張鳳清 趙 麗 劉美善 崔林虎 滕 月 玄永男*

（1長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130014；2延邊林業(yè)科學(xué)研究院，吉林延吉133001）

北冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps militaris），別名蛹蟲(chóng)草、北蟲(chóng)草，隸屬于子囊菌亞門(mén)，麥角菌科、蟲(chóng)草屬[1]，是蟲(chóng)草屬的模式種。野生的北冬蟲(chóng)夏草與冬蟲(chóng)夏草具有相似的生物活性成分，主要包括蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖、麥角甾醇、氨基酸、核苷類(lèi)物質(zhì)等，功效與冬蟲(chóng)夏草相似[2-4]。

冬蟲(chóng)夏草菌和北冬蟲(chóng)夏草菌發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，其中，最著名的就是蛹蟲(chóng)草菌產(chǎn)生的蟲(chóng)草素[5]，蟲(chóng)草素具有抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種生物功效，已引起國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的極大關(guān)注。目前，已有不少以蟲(chóng)草素為主的藥品、保健品及化妝品研發(fā)成果，如蟲(chóng)草素膠囊、用于治療動(dòng)脈粥樣硬化及抗抑郁的藥物等。而我國(guó)由蟲(chóng)草素合成的治療白血病新藥也已進(jìn)入Ⅰ期臨床階段[6]。試驗(yàn)選擇桑蠶蛹為培養(yǎng)基質(zhì)栽培得到的北冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行蟲(chóng)草素提取工藝的研究，以期為進(jìn)一步進(jìn)行蟲(chóng)草素工業(yè)化提取提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑、設(shè)備蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品，（純度＞98%）上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。高效液相色譜：Agilent 1200 infinity Series美國(guó)Sigma公司。超高壓設(shè)備：HPP600 MPa/30 L，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司。其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱(chēng)取干燥至質(zhì)量恒定蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為80 μg/mL。用超純水分別稀釋成2、5、10、20、40、80 μg/mL的蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理 將蟲(chóng)草原料置于40℃烘干箱中烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)200目篩，精確稱(chēng)取干燥至質(zhì)量恒定的樣品0.50 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液后超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20℃、5000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，吸取上清液1 mL，經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾后直接注入進(jìn)樣瓶以供分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，51 μm）；流動(dòng)相：以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（取三氟乙酸600 μL加水配制成600 mL，（2∶98），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣；柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

1.2.4 蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 取6個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋振蕩充分混勻，用0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾后直接注入進(jìn)樣瓶。每個(gè)進(jìn)樣重復(fù)3次，以蟲(chóng)草素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，蟲(chóng)草素均在2～801 μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，蟲(chóng)草素的回歸方程為y=38505x+8952.2，r=0.9993。

1.2.5 提取方法優(yōu)選

1.2.5.1 水熱回流法 精密稱(chēng)取粉碎過(guò)60目篩的北冬蟲(chóng)夏草10 g。置于80℃水浴鍋中提取3次，加水量分別為樣品重的10、8.8倍，提取時(shí)間為每次2 h，合并提取液過(guò)濾，收集濾液并定容至250 mL。

1.2.5.2 醇熱回流法 精密稱(chēng)取粉碎過(guò)60目篩的北冬蟲(chóng)夏草10 g，置于80℃水浴鍋中提取三次，加入75%乙醇量分別為樣品重的10、8.8倍，提取時(shí)間為每次2 h，合并提取液過(guò)濾，收集濾液并定容至250 mL。

1.2.5.3 超高壓萃取 精密稱(chēng)取粉碎過(guò)60目篩的北冬蟲(chóng)夏草10 g，準(zhǔn)確加入250 mL 50%乙醇，密封混勻，300 MPa，5 min。

1.2.6 提取工藝條件優(yōu)選

1.2.6.1 單因素試驗(yàn) 溶劑體積分?jǐn)?shù)：分別準(zhǔn)確加入10%，30%，50%，70%，90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇500 mL；

