全衛(wèi)豐 鄭惠華 劉廣建 蔣 益 薛 璟 季宏更 汪 潔

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫，214063；2江蘇?。ㄌK微）菌物工程技術研究中心，江蘇無錫，214063；3江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通216009）

灰樹花是一種大型珍稀食藥用菌，又名舞茸、貝葉多孔菌，隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、灰樹花屬，子實體肉質，質感脆嫩，外形層疊似菊，具有清香氣味[1]?；覙浠ǘ嗵鞘腔覙浠ǖ闹饕δ芪镔|之一，可以從灰樹花子實體、液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液中提取。相關研究證實灰樹花多糖主要由D-葡萄糖以及少量的D-木糖、D-甘露糖、D-鹽藻糖、L-阿拉伯糖、龍膽二糖和半乳糖組成的一類異構糖復合物，具有生物活性的灰樹花多糖的基本結構為帶有β-（1-6）側鏈的β（1-3）-D-葡聚糖[2-4]?；覙浠ǘ嗵蔷哂薪笛?、調節(jié)免疫、抗腫瘤以及抵抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，有著廣泛的藥理作用和應用開發(fā)前景[5]。

有研究工作者利用自然選育、雜交技術進行灰樹花新菌株的選育工作，如劉振偉等[6]利用多孢雜交技術對不同種的灰樹花品種進行雜交，培育出了灰樹花優(yōu)良菌株，栽培生物轉化率達73.4%，比出發(fā)菌株提高了19.5%，且表現(xiàn)出較強的耐雜、抗雜能力。黃春燕等[7]對野生灰樹花菌種進行系統(tǒng)選育馴化培養(yǎng)出“梯灰1號”，該品種豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、商品性好，已在部分地區(qū)推廣種植。迄今為止，僅見的研究報告主要在灰樹花的栽培品種選育方面。試驗采用原生質體紫外誘變育種技術選育灰樹花優(yōu)良新菌株，旨在通過改良菌種來提高灰樹花菌株液體發(fā)酵的多糖產(chǎn)率，為工業(yè)化生產(chǎn)制備灰樹花多糖創(chuàng)造條件，試驗也在灰樹花多糖高產(chǎn)優(yōu)良菌株的人工選育方面做了有益的嘗試。

1 材料與方法

1.1 供試材料①菌株：灰樹花1號，引自北京吉蕈園科技有限公司。②試驗儀器設備：紫外誘變箱，倒置顯微鏡（澳浦光電DSZ2000），渦旋振蕩器（IKA），旋轉式搖床（HZ-81），隔水式培養(yǎng)箱（DHP-9162B），0.22um針頭濾器（MILLEX GP），循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA等。③試劑：溶壁酶，購于廣東省微生物研究所。甘露醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、麥芽糖均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂 0.5 g，pH 自然，瓊脂20 g，加水1000 mL。

PD液體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，pH自然，玻璃珠適量，加水1000 mL。

RM再生培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，麥芽糖4 g，酵母浸膏4 g，瓊脂15 g，pH自然，0.6 mol/L甘露醇溶液1000 mL。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，豆餅粉10 g，玉米粉 20 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，VB150 mg，pH自然，加水1000 mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%，玉米粉2.5%，豆餅粉0.75%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，pH自然，加水1000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 灰樹花原生質體制備及再生

1.3.1.1 菌絲培養(yǎng) 灰樹花斜面菌塊接種于150 mL PD液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)7～9 d，其間每日振搖1次。培養(yǎng)液過80目銅篩，去除瓊脂塊，收集菌絲，無菌水沖洗1遍，甘露醇溶液沖洗2遍，盡可能擠去水分，置于滅菌后的空試管中，稱重，計算出菌絲濕重。取菌絲約1 g。

1.3.1.2 菌絲酶解 溶壁酶配置成2%濃度，30℃活化0.5 h，酶液用0.22 μm細菌濾器過濾后，按照每100 mg濕菌絲添加1 mL的酶液量加入酶液，渦旋振蕩混勻。選取酶解溫度和時間作為試驗因素，設置不同的因素水平，基礎參數(shù)：酶解溫度32℃；時間3 h[8]。鏡檢觀察原生質體情況。

