彭彬 張雪 曹帆帆 王瑩 孫家蘭 江梅 李龍宣

缺血性腦卒中患者恢復(fù)穩(wěn)定期外周血單個核細胞中差異表達基因的生物信息學(xué)研究

彭彬 張雪 曹帆帆 王瑩 孫家蘭 江梅 李龍宣

目的分析缺血性腦卒中(IS)患者恢復(fù)穩(wěn)定期外周血單個核細胞(PBMCs)中的差異表達基因，為探討腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期的遺傳病理機制提供生物信息學(xué)線索。方法選擇GEO數(shù)據(jù)庫中GDS4521芯片數(shù)據(jù)，該芯片以年齡、性別相匹配的20例IS恢復(fù)穩(wěn)定期(腦卒中發(fā)生至少6個月以上)患者和20例未發(fā)生過腦卒中者作為研究對象，收集其PBMCs進行基因芯片檢測，利用GEO2R、DAVID、g:profiler和String等工具，篩選和分析差異表達基因功能富集和相關(guān)信號通路情況。結(jié)果腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期組與對照組相比，在PBMCs中發(fā)現(xiàn)37個基因表達明顯變化，其中34個上升，3個下降。GO分析表明，這些差異表達基因在生物過程方面，以炎性反應(yīng)、中性粒細胞趨化相關(guān)基因為最多；在分子功能方面，以趨化因子活性相關(guān)基因為最多。KEGG信號通路分析表明，位于TNF信號通路中的差異表達基因數(shù)量最多。相互作用網(wǎng)絡(luò)圖揭示，這些差異基因主要以與炎性反應(yīng)相關(guān)的兩個網(wǎng)絡(luò)為主。結(jié)論IS發(fā)生超過6個月后仍有多種功能蛋白和信號通路可能發(fā)生改變，特別是與炎性反應(yīng)相關(guān)的蛋白和信號通路，提示炎性反應(yīng)在IS的恢復(fù)穩(wěn)定期仍可能對疾病的預(yù)后和再發(fā)起作用。

缺血性卒中；生物信息學(xué)；基因芯片；差異表達基因

腦卒中在全球范圍死亡率位列第二[1]。我國腦卒中發(fā)病率一直居高不下，成為威脅我國國民生命健康的第一位死因。腦卒中是一種復(fù)雜性疾病，由多種環(huán)境和遺傳等危險因素共同作用導(dǎo)致[2]，分為缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中，其中IS占大多數(shù)[3]。目前，對IS，特別是恢復(fù)穩(wěn)定期的分子變化研究十分有限，尋找該階段易感基因?qū)Ω玫亓私釯S恢復(fù)和復(fù)發(fā)機制有重要意義。生物芯片技術(shù)的應(yīng)用，為了解腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中多種組織器官中基因和蛋白的變化提供了便利，為研究腦卒中的發(fā)病機制提供了數(shù)以百計的候選分子。本研究通過分析基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中IS恢復(fù)穩(wěn)定期患者PBMCs芯片數(shù)據(jù)，利用多種數(shù)據(jù)分析技術(shù)，對該芯片進行生物信息學(xué)發(fā)掘，探索IS恢復(fù)穩(wěn)定期中蛋白的表達和涉及信號通路情況。

1 材料和方法

1.1芯片數(shù)據(jù)的選擇利用NCBI中GEO芯片數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)芯片進行搜索[4]，搜索詞為“stroke，homo”。經(jīng)篩選后，采用由Krug等提交的芯片數(shù)據(jù)(GDS4521)[2]，該芯片以Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array為平臺，收集20例首次發(fā)生或僅發(fā)生IS至少6個月后患者的外周血單個核細胞(PBMCs)，其中男10例，女10例，平均年齡(60.2±10.6)歲。以20例未發(fā)生腦卒中者作為對照，其中男10例，女10例，平均年齡(58.7±11.0)歲，排除存在腦卒中家族史且嚴(yán)重貧血和活動性過敏反應(yīng)者。兩組間性別構(gòu)成、年齡，合并高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病等基礎(chǔ)疾病以及抽煙、喝酒等生活習(xí)慣比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2方法GEO2R是一種網(wǎng)絡(luò)交互工具，能對GEO數(shù)據(jù)庫中的兩組及以上組別基因芯片數(shù)據(jù)樣本進行分析，得到在某種實驗條件下差異表達的基因情況。利用GEO2R在線分析工具，比較分析IS發(fā)病6個月以上患者與對照組PBMCs基因表達，尋找差異表達基因。