固液比：精確稱(chēng)定10 g樣品5份，以10、25、50、75、100倍分別加入70%乙醇。

壓力的選擇：精確稱(chēng)定10 g樣品5份，分別加入70%乙醇1000 mL。密封混勻，加壓100、200、300、400、500、600 MPa。

1.2.6.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照盡量減少試驗(yàn)次數(shù)和尋求設(shè)計(jì)最優(yōu)的原則，選擇提取壓力（A）、容積體積分?jǐn)?shù)（B）和固液比（C）作為因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，正交試驗(yàn)方案見(jiàn)2.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取蟲(chóng)草素情況比較由表1結(jié)果可知超高壓萃取法的提取率遠(yuǎn)高于其他兩種方法，故選擇超高壓萃取法為提取方法。

表1 不同提取方法對(duì)蟲(chóng)草素提取率的影響

2.2 提取工藝條件優(yōu)選

2.2.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)的選擇 隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，蟲(chóng)草素隨之升高，而乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，蟲(chóng)草素的提取率明顯降低，因此選擇乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為30%～70%。

表2 超高壓萃取提取蟲(chóng)草素的乙醇體積分?jǐn)?shù)

2.2.2 固液比的選擇 由表3可以看出隨著固液比的增加蟲(chóng)草素的提取率逐漸增加。但考慮到有效成分提取分離的后處理的工作量以及經(jīng)濟(jì)性，選擇最佳固液比范圍為1∶25～1∶75。

2.2.3 壓力的選擇 由表4可見(jiàn)隨著提取壓力的提高，提取率逐漸升高，在100～500 MPa時(shí)，兩者呈線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)壓力達(dá)到600 MPa時(shí)，提取率有所降低，由此可得最佳壓力為100～500 MPa。

2.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 結(jié)果表明，各因素對(duì)蟲(chóng)草素提取率影響大小為A=C＞B，最佳試驗(yàn)方案為A3B2C3，即提取壓力500 MPa、容積體積分?jǐn)?shù)為50%，固液比1∶75、提取時(shí)間為2 min，追加試驗(yàn)結(jié)果

表3 超高壓提取蟲(chóng)草素的不同固液比

表4 超高壓提取蟲(chóng)草素的不同壓力收率比較

表5 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

3 小結(jié)與討論

最佳提取工藝條件為使用超高壓提取方法，提取壓力500 MPa、容積體積分?jǐn)?shù)為50%，固液比1∶75、提取時(shí)間為2 min，提取率達(dá)到5.5 mg/g。

超高壓技術(shù)在我國(guó)還處于起步階段，該技術(shù)在國(guó)內(nèi)外主要應(yīng)用于食品業(yè)，目的是為了防止食物的微生物污染、延長(zhǎng)食品儲(chǔ)藏時(shí)間[7]。2004年吉林工業(yè)大學(xué)張守勤等[8]率先將該技術(shù)應(yīng)用于中藥提取，隨后，在黃酮類(lèi)[9，10]皂苷類(lèi)[11，12]多糖類(lèi)[13，14]等的提取中均得到了應(yīng)用，結(jié)果表明其在有效成分提取方面具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。超高壓提取在常溫下進(jìn)行，該條件有助于對(duì)溫度敏感的成分的活性保持，適用范圍廣，提取時(shí)間短，一般只需1～20 min；提取效率高，提取產(chǎn)物雜質(zhì)含量少，能夠明顯減少原料中的微生物含量，從而延長(zhǎng)存放時(shí)間；提取過(guò)程中無(wú)溶劑的揮發(fā)，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，而且提取工藝簡(jiǎn)單，機(jī)械化程度高，適宜由實(shí)驗(yàn)室推廣到現(xiàn)代化大生產(chǎn)中[13]。

試驗(yàn)以桑蠶蛹北冬蟲(chóng)夏草為試驗(yàn)對(duì)象，選用超高壓提取方法對(duì)蟲(chóng)草素進(jìn)行提取，全程只需要加壓的階段消耗電能，一次可以處理幾十千克物料，提取時(shí)間短，提取率高，是適合蟲(chóng)草素工業(yè)化提取的綠色環(huán)保節(jié)能的提取工藝。