肖 瀟，何羽童，房 萌，季 君，高致遠(yuǎn)，楊 園，高春芳

甲胎蛋白異質(zhì)體在原發(fā)性肝癌臨床診斷中的應(yīng)用*

肖 瀟，何羽童，房 萌，季 君，高致遠(yuǎn)，楊 園，高春芳

目的通過(guò)臨床大樣本數(shù)據(jù)回顧性分析血清甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）診斷原發(fā)性肝癌（PLC）的價(jià)值。方法2015年1月～2015年12月東方肝膽外科醫(yī)院診治的PLC患者7097例，同期診治的肝硬化（LC）患者122例。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清AFP水平，采用凝集素捕獲微量離心柱法檢測(cè)AFP-L3，將AFP-L3/AFP比值大于10%定義為AFP-L3陽(yáng)性。結(jié)果7097例PLC患者血清AFP水平為61.7（5.4，1226.0）μg/L，顯著高于 122 例 LC 患者的 3.6（2.5,10.95） μg/L（P＜0.05），AFP-L3陽(yáng)性率為 8.2（-，26.1）%，而在肝硬化患者未檢出AFP-L3陽(yáng)性（P＜0.05）；以血清AFP≥20 μg/L或/和AFP-L3≥10%任一陽(yáng)性為截?cái)帱c(diǎn)，診斷PLC的準(zhǔn)確度為63.1%，優(yōu)于AFP（60.3%）和AFP-L3（47.9%）單獨(dú)診斷的結(jié)果；AFP-L3陽(yáng)性率隨著AFP水平的升高而升高；血清AFP陰性的PLC和AFP陽(yáng)性的LC患者AFP-L3陽(yáng)性率分別為39.6%和7.7%，顯著低于血清AFP陽(yáng)性PLC患者的73.7%（P＜0.05）；在2103例具有病理學(xué)診斷的PLC患者，1976例肝細(xì)胞癌（HCC）患者血清AFP水平為50.8（4.8，1015.0）μg/L，6例混合型肝癌患者血清AFP水平為74.9（4.55，39248.3）μg/L，AFP-L3陽(yáng)性率分別為5.3（-，24.6）%和 8.4（-，18.8）%，均顯著高于 121 例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者【2.8（2.2，5.15） μg/L，P＜0.05】和【-（-，-）%，P＜0.05】。結(jié)論大樣本的結(jié)果顯示PLC患者血清AFP和AFP-L3存在較高的陽(yáng)性率，其診斷效能較好。

原發(fā)性肝癌；甲胎蛋白；甲胎蛋白異質(zhì)體；診斷

作者單位：200438上海市 第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）在世界惡性腫瘤中位居第五位[1]，在我國(guó)肝癌病死率更是居于男性惡性腫瘤的首位[2]。該病早期缺乏特異性表現(xiàn)易被漏診，但起病緩慢，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后極差。因此，早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于疾病診斷、治療、預(yù)后都有重要意義[3]。目前，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是檢測(cè)PLC患者的主要血清指標(biāo)，但慢性肝炎，肝硬化（LC）、妊娠期婦女血清AFP也會(huì)升高。所以，其靈敏度和特異度并不十分高[4]。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟疾病往往伴隨多種蛋白的異常糖基化[5]，根據(jù)與小扁豆素（lens culinaris agglutinin，LCA）親和力的不同可將AFP糖蛋白分為L(zhǎng)CA非結(jié)合型AFP-L1、弱結(jié)合型AFP-L2和LCA結(jié)合型AFP-L3。將結(jié)合型AFP-L3稱為AFP異質(zhì)體，后者為一種異常糖基化的AFP，AFP-L3含量不受AFP總含量的影響，不同性別和年齡患者其含量也無(wú)顯著性差異，但與PLC發(fā)生密切相關(guān)，成為新一代具有典型性的腫瘤標(biāo)志物[6]。雖然AFP-L3在臨床已經(jīng)應(yīng)用多年，但其應(yīng)用價(jià)值尚缺循證醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)證據(jù)的支持。本文主要通過(guò)大樣本回顧性分析PLC和LC患者血清AFP和AFP-L3水平變化，特別研究了兩者的相關(guān)性及其在不同病理學(xué)類型PLC患者的水平差異，以期客觀地評(píng)價(jià)AFP-L3在臨床診斷PLC患者方面的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2015年12月本院住院治療的PLC患者7097例，男性6011例，女性1086例；年齡 3～85歲，平均年齡（55.31±11.08）歲。LC患者122例，男86例，女36例；年齡18～85歲，平均年齡（53.93±12.56）歲。PLC的診斷結(jié)合臨床、病理學(xué)檢查、B超、CT、MRI檢查進(jìn)行，符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》修訂的標(biāo)準(zhǔn)，剔除嚴(yán)重腎功能損害和肝臟外惡性腫瘤患者。HCC患者均未經(jīng)過(guò)肝臟外科切除、肝動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融等相關(guān)治療。LC的診斷則經(jīng)臨床資料和影像學(xué)檢查綜合分析。經(jīng)手術(shù)治療具有病理學(xué)診斷的病例2105例，包括HCC 1976例，ICC 121例，混合型肝癌6例，LC2例。