DAVID、g:profiler等是生物信息學(xué)分析中常用的在線分析工具，能對大量基因進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析、KEGG信號通路分析、功能注釋等。利用這兩種工具，對篩選出的差異表達基因進行基因功能注釋、富集分析和信號通路分析。String數(shù)據(jù)庫(String 10.0)是用來預(yù)測蛋白質(zhì)間功能相關(guān)性的在線分析工具，利用這一工具對找到的差異表達基因進行與它們相互作用蛋白的預(yù)測分析。

2 結(jié)果

2.1兩組PBMCs蛋白表達變化采集GEO數(shù)據(jù)庫中GDS4521芯片數(shù)據(jù)，通過GEO2R分析，對比IS患者與對照組PBMCs的基因表達情況，以value means difference在正負(fù)相差2倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，得到53種差異表達基因，去除重復(fù)、無gene ID等基因后，最終篩選出37種差異表達基因，其中34種在IS發(fā)生后超過6個月的恢復(fù)穩(wěn)定期中表達上調(diào)，3種(EIF5A、HLA-DQA1、TNFRSF17)表達下調(diào)。37種差異表達基因熱圖見圖1。

2.2差異表達基因功能富集和信號通路分析對篩選出的差異表達基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程方面，差異表達基因共分為51類，包含5個基因以上的類別為9類，主要集中在炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)、趨化作用、細胞增殖凋亡等；在細胞組成方面，差異表達基因主要分布在胞漿、細胞外間隙；在分子功能方面，差異表達基因共分為6類，主要集中在趨化因子活性及受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子活性等，以趨化因子活性相關(guān)基因為最多(圖2)。KEGG信號通路分析表明，差異表達基因主要分布在腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、趨化因子、TOLL樣受體(Toll-like receptor)、NOD樣受體等通路，其中在TNF-α信號通路中的相關(guān)基因最多(圖3)。具體結(jié)果見表1。

2.3差異表達基因相互作用分析除沒有預(yù)測到具有相互作用的9個蛋白外，其余差異蛋白之間主要構(gòu)成了2大網(wǎng)絡(luò)，分別以TNF和JUN兩個基因為中心。結(jié)果見圖4。

注：IS：缺血性腦卒中，圖2～4、表1同；PBMCs：外周血單個核細胞；差異基因表達量從高到低分別以紅色至藍色表示，熱圖左側(cè)為基因名稱，上方為樣本編號(其中IS為缺血性腦卒中組，Con為對照組)，右側(cè)樹狀結(jié)構(gòu)代表樣本之間的相似度聚類關(guān)系圖1 IS患者恢復(fù)穩(wěn)定期與對照組PBMCs差異表達基因熱圖(HemI 1.0軟件繪制)

圖2 IS組和對照組差異表達基因GO分析結(jié)果

3 討論

腦卒中復(fù)發(fā)率很高，發(fā)病后2年內(nèi)，25%的患者會在恢復(fù)期階段再發(fā)腦梗死或其他血管事件，但目前對腦卒中恢復(fù)期，特別是卒中發(fā)生后半年以上恢復(fù)穩(wěn)定期的分子病理研究有限，且既往關(guān)于腦卒中患者PBMCs表達譜的研究多集中在急性期或緩解期。有研究表明，腦卒中后神經(jīng)和功能恢復(fù)在發(fā)病6個月后到達平臺期，因此6個月被認(rèn)為是使PBMCs回到其“靜息”表達譜狀態(tài)充分的時間窗，更能反映個體易于罹患腦卒中的遺傳因素[5-7]。本研究通過對IS恢復(fù)穩(wěn)定期(首發(fā)IS 6個月以上)患者PBMCs生物芯片數(shù)據(jù)進行分析，篩選出與IS恢復(fù)穩(wěn)定期密切相關(guān)的多種蛋白和相關(guān)信號通路。

