè)靈敏標(biāo)記物，Kimura[7]等和Alameda[8]等的研究均發(fā)現(xiàn)Ki-67在LSIL組、HSIL組及宮頸浸潤(rùn)癌中的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，且差異顯著。齊思琴[9]等的研究顯示，宮頸癌組織中Ki-67的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示Ki-67的過表達(dá)可能與癌細(xì)胞的增殖程度緊密相關(guān)。在本次實(shí)驗(yàn)研究中， Ki-67在慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組及宮頸鱗癌中其陽性表達(dá)率分別為21.86%、 83.87%、93.55%、100.00%，經(jīng)過兩兩卡方檢驗(yàn)，得出各組之間差異顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ki-67免疫組化表達(dá)強(qiáng)度和染色范圍隨著宮頸病變程度的加重其強(qiáng)度逐漸增加，經(jīng)過Spearman等級(jí)相關(guān)分析，結(jié)果顯示Ki-67的表達(dá)強(qiáng)度和染色范圍與宮頸病變程度呈正相關(guān)(γ=0.840，P<0.05)。

綜上所述，HR-HPV、P16及Ki-67在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的過程中起著重要作用，且三者的表達(dá)水平均與宮頸病變的程度密切相關(guān)，對(duì)預(yù)測(cè)宮頸病變有一定的臨床參考價(jià)值，也為宮頸病變的早期診斷、治療提供一條新路徑。

[1] Egawa N,Egawa K,Griffin H,et al.Human papillomaviruees; epithelial tropisms,and the development of neoplasia[J].Viruses,2015,7(7):3863-3890

[2] Castellsague X,Dtaz M,De SS,et al.Worldwide human papillomavirus etiology of cervical adenocarcinoma and its cofactors: implications for screening and prevention[J].Journal of National Cancer Institute,2006,98(5):303-315

[3] 范 昭，葉 靜，龍 霞，等．P16 基因在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中甲基化的研究[J]．實(shí)用癌癥雜志，2011，26(1):34-36

[4] Munoz N,Bosch FX,de Sanjose S,et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer[J].The New England journal of medicine.2003,348(6):518-527

[5] 魏 璇，張一兵，杜 雪，等.P16蛋白在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用癌癥雜志，2014(3):276-277

[6] Bleotu C，Botezatu A，Goia CD，et al．P16INK4A-A possible marker in HPV persistence screening[J].Roumanian Archives of Microbiology & Immunology. 2009,68(3):183-189

[7] Kimura M,Matsumoto T,Morizane T,et al.Histopathological study of the spreading neoplastic cells in cervical glands and surface epithelia in cervical intra-epithelial neoplasia and microinvasive squamous cell carcinoma: Ki-67 immunostaining is a useful marker for pathological diagnosis from the gland involvement site[J].Pathologg International，2006,56(8):428-433

[8] Alameda F,Mancebo G,Garcia MP,et al.A study of Ki-67,c-erbB2 and cyclin D-1 expression in CIN-Ⅰ,CIN-Ⅲ and squamous cell carcinoma of the cervix[J].Histology and Histopathology,2007,22(6):587-592

[9] 齊斯琴,德 勝,李冬梅,等.宮頸鱗癌組織中Ki-67和P53的表達(dá)及其意義[J].中國婦幼保健,2013,28(6):1010-1012

(2017-02-27 收稿)(庫雪飛 編輯)

DetectionofHPVgeneandtheexpressionofP16andKi-67indifferentcervicallesions

HAN Cuina,ZOU Ge,LI Dandan,et al

(North China University of Science and Technology Affiliated to Hospital,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo explore the HPV genotypes and the expression of P16、Ki-67 in different cervical lesions.MethodsA total of 123 patients who underwent colposcopy and biopsy during July 2015 to August 2016 because of abnormal liquid based cytology or HPV (human papillomavirus) positive in the our hospital were entrolled in the study.They were divided into study group and the control group.The study dgroup included 31 cases of low-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL)、31 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and 29 cases of cervical cancer.The infection of high risk HPV (HR-HPV) in different cervical lesions was detected by Cobas4800 technique method, and the expression of P16 and Ki-67 underwent immunuhisto-chemistry to detect the expression of the degree of cervical lesions, analysis of the expression of SCCA, P16 and Ki-67 in cervical lesions and their relationship with the degree of cervical lesions.ResultsWith the increased in the degree of cervical lesions, HR-HPV infection rate increased, the infection rate of HR-HPV in different cervical tissues was significantly different(χ2=26.67，P<0.05);The patients were mainly single HR-HPV infection rate also increased,and the difference of multiple infection rates among different cervical lesions was statistically significant (χ2=15.934，P<0.05).The expression intensity of P16 and Ki-67 was closely related to the severity of cervical intraepithelial neoplasia (intraepithelial neoplasia cervical, CIN), The expression level of P16、Ki-67 was statistically significant differences in different cervical tissues (P<0.05),and the expression level of the factors in the cervical tissue was closely related to the degree of cervical lesions, the correlation coefficients werer=0.784,r=0.840,P<0.05.ConclusionThe infection rate of HR-HPV and the expression intensity of P16 and Ki-67 are closely related to the degree of cervical lesions.P16 and Ki-67 are expected to be the important supplementary indicators for the diagnosis of cervical lesions.

Cervical lesions.HR-HPV.P16.Ki-67

R 713.4

A

2095-2694(2017)05-365-05

韓翠娜(1989-)，女，碩士研究生。研究方向：婦科腫瘤。

陳 燕。