1.2 血清學(xué)測(cè)定 抽取空腹靜脈血3 ml，3000 r/m離心10 min，分離血清，于6小時(shí)內(nèi)完成AFP和AFP-L3檢測(cè)。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清AFP水平（羅氏公司E601，AFP水平參考區(qū)間為0～20μg/L，大于等于20μg/L時(shí)為陽(yáng)性。當(dāng)AFP水平＞1210μg/L時(shí)，經(jīng)稀釋液稀釋后再測(cè)）；利用親和吸附原理檢測(cè)血清AFP-L3（北京熱景生物技術(shù)有限公司）。血清AFP-L3通過(guò)特異性結(jié)合預(yù)裝在親和吸附離心管中的親和介質(zhì)LCA，將洗脫的吸附液再用羅氏E601測(cè)定AFP水平（AFP-L3）以及處理前標(biāo)本的AFP（總AFP）水平，計(jì)算AFP-L3%，計(jì)算公式為AFP-L3%=AFP-L3×2.5/總AFP×100%。依照說(shuō)明書(shū)，當(dāng)AFP-L3%≥10%判定為陽(yáng)性。當(dāng)總AFP＜10μg/L時(shí)，AFP-L3%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）或 M（IQR）表示，分別采用t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)。繪制ROC曲線評(píng)價(jià)AFP和AFP-L3的診斷價(jià)值，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLC和LC患者血清AFP和AFP-L3水平的比較 與LC比，PLC患者血清AFP和AFP-L3水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組血清AFP和AFP-L3【M（IQR）】水平比較

2.2 AFP與AFP-L3在PLC診斷中的效能評(píng)價(jià) 以LC為對(duì)照組，繪制AFP和AFP-L3診斷的ROC曲線，結(jié)果顯示，AFP診斷PLC的ROC曲線下面積為0.763（95%CI 0.730～0.796），AFP-L3 診斷 PLC 的ROC 曲線下面積為 0.747（95%CI 0.718～0.776，圖1）。以血清AFP=20 μg/L為截?cái)帱c(diǎn)，其診斷PLC的靈敏度為60.03%，特異度為78.69%，準(zhǔn)確度為60.34%；以血清AFP-L3=10%為截?cái)帱c(diǎn)，其靈敏度為47.10%，特異度為96.72%，準(zhǔn)確度為47.94%。當(dāng)各自的截?cái)帱c(diǎn)不變，即AFP≥20μg/L或AFP-L3≥10%任一陽(yáng)性時(shí)，兩者聯(lián)合診斷PLC的靈敏度為62.84%，特異度為77.05%，準(zhǔn)確度為63.08%（表2）?？梢?jiàn)，AFP與AFP-L3任一陽(yáng)性即診斷的準(zhǔn)確度優(yōu)于單一指標(biāo)的診斷效能。

