張鋒利，田 華，吳潔瓊

貝伐單克隆抗體對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌大鼠的防治作用及其對(duì)肝癌組織VEGF表達(dá)的影響

張鋒利，田 華，吳潔瓊

目的研究抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）單克隆抗體對(duì)二乙基亞硝胺（DEN）所致原發(fā)性肝癌大鼠的干預(yù)作用及其對(duì)肝組織VEGF表達(dá)的影響。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物干預(yù)組。采用聯(lián)合應(yīng)用四氯化碳和DEN法制備原發(fā)性肝癌模型，并給予抗VEGF單克隆抗體腹腔注射干預(yù)，在正常組和模型組則給予等體積生理鹽水注射。連續(xù)干預(yù)12 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取血和肝組織行相關(guān)檢查，采用免疫組化法檢測(cè)肝組織VEGF表達(dá)。結(jié)果藥物干預(yù)組大鼠肝質(zhì)量、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)，癌變率和肝臟指數(shù)分別為（17.51±2.53）g、（6.86±0.82）個(gè)、30%和（4.10±0.79），均明顯低于模型組的【（23.71±3.01）、（21.91±2.75）、100.0%和（5.90±1.01），P＜0.05】；與模型組比，藥物干預(yù)組大鼠血清 AST、ALT和 TBIL水平分別為（101.58±19.83） IU/L、（241.52±36.58）IU/L和（62.93±3.03）μmol/L，均明顯低于模型組（P＜0.05）；病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與模型組比，藥物干預(yù)組動(dòng)物肝組織損傷明顯減輕；免疫組化檢測(cè)結(jié)果則顯示，模型組、正常組和藥物干預(yù)組VEGF相對(duì)表達(dá)量分別為（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81），差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論抗VEGF單克隆抗體對(duì)DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌大鼠具有較好的抑瘤作用，而這種作用可能與其抑制了肝組織VEGF表達(dá)有關(guān)。

原發(fā)性肝癌；二乙基亞硝胺；抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體；大鼠

作者單位：712000 陜西省寶雞市 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（張鋒利，吳潔瓊）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)（田華）

原發(fā)性肝癌是我國(guó)死亡率高居第2位的癌癥，約占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的20%[1，2]。因此，尋求一種肝癌的新型治療方法是臨床亟需攻克的重要課題[3，4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是腫瘤血管生成過程中的關(guān)鍵蛋白之一，對(duì)于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管形成等具有重要的作用，也是目前抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[5，6]。貝伐單克隆抗體是一種新型抗VEGF單克隆抗體，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等均具有良好的治療效果[7]。有部分研究顯示抗VEGF抗體對(duì)肝癌具有一定的治療療效，發(fā)現(xiàn)其與順鉑等化療藥物聯(lián)合用藥對(duì)體外抑制腫瘤活性及對(duì)荷瘤小鼠有治療作用[8]。本研究觀察了抗VEGF單克隆抗體對(duì)二乙基亞硝胺（DEN）所致原發(fā)性肝癌大鼠的抑制作用，期望為臨床應(yīng)用該藥治療肝癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物 87HD型全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀（武漢賽博公司），Olympus 78UI型顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），RXL-01型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)安捷倫公司），X-22r型高速離心機(jī)（德國(guó)EP公司）。抗VEGF單克隆抗體（貝伐，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)98120932），羧甲基纖維素鈉（武漢博士德公司，批號(hào) 20150124），DEN（Sigma 公司，純度＞99%，使用前配成DEN溶液100 mg/L，隔日更換，并避光存放），兔抗VEGF抗體（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)98168127），檢測(cè)血生化指標(biāo)的試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司（批號(hào)分別為2014112309、201412 0987和2014123125）。清潔級(jí)SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量【158.2±19.1）g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2014-0093】。

1.2 原發(fā)性肝癌模型的制備 取30只大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物干預(yù)組。按文獻(xiàn)[10]報(bào)道的方法制備原發(fā)性肝癌模型，給予大豆油配制的50%四氯化碳溶液3 ml·kg-1于大鼠后肢皮下注射，2次/w，連續(xù)4 w。休息2 w，于第5 w開始，給予大鼠飲用95 μg/ml的DEN水溶液，每日新鮮配置，連續(xù)飲用12 w；在正常組大鼠，則在后肢皮下注射等量的大豆油，方法同上；在藥物干預(yù)組大鼠自飲用DEN溶液的同時(shí)即開始給予抗VEGF單克隆抗體1.025 mg·kg-1腹腔注射，qod，在正常組和模型組則給予等體積的生理鹽水注射，連續(xù)干預(yù)12 w。在末次給藥24 h，用乙醚麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈取血4 mL，低溫離心 2 min（3000 r/m），分離血清，于 -80℃冰箱保存待檢。取血完成后，采用放血法處死大鼠，剖開腹腔，剪取肝臟。稱量肝臟質(zhì)量，記錄癌變只數(shù)，表面癌結(jié)節(jié)數(shù)，并計(jì)算癌變率（癌變只數(shù)/總數(shù)×100%）及肝臟指數(shù)（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。取肝組織2塊，1 cm×1 cm×1 cm，以10%甲醛溶液固定，分別用于組織病理學(xué)檢查和免疫組化檢測(cè)。