3.1IS發(fā)病后6個月PBMCs仍存在多種表達明顯異常蛋白GEO數(shù)據(jù)集組(GEO Data Sets，GDS)是GEO數(shù)據(jù)庫將用戶提供的樣本數(shù)據(jù)整理后，集中歸納到有生物統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)集合，可提供一個實驗的相關(guān)概況，以便進行下游數(shù)據(jù)挖掘。為便于尋找差異表達基因，GEO還同時提供了在線數(shù)據(jù)分析工具GEO2R[8]。該工具基于R語言中Bioconductor包，對數(shù)據(jù)進行分析，是篩選芯片數(shù)據(jù)中差異表達基因的有利工具。本研究運用GEO2R分析，發(fā)現(xiàn)GDS4521芯片數(shù)據(jù)中37種差異表達基因，其中34種在IS發(fā)生超過6個月后，與對照組相比明顯上調(diào)，3種下調(diào)。GDS4521芯片所收集的樣本為IS首發(fā)后至少6個月以上患者的PBMCs，該時間段患者經(jīng)急性期治療進入恢復(fù)期，病情已處于穩(wěn)定階段，但這些患者機體中仍然存在數(shù)十種蛋白表達異常，提示盡管患者病情已趨于穩(wěn)定，但體內(nèi)可能仍有病理過程在發(fā)生，如果能針對這些異常蛋白或其所在信號通路予以干預(yù)，有可能會促進腦卒中患者的康復(fù)和防止再發(fā)。

圖3 IS組和對照組差異表達基因KEGG分析結(jié)果

表1 IS組和對照組差異表達蛋白功能富集和信號通路分析列表

注：BP：biological process(生物過程)；CC：cellular component(細胞組成)；MF：molecular function(分子功能)

注：每個圓圈代表一種基因，小圈表示該蛋白3D結(jié)構(gòu)尚未知，大圈表示該蛋白3D結(jié)構(gòu)已知；直線表示蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，線越粗表示二者之間的相互作用更強圖4 IS組和對照組差異表達基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3.2炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)在腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期病程中的作用大量動物實驗和臨床研究表明，炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)在腦卒中發(fā)病后早期扮演著重要角色，影響腦卒中的預(yù)后和治療[9-12]。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制miR-155能顯著降低腦卒中模型小鼠造模7 d后CCL12和CXCL3等細胞因子的表達，減輕腦卒中后的炎性反應(yīng)，促進組織修復(fù)[13]。Edwards等關(guān)于兒童動脈性IS的文獻綜述也提示，早期運用調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)的藥物治療，對動脈性IS的發(fā)生和復(fù)發(fā)可能有預(yù)防作用[14]。目前有關(guān)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)在腦卒中恢復(fù)期中的作用研究甚少，僅見少量報道[15-16]。如Rooth等報道了凝血酶激活的纖溶抑制物(thrombin activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)在缺血性腦卒中急性期和恢復(fù)期中與纖溶和炎性反應(yīng)的關(guān)系[15]。

本研究通過對腦卒中患者恢復(fù)穩(wěn)定期PBMCs生物芯片的再分析發(fā)現(xiàn)，腦卒中后與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的10種差異表達蛋白，分別為CCL20、CXCL1、PTGS2、TNFAIP3、TNF、CCL3L3、CXCL2、CXCL3、IL1B和CXCL8，以及與免疫反應(yīng)密切相關(guān)的10中差異表達蛋白，分別是RGS1，CCL20、HLA-DQA1、CXCL1、TNF、OSM、CXCL2、CXCL3、IL1B、CXCL8。盡管其中部分蛋白在腦卒中后早期病理改變中的作用已有較多研究，如CXCL1、PTGS2和TNF等，但在恢復(fù)期中其確切作用尚不清楚；同時，部分差異蛋白在腦卒中后的作用研究較少或尚未涉及，如CCL20、TNFAIP3、CCL3L3、CXCL3、RGS1和HLA-DQA1等。差異表達基因相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，以上蛋白相互間具有緊密聯(lián)系，提示這些蛋白及其相關(guān)信號通路可能成為腦卒中發(fā)病及治療過程中的新靶點，也可能成為預(yù)測腦卒中再發(fā)的標(biāo)志分子，值得進一步進行研究驗證。