1.3.1.3 原生質體的精制 酶解液用滅菌后的8層擦鏡紙過濾，甘露醇溶液洗滌，3000 r/min離心15 min，重復處理兩次，加入甘露醇溶液定容至15 mL，渦旋振蕩混勻，得原生質體懸液備用。

1.3.1.4 原生質體再生 將精制后的原生質體懸液稀釋至107個/mL（血球計數(shù)板計數(shù)），取0.1 mL涂布于原生質體再生培養(yǎng)基上，26℃避光培養(yǎng)7～10 d，觀察原生質體菌落再生情況，計數(shù)。計算原生質體的再生率。

原生質體再生率=再生的原生質體菌落數(shù)/原生質體數(shù)量×100%

1.3.2 原生質體紫外誘變 取精制的原生質體懸液，稀釋至濃度107個/mL級，渦旋混勻，取約15～20 mL，置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，放置滅菌回形針兩個。

紫外誘變箱中進行紫外誘變處理，同時開啟磁力攪拌。紫外燈管15 W，距離20 cm，分別處理0 s，15 s，30 s，45 s，60 s，75 s，90 s，120 s。每個平皿取0.2 mL涂布于RM再生培養(yǎng)基上，26℃避光培養(yǎng)10～12 d，進行菌落計數(shù)，誘變過程中避免可見光，防止發(fā)生光修復。以紫外誘變0s作為對照，考察紫外誘變劑量（時間）對原生質體致死率的影響。致死率=1-（紫外誘變處理后原生質體再生菌落的數(shù)量/對照原生質體的再生菌落數(shù)量）×100%

1.3.3 誘變菌株篩選 在RM再生培養(yǎng)基上挑選出經(jīng)誘變后再生的菌落，轉接于PDA培養(yǎng)基上，與出發(fā)菌株進行拮抗試驗、菌絲生長速度比較試驗和搖瓶液體發(fā)酵試驗。

1.3.3.1 拮抗試驗 將誘變后菌株與出發(fā)菌株接種于同一PDA培養(yǎng)基平板上，26℃避光培養(yǎng)，觀察菌絲相接處生長情況。如菌絲相接處有明顯的相斥，菌絲在相接處何不生長或向上拱起，從背面觀察相交處呈現(xiàn)細線，則可以認定兩種菌絲有拮抗現(xiàn)象；如菌絲互相相交滲透生長，沒有明顯的相斥，則可以認定這兩種菌絲不存在拮抗現(xiàn)象。

1.3.3.2 菌絲生長速度比較試驗 選擇適齡菌種，用打孔器（直徑為6 mm）接種于PDA培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿背面接種處劃“十”字交叉線標記，26℃避光培養(yǎng)14 d左右。其間，等菌絲萌發(fā)后每隔兩天測量一次菌絲生長邊緣至“十”字交叉點的距離，取四個值的平均值作為菌落的半徑。記錄不同時間對應的菌落半徑，計算菌絲平均生長速度。

1.3.3.3 液體搖瓶發(fā)酵試驗 在菌落外緣，取同樣菌齡的PDA平板培養(yǎng)基上的菌種，用打孔器接種15～20菌塊，接種于液體種子培養(yǎng)基中，26℃，140 r/min，旋轉式搖床，避光培養(yǎng)8～10 d。以8%接種量接液體種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)5～7 d，抽濾，菌絲體65℃烘干至恒重，稱重，即為菌絲生物量。

分別收集發(fā)酵菌絲體進行菌絲體胞內多糖的含量測定。測定方法為硫酸-蒽酮法[9]。搖瓶液體發(fā)酵胞內多糖產(chǎn)量=菌絲體生物量×胞內多糖含量（單位：g/L）

1.3.3.4 酯酶同工酶電泳試驗 利用同工酶電泳試驗對經(jīng)過篩選后的菌株與出發(fā)菌株進行比較驗證，判別是否為遺傳性狀不同的菌株[10，11]。計算試驗菌株酯酶同工酶電泳圖譜譜帶相似度T和關聯(lián)度S。T=nx1…n/（X1+X2+……+Xn），其中n表示試驗菌株的數(shù)量，xn表示第n個菌株的酶譜的帶數(shù)，X1…n是n個菌株所共同具有的酶譜的帶數(shù)，S=（兩個菌株之間共有的酶譜帶數(shù)）/（兩菌株所具有的酶譜帶數(shù)之和減去兩個菌株所共有的酶譜帶數(shù)）。如果T＜0.9、S＜0.8，則可判定試驗菌株發(fā)生了變異。