2.3 不同血清AFP水平患者血清AFP-L3陽(yáng)性率比較（表 3） 在240例AFP陰性（AFP在10～20μg/L）的PLC患者中，AFP-L3陽(yáng)性200例（39.6%）；在4259例AFP陽(yáng)性（AFP＞20μg/L）的PLC患者中，AFP-L3陽(yáng)性3142例（73.7%），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AFP-L3陽(yáng)性率隨著AFP水平的升高而升高；在96例AFP陰性（AFP在10～20μg/L）的LC患者中，AFP陽(yáng)性率為2.2%，在26例AFP陽(yáng)性（AFP＞20μg/L）的LC患者中，AFP-L3陽(yáng)性2例（7.7%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 具有病理學(xué)診斷結(jié)果的患者血清AFP和AFP-L3水平分析 經(jīng)過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，HCC組與ICC組患者血清AFP水平和AFP-L3陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；混合型肝癌組與ICC組血清AFP水平和AFP-L3陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 4）。

圖1 血清AFP和AFP-L3診斷PLC的ROC曲線分析

表2 血清AFP和AFP-L3診斷PLC患者的效能（%）比較

表3 不同血清AFP水平患者AFP-L3陽(yáng)性率（%）比較

表4 不同類型肝癌患者血清AFP【M（IQR）】和AFP-L3(%）比較

3 討論

雖然原發(fā)性肝癌患者的病死率極高，但近年來(lái)由于治療技術(shù)的提高，其總體生存率也有所提高，但5 a生存率仍不到10%[7]。腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的形成、發(fā)展過(guò)程中會(huì)不斷變化，我們通過(guò)分子生物學(xué)、免疫學(xué)等方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，從而輔助診斷是否患有腫瘤并評(píng)價(jià)患者預(yù)后。臨床上，AFP大于400μg/L常被認(rèn)為高度提示PLC[8]，但數(shù)據(jù)證明病毒性肝炎、LC患者也會(huì)出現(xiàn)AFP水平的升高，干擾了對(duì)PLC的鑒別診斷。研究指出，AFP-L3陽(yáng)性患者比血清AFP水平升高患者發(fā)展成為PLC的可能性更大[9]。我們對(duì)大樣本數(shù)據(jù)經(jīng)分層分析結(jié)果提示，隨著AFP水平的升高AFP-L3陽(yáng)性率也升高，進(jìn)一步證明了AFP-L3輔助AFP診斷PLC的作用。我們的研究報(bào)道與文獻(xiàn)報(bào)道中提示的隨腫瘤臨床分期提高和腫瘤增大AFP-L3陽(yáng)性率也升高[10]相一致。AFP-L3對(duì)HCC療效的監(jiān)測(cè)也有著重要的意義[11]。本組2例LC患者血清AFP在10～20μg/L之間，AFP-L3異質(zhì)體為陽(yáng)性，結(jié)合該2例患者均為失代償期，合并慢性膽囊炎，其中1例經(jīng)MRI檢查提示疑似存在門靜脈栓子。2例患者經(jīng)治療，預(yù)后均差。對(duì)于AFP-L3陽(yáng)性的患者更具有潛在的發(fā)生癌癥的可能，更需注意后期隨訪[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道也稱，AFP-L3＞10%可以作為肝癌的預(yù)警診斷[13]。

目前，ICC已是繼HCC之后第二大原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，約占PLC的5%～10%[14]。我們研究發(fā)現(xiàn)ICC患者AFP陰性者為93.4%（113/121），經(jīng)病例資料查閱后核實(shí)AFP陽(yáng)性的8例ICC患者中有6例術(shù)中查看肝臟存在子灶或門靜脈癌栓，提示具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性和侵襲性。所以，對(duì)于AFP陰性的PLC患者也不能忽視ICC的存在，如果AFP-L3陽(yáng)性更應(yīng)該警惕腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的可能。