3.3TNF和CXCL8分子參與腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期多種病理過程和信號通路作者所在團隊前期研究和既往研究結(jié)果均表明，TNF在IS早期梗死病灶核心區(qū)組織及血管修復(fù)中有重要作用[17-19]。腦缺血后早期，小膠質(zhì)細胞被激活，神經(jīng)源性和免疫調(diào)節(jié)性細胞因子TNF產(chǎn)生增加，參與腦缺血后的各種病理生理過程[20]。本研究結(jié)果顯示，TNF可能在腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期同樣具有重要作用，不僅通過參與免疫和炎性反應(yīng)影響腦卒中的病程發(fā)展，還可能通過參與細胞增殖、凋亡、NO合成、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、內(nèi)皮屏障功能調(diào)節(jié)等多種生物過程，導(dǎo)致腦缺血后恢復(fù)穩(wěn)定期一系列病理改變。

值得關(guān)注的是，本研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL8可能是腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期病理發(fā)展過程中一個重要的影響因子，通過GO富集分析和KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，在IS恢復(fù)穩(wěn)定期階段，差異表達基因在趨化因子調(diào)節(jié)的生物過程和相關(guān)信號通路顯著富集。但目前趨化因子及其相關(guān)通路在腦卒中的作用研究甚少，其確切臨床意義尚需進一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法，進一步分析了IS恢復(fù)穩(wěn)定期患者PBMCs基因芯片，篩選出若干差異表達基因，找到一些可能成為腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期研究新的靶分子和信號通路，為腦卒中恢復(fù)穩(wěn)定期治療和再發(fā)預(yù)測提供了新思路。

[1]Feigin VL. Stroke in developing countries: can the epidemic be stopped and outcomes improved?[J].Lancet Neurol, 2007, 6 (2):94-97.

[2]Krug T, Gabriel JP, Taipa R, et al. TTC7B emerges as a novel risk factor for ischemic stroke through the convergence of several genome-wide approaches[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2012, 32 (6):1061-1072.

[3]Chauhan G,Debette S. Genetic risk factors for ischemic and hemorrhagic stroke [J]. Curr Cardiol Rep, 2016, 18 (12):124.

[4]Edgar R, Domrachev M,Lash AE. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository[J]. Nucleic Acids Res, 2002, 30 (1):207-210.

[5]Moore DF, Li H, Jeffries N, et al. Using peripheral blood mononuclear cells to determine a gene expression profile of acute ischemic stroke: a pilot investigation[J]. Circulation, 2005, 111(2):212-221.

[6]Moore DF, Wright V, Yu H, et al. Gene expression changes during recovery from ischemic stroke: a longitudinal study and data analysis[J]. Ann Neurol, 2005, 58:S42-43.

[7]Tang Y, Xu H, Du X, et al. Gene expression in blood changes rapidly in neutrophils and monocytes after ischemic stroke in humans: a microarray study[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006, 26(8):1089-1102.

[8]Barrett T, Wilhite SE, Ledoux P, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets—update[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41 (Database issue):D991-995.

[9]Amadatsu T, Morinaga J, Kawano T, et al. Macrophage-derived angiopoietin-like protein 2 exacerbates brain damage by accelerating acute inflammation after ischemia-reperfusion[J]. PloS One, 2016, 11 (11):e0166285.

[10]Lin R, Cai J, Kostuk EW, et al. Fumarate modulates the immune/inflammatory response and rescues nerve cells and neurological function after stroke in rats[J]. J Neuroinflammation, 2016, 13 (1):269.

[11]Molnar T, Pusch G, Nagy L, et al. Correlation of the L-arginine pathway with thrombo-inflammation may contribute to the outcome of acute ischemic stroke[J]. J Stroke Cerebrovasc Dis, 2016, 25 (8):2055-2060.

[12]Rodriguez-Grande B, Swana M, Nguyen L, et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014, 34 (3):480-488.

[13]Pena-Philippides JC, Caballero-Garrido E, Lordkipanidze T, et al. In vivo inhibition of miR-155 significantly alters post-stroke inflammatory response[J]. J Neuroinflammation, 2016, 13 (1):287.

[14]Edwards HB, Mallick AA,O’Callaghan FJ. Immunotherapy for arterial ischaemic stroke in childhood: a systematic review[J]. Arch Dis Child, 2017,102(5):410-415.