1.3.4 菌株遺傳穩(wěn)定性的驗證 將需要進行遺傳穩(wěn)定性驗證的試驗菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)10次，而后參見1.2.3.2和1.2.3.3的試驗方法進行驗證，比較經(jīng)過繼代培養(yǎng)的菌株與初代菌株之間在菌絲生長速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標上有無明顯的退化。

2 結果與分析

2.1 酶解溫度、時間對灰樹花原生質體制備及再生率的影響鏡檢發(fā)現(xiàn)，酶解溫度在28～34℃對原生質體制備的數(shù)量有一定的影響，原生質體產(chǎn)量在32℃最高，在34℃時相應的原生質體數(shù)量有所下降，但這種差異不是非常顯著。另從表1中可以看出，在28～34℃的試驗溫度內，隨著溫度的上升，原生質體再生率呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢，在32℃原生質體的再生率最高，達到0.00231%。

表1 酶解溫度對灰樹花原生質體再生率的影響

表2 酶解時間對灰樹花原生質體再生率的影響

圖1 紫外誘變時間對原生質體致死率的影響

圖2 菌絲拮抗試驗

表3 菌絲生長速度試驗結果

通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，酶解時間對原生質體的生成有顯著的影響，在酶解2 h后，原生質的數(shù)量比較少，大量存在的是菌絲，而在3 h之后原生質體的數(shù)量較多，有少量的菌絲，原生質體數(shù)量出現(xiàn)明顯的增長，在酶解4 h后，原生質體的數(shù)量同比有一定的增長。另從表2可見，原生質體再生率隨著時間的增長呈現(xiàn)下降的趨勢，在酶解2～4 h，以酶解2 h所對應的原生質體再生率最高。由于在酶解2 h，原生質體制備的數(shù)量非常少，綜合原生質體的數(shù)量及再生率，試驗選擇酶解時間3 h為宜。

綜合酶解溫度、酶解時間對原生質體制備及再生率的影響，試驗選擇酶解溫度32℃，酶解3 h作為灰樹花原生質體制備的適宜參數(shù)。

2.2 紫外誘變劑量對原生質體致死率的影響試驗中選擇紫外誘變時間作為主要的誘變劑量參數(shù)。

由圖1可見，在15 W紫外燈管，距離樣品20 cm時，灰樹花原生質體致死率隨著誘變時間的增長呈明顯上升趨勢，在紫外照射時間60 s時，原生質體致死率為90%，而在照射時間達到90 s以上時，原生質體幾乎沒有再生，明顯高于在相同劑量下紫外誘變菌絲所對應的致死率（基于相應的試驗結果，數(shù)據(jù)暫未列出）。分析其中原因，可能是原生質體缺少了細胞壁的保護，導致其對紫外線損傷的耐受性明顯降低，更容易致死，同時經(jīng)過誘變后，原生質體的再生也較難。鑒于以往經(jīng)驗，選擇致死率為90%所對應的誘變劑量作為試驗誘變的適宜劑量，即在15 W紫外燈管距離樣品20 cm時，照射60 s作為適宜的誘變條件。

2.3 誘變菌株的篩選

2.3.1 初篩 挑取誘變再生后的試驗菌株約600多株與對照菌株進行拮抗試驗，先后挑取有拮抗現(xiàn)象的菌落156個，其試驗結果如圖2所示（僅選取部分圖片），在試驗菌株與對照菌株菌絲相交界處，菌絲生長不相互滲透，呈現(xiàn)向上隆起的現(xiàn)象，從而形成明顯的拮抗線。如圖2所示為菌株拮抗呈陽性的圖片。

2.3.2 復篩

2.3.2.1 菌絲生長速度試驗 選取初篩得到的菌株（即拮抗試驗呈陽性的菌株）156株，與對照菌株進行菌絲生長速度試驗和搖瓶液體發(fā)酵試驗。其結果如表3、表4所示（由于試驗數(shù)據(jù)過多，僅列出部分試驗數(shù)據(jù)）。