1.3 血生化指標(biāo)檢測(cè) 常規(guī)進(jìn)行。

1.4 肝組織VEGF檢測(cè) 采用sABC法行免疫組化染色，以DAB顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察到胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者即為陽(yáng)性細(xì)胞，在顯微鏡下每張切片觀察10個(gè)高倍（400×）視野，采用Image-proplus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性染色細(xì)胞進(jìn)行定量分析，取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)；用百分率描述計(jì)數(shù)資料，采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟一般情況比較 與模型組比，正常組和藥物干預(yù)組大鼠肝臟癌變率、肝臟質(zhì)量、表面癌結(jié)節(jié)數(shù)和肝臟指數(shù)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠肝臟一般指標(biāo)（%，±s）比較

表1 各組大鼠肝臟一般指標(biāo)（%，±s）比較

正常組與模型組比，①P＜0.05；藥物干預(yù)組與模型組比，②P＜0.05

?

2.2 各組大鼠肝功能指標(biāo)的比較 藥物干預(yù)組大鼠血清AST、ALT和TBIL水平比模型組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 2）。

表2 各組大鼠肝功能指標(biāo)（n=10，±s）的比較

正常組與模型組比，①P＜0.05；藥物干預(yù)組與模型組比，②P＜0.05

?

2.3 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化的比較 正常組大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)正常，以肝中央靜脈為中心呈放射狀向四周排列，管壁無增厚，門管區(qū)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)正常（圖1A）；模型組大鼠癌細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的分化，癌細(xì)胞異型較為明顯，核仁突出，排列成巢狀（圖1 B）；3只藥物干預(yù)大鼠肝組織出現(xiàn)了癌變，癌細(xì)胞排列呈梁狀，異型較為明顯，核仁較為突出，間質(zhì)少，可見出血（圖1 C）。其余未出現(xiàn)癌變的7只大鼠肝組織內(nèi)存在壞死性肝硬化，可見較寬的纖維間隔和形態(tài)不一的假小葉，肝細(xì)胞不同程度的變性、水腫及壞死（圖1 D）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，400×）A：正常組；B：模型組；C：藥物干預(yù)癌變組；D：藥物干預(yù)未癌變組

2.4 各組大鼠肝組織VEGF表達(dá)情況比較 肝組織VEGF陽(yáng)性呈棕黃色，分布于細(xì)胞核中，呈彌漫性顆粒狀分布。模型組大鼠肝組織VEGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，藥物干預(yù)組呈陽(yáng)性表達(dá)，強(qiáng)度明顯弱于模型組，正常大鼠肝組織偶見VEGF陽(yáng)性細(xì)胞（圖2）。定量分析結(jié)果顯示，模型組、正常組和藥物干預(yù)組VEGF相對(duì)表達(dá)量分別為（35.21±6.92）、（1.00±0.00）和（11.53±3.81），差異顯著（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝組織VEGF表達(dá)情況（sABC，400×）A：正常組；B：模型組；C：藥物干預(yù)癌變組；D：藥物干預(yù)未癌變組

3 討論

肝癌是目前臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一。隨著肝切除術(shù)技術(shù)的迅猛發(fā)展及其他臨床醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，較以往而言肝癌的臨床治療療效已取得了較大的進(jìn)步。但總體來說，肝癌患者長(zhǎng)期生存率仍不容樂觀，還需要對(duì)患者進(jìn)行更系統(tǒng)的優(yōu)化治療[11-13]。VEGF是一種高度特異性的新型促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，由2個(gè)分子質(zhì)量1.7～2.2萬的糖蛋白亞單位所組成，相對(duì)分子質(zhì)量范圍為3.1～4.3萬。該蛋白可通過特異性結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體而發(fā)揮改變細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成及增加血管通透性等生物學(xué)效應(yīng)[14，15]。抗VEGF單克隆抗體是目前全球第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療腫瘤患者的藥物，能發(fā)揮血管生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)VEGF的生物效應(yīng)產(chǎn)生特異性阻斷作用，從而產(chǎn)生腫瘤血管新生抑制作用，延緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[16，17]。迄今為止，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)該藥用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌及晚期非小細(xì)胞肺癌等疾病的治療[18]。近期，抗VEGF單克隆抗體在肝癌中的應(yīng)用亦取得令人鼓舞的結(jié)果，但相關(guān)研究主要為臨床療效觀察。在