[15]Rooth E, Wallen H, Antovic A, et al. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and its relationship to fibrinolysis and inflammation during the acute and convalescent phase of ischemic stroke[J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 2007, 18 (4):365-370.

[16]Haapaniemi E, Soinne L, Syrjala M, et al. Serial changes in fibrinolysis and coagulation activation markers in acute and convalescent phase of ischemic stroke[J]. Acta Neurol Scand, 2004, 110 (4):242-247.

[17]Revathikumar P, Bergqvist F, Gopalakrishnan S, et al. Immunomodulatory effects of nicotine on interleukin 1beta activated human astrocytes and the role of cyclooxygenase 2 in the underlying mechanism[J]. J Neuroinflammation, 2016, 13 (1):256.

[18]Nguyen TV, Frye JB, Zbesko JC, et al. Multiplex immunoassay characterization and species comparison of inflammation in acute and non-acute ischemic infarcts in human and mouse brain tissue[J]. Acta Neuropathol Commun, 2016, 4 (1):100.

[19]王富鑫, 黃恒, 黃綺娟,等. 腦梗死后TNF-α對腦內(nèi)促血管新生分子α5β1和αVβ3 的上調(diào)作用[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2015, 32 (4):292-295.

[20]Clausen BH, Degn M, Sivasaravanaparan M, et al. Conditional ablation of myeloid TNF increases lesion volume after experimental stroke in mice, possibly via altered ERK1/2 signaling[J]. Sci Rep, 2016, 6:29291.

BioinformaticstudyondifferentialexpressiongenesinPBMCscollectedfromischemicstrokepatientsduringconvalescentphase

PENGBin,ZHANGXue,CAOFanfan,WANGYing,SUNJialan,JIANGMei,LILongxuan*.

*DepartmentofNeurology,ShanghaiGongliHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200135,China

LI Longxuan，Email：Longxuanlee2006@yahoo.com

ObjectiveTo screen differential expression genes (DEGs)in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with ischemic stroke (IS) during convalescent phase, and to analyze their functional characteristics, in order to further understand the pathologic mechanism of stroke and provide some bioinformatic clues.MethodsThe data of Chip GDS4521 collected from PBMCs in the convalescent phase of IS were chosen from the GEO database. GEO2R analysis tools were used to search for DEGs, and the characteristics of gene function enrichment and related signal pathways in these DEGs were analyzed by DAVID, g: profiler and String.ResultsCompared with the normal control group, the expression of 37 genes in PBMCs was significantly changed in the IS recovery period (> 6 months), 34 of which were significantly increased and 3 genes decreased significantly. Gene Ontology (GO) analysis showed that in biology process these DGEs were mainly involved in inflammatory process, neutrophil chemotaxis, cell proliferation and apoptosis, and signal transduction.In molecular function most of them are related to chemokine activity and receptor binding, transcription factor activity, cytokine activity, and so on. KEGG signaling pathway analysis showed that the DEGs were mainly involved in TNF, NF-κB, chemokines, TOLL-like receptors and NOD-like receptors signaling pathways. The network map of the DEGs revealed that these genes were mainly dominated by two network maps related to inflammation.ConclusionsThis study demonstrated that many functional proteins and multiple signaling pathways may change at least 6 months after IS, especially in inflammation-related proteins and pathways, suggesting that inflammatory response might play a key role not only in acute but also in convalescent phase of IS.

ischemic stroke;bioinformation; gene chip;differential expression gene

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.05.002

國家自然科學(xué)基金面上項目(81571203)；上海市自然科學(xué)基金項目(15ZR1437200)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才培養(yǎng)計劃(PWR12014-05)；上海市醫(yī)學(xué)重點?？平ㄔO(shè)計劃項目(ZK2015B16)；上海市衛(wèi)計委科研項目(201540394)；上海市衛(wèi)生計生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人(百人計劃)(2017BR051)

200135上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院&第二軍醫(yī)大學(xué)附屬公利醫(yī)院中法合作中心實驗室(彭彬、張雪、曹帆帆、王瑩)，神經(jīng)科(孫家蘭、江梅、李龍宣)

李龍宣，Email：Longxuanlee2006@yahoo.com

R743.3

A

1006-2963(2017)05-0318-06

2016-12-19)

(本文編輯：時秋寬)