由表3可見不同灰樹花菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長速度約在1.00～2.81 mm/d，其中菌絲生長速度以菌株1、5、7號較快，1號菌株生長速度明顯高于其它菌株，且高于對照菌株；菌絲形態(tài)以菌株1、4以及對照菌株較粗壯，濃白，生長活力較強。菌株5、7、8號菌絲較粗，呈白色；而菌株2、3、6菌絲較細。

表4 搖瓶液體發(fā)酵試驗結果

2.3.2.2 搖瓶液體發(fā)酵試驗 由表4可見，生物量以1、6和8號菌株較高，3和7號菌株較低；胞內多糖含量以1、5、6、7、8號較高，高于對照。菌株搖瓶液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量在0.45～0.77 g/L，以1、6和8號較高，3、7號菌株較低，其中1號和8號菌株分別比對照高出37.5%和25.0%。

2.3.3 酯酶同工酶電泳試驗 試驗初選出有拮抗現(xiàn)象、菌絲較為粗壯，菌絲生長速度及生物量等高于出發(fā)菌株5%以上的菌株28株，與出發(fā)菌株進行酯酶同工酶電泳試驗，驗證試驗菌株與出發(fā)菌株相比是否發(fā)生了變異。部分電泳試驗圖譜如圖3所示。

試驗菌株共計28株，得到不同的譜帶共計10條，試驗菌株中T＜0.9、S＜0.8的菌株有16個，綜合菌絲形態(tài)、菌絲生長速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標，擇優(yōu)選擇6株菌株進行遺傳穩(wěn)定性的驗證 ，其 編 號 為 zygf001，zygf008，zygf041，zygf101，zygf105，zygf154。

圖3 灰樹花菌株酯酶同工酶電泳圖譜

2.4 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗對6株新菌株進行了遺傳性狀穩(wěn)定性的驗證試驗（僅列出部分數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Spss處理），由表5可見，菌株zygf001和zygf008在繼代培養(yǎng)10代后，與初代相比，在菌絲生長速度、液體發(fā)酵菌絲生物量、菌絲胞內多糖含量及產(chǎn)量數(shù)據(jù)不存在顯著變化（P＞0.05），遺傳性狀較穩(wěn)定。而菌株zygf041、zygf101、zygf105和zygf154相應的指標出現(xiàn)明顯下降（P＜0.01），菌株性狀出現(xiàn)一定的退化。

表5 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗結果

菌株zygf001多糖產(chǎn)量高于zygf008，因此試驗最終選擇zygf001號菌株作為灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變篩選的目標菌株，其搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量分別達到了1.15 g/100 mL和0.78 g/L。

3 小結與討論

試驗采用原生質體紫外誘變選育灰樹花多糖高產(chǎn)新菌株，獲得了一株灰樹花新菌株，其在搖瓶液體發(fā)酵試驗中，菌絲體生物量（干計）及胞內多糖產(chǎn)量等指標達到1.15 g/mL和0.78 g/L，分別比出發(fā)菌株提高了40.2%和37.5%，且遺傳性狀穩(wěn)定，為進一步的中試及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了良好的條件，同時誘變出的其它新菌株為灰樹花高產(chǎn)多糖菌株的進一步選育提供了很好的生物材料。

原生質體紫外誘變在灰樹花菌株的選育上獲得了成功，相較于其他誘變育種的方法，本方法具有工藝較為簡單、材料易獲得、對設備要求不高以及試驗過程對人體無毒害等優(yōu)勢。紫外誘變可使生物材料的DNA分子形成嘧啶二聚體，減弱雙鍵間氫鍵的作用，引起DNA雙鏈的結構變形扭曲，影響其復制和轉錄，同時引起堿基顛換、轉換、缺失或移碼，造成突變。從試驗結果來看，原生質體紫外誘變菌株的方法可以完成預期目標，但相應的突變率比較小，試驗工作量較大。

灰樹花多糖的功效受到灰樹花多糖組成成分、分子量分布以及結構等因素影響，而這些與灰樹花品種及培養(yǎng)條件緊密相關，因此有必要對此灰樹花菌株粗多糖開展分離純化、組成成分和結構分析的深入研究；另外灰樹花新菌株的性狀與出發(fā)菌株相比有一定的差異，今后有待于圍繞液體發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及灰樹花多糖提取工藝，在中試和產(chǎn)業(yè)化階段開展進一步的深入研究，提高灰樹花多糖的產(chǎn)量，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。