AFP是一種由肝臟和卵黃囊合成的單鏈糖蛋白，作為PLC的首選診斷指標(biāo)，仍有20%～40%的患者處于陰性狀態(tài)[15]。血清AFP水平與細(xì)胞AFP的表達(dá)相關(guān)，往往取決于瘤體的大小。因此，有時(shí)候僅憑AFP的檢測(cè)很難區(qū)別肝臟良性疾病與惡性腫瘤。AFP-L3陽(yáng)性的PLC具有快速生長(zhǎng)和早期轉(zhuǎn)移的特征。對(duì)于AFP低水平，特別是微小肝癌患者，檢測(cè)AFP-L3有助于早期診斷。通常，采用植物凝集素結(jié)合能力法對(duì)AFP-L3進(jìn)行分離，然后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法再定量測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)便[16]，但由于受到儀器靈敏度的限制，當(dāng)血清AFP水平小于10μg/L時(shí)，將無(wú)法測(cè)定AFP-L3的比率。本組2333例患者血清AFP水平小于10μg/L而未進(jìn)行AFP-L3測(cè)定，不排除其中存在陽(yáng)性結(jié)果的可能。最新進(jìn)入臨床應(yīng)用的微流控檢測(cè)法已經(jīng)將AFP-L3檢測(cè)的靈敏度提高到血清AFP等于 0.3μg/L[17]，可對(duì)低水平AFP的PLC患者進(jìn)行AFP-L3百分比分析，但目前國(guó)內(nèi)尚缺乏應(yīng)用的大數(shù)據(jù)。對(duì)于低水平AFP患者，這種超敏AFP-L3的檢測(cè)方法是否能補(bǔ)償一些不足尚有待進(jìn)一步證實(shí)。

我國(guó)PLC特別是HCC的發(fā)生與HBV感染相關(guān)。近年來(lái)，隨著乙肝疫苗免疫接種的普及，HBV感染率被有效降低，2006年我國(guó)1～59歲HBV攜帶率為7.18%，2014年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心調(diào)查顯示，1～4歲人群HBV感染率為0.32%，5～14歲感染率為0.94%，15～29歲人群感染率為4.38%[18]，與過(guò)去相比較已明顯下降。而以代謝性異常為代表的非病毒性感染相關(guān)的PLC將逐漸上升，因此也應(yīng)引起重視[19]。ICC的發(fā)生也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[20]。因此，需加強(qiáng)對(duì)于AFP陰性PLC患者腫瘤標(biāo)志物的研究，為輔助臨床早期診斷及隨訪提供幫助。

[1]Chen X，Liu H P，Li M，et al.Advances in non-surgical management ofprimary liver cancer.World J Gastroenterol，2014，20（44）:16630-16638.

[2]楊婉婷，侯恩存.原發(fā)性肝癌治療的研究進(jìn)展.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24（21）:213-215.

[3]Marquardt JU，Andersen JB，Thorgeirsson SS.Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer.Nat Rev Cancer，2015，15（11）:653-667.

[4]Liu X，Chi X，Gong Q，et al.Association of serum level of growth differentiation factor 15 with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.Plos One，2015，10（5）:e0127518.

[5]趙云鵬，高春芳.糖組學(xué)研究在肝病中的應(yīng)用進(jìn)展.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（5）:538-541.

[6]Li D，Mallory T S.AFP-L3:a new generation of tumor marker for hepatocellular carcinoma.Clin Chim Acta，2001，313（1-2）:15-19.

[7]Lok AS，Sterling RK，Everhart JE，et al.Desgamma-carboxy prothrombin and alpha-fetoprotein as biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma.Gastroenterology，2010，138（2）:493-502.

[8]Ma W，Wang H，Teng L.Correlation analysis of preoperative serum alpha-fetoprotein（AFP） level and prognosis of hepatocellular carcinoma（HCC） after hepatectomy.World J Surg Oncol，2013，11（1）:1-7.

[9]Sterling RK，Jeffers L，Gordon F，et al.Clinical utility of AFPL3%measurement in north American patients with HCV-related cirrhosis.Am J Gastroenterol，2007，102（10）:2196-205.

[10]陳燕，林鶯鶯，胡敏華，等.甲胎蛋白異質(zhì)體在肝癌早期診斷和預(yù)警作用研究. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（8）：1652-1654.

[11]陳燕，林鶯鶯，陳巖松，等.AFP-L3在肝細(xì)胞癌早期診斷和療效監(jiān)測(cè)中的價(jià)值.現(xiàn)代免疫學(xué)，2012,24(6）:514-518.

[12]Kobayashi C，Nakanishi Y，Oonishi K，et al.Clinical significance of highly sensitive lens culinaris agglutinin-reactive fraction of AFP at the low range of total AFP concentration.Jap J Med Technol，2014，63:374-378.

[13]王向臣，于傳亭，曲建香，等.甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3鑒別良惡肝病及預(yù)警肝癌的研究.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2011，22（1）：64-66.

[14]Ikai I，Arii S，Okazaki M，et al.Report of the 17th nationwide follow-up survey of primary liver cancer in Japan.Hepatol Res，2007，37（9）:676-691.

[15]Tong MJ，Trieu J.Hepatitis B inactive carriers:Clinical course and outcomes.J Dig Dis，2013，14（6）:311-317.

[16]季君，顧星，高致遠(yuǎn)，等.凝集素捕獲微量離心柱法檢測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用評(píng)價(jià).檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26（4）：256-259.

[17]Kagebayashi C，Yamaguchi I，Akinaga A，et al.Automated immunoassay system for AFP-L3% using on-chip electrokinetic reaction and separation by affinity electrophoresis. Analyt Biochem，2009，388（2）:306-311.

[18]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）.實(shí)用肝臟病雜志，2016，19（3）：Ⅴ-ⅩⅩⅢ.

[19]Wang FS，F(xiàn)an JG，Zhang Z，et al.The global burden of liver disease:the major impact of China.Hepatology，2014，60（6）:2099-108.

[20]張學(xué)秀，王立峰，金磊，等.原發(fā)性膽汁性肝硬化患者發(fā)生肝癌危險(xiǎn)因素的研究進(jìn)展.中華肝臟病雜志，2015，23（2）:142-145.

（收稿：2016-11-20）

（本文編輯：陳從新）

Diagnostic value of serum alpha-fetoprotein and lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein in patients with primary livercancer

XiaoXiao，HeYutong，F(xiàn)angMeng，etal.DepartmentofMedicalLaboratory，Eastern Hepatobiliary Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438，PR China

Objective To retrospectively analyze serum alpha-fetoprotein （AFP） and lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein ratio（AFP-L3%） in the diagnosis of patients with primary liver cancer （PLC）.Methods A cohort of 7097 patients with PLC was recruited in Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital between January 2015 and December 2015.At the same period，122 patients with liver cirrhosis（LC） were enrolled.Serum AFP and AFP-L3 were detected by electrochemiluminescence and lectin microcentrifugalcolunm，respectively.The positivity of AFP-L3 was defined as the ratio of AFP to L3/AFP was higher than 10%.Results Serum AFP level in 7097 patients with PLC was 61.7（5.4，1226.0） μg/L，much higher than 3.6（2.5，10.95） μg/L（P＜0.05） in 122 patients with LC，and the AFP-L3 positivity was 8.2（-，26.1）%，significantly higher than in patients with LC as all were negative in the latter（P＜0.05）；the accuracy in diagnosis of PLC was 63.1%，higher than 60.3%by serum AFP or 47.9%by AFP-L3 alone when either of serum AFP≥20μg/L and/or AFP-L3≥10%as the cut-off-value；the positivity of AFP-L3 increased as serum AFP levels increased；the positivity of AFP-L3 in PLC patients with negative serum AFP and in LC patients with positive serum AFP were 39.6% and 7.7% ，respectively，both significantly lower than 73.7%（P＜0.05） in PLC patients with positive AFP；serum AFP levels and positivities of AFP-L3 were 50.8（4.8，1015.0） μg/L and 5.3（-，24.6）% in 1976 patients with histology-proven hepatocellular carcinoma （HCC），and 74.9（4.55，39248.3）μg/L and 8.4（-，18.8）%in 6 patients with histology-proven mixed hepatoma，both higher than【2.8（2.2，5.15）μg/L，P＜0.05】and【-（-，-）%，P＜0.05】in 121 patients with histologically diagnosed intrahepatic cholangiocarcinoma.Conclusion Our big data confirm again AFP and AFP-L3 have a higher positive rate in PLC，and its diagnostic value is good.

Hepatoma；Alpha-fetoprotein；Lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein；Diagnosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.015

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81301516/81271925）；上海市科委基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：15JC1404100）

肖瀟，女，29歲，大學(xué)本科，技師。主要從事臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)研究。E-mail:hsiao_33@163.com

共同第一作者：何羽童，女，21歲，大學(xué)本科，見(jiàn)習(xí)技師。主要從事臨床分子生物學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)研究。E-mail:derahyt@163.com

高春芳，E-mail:gaocf1115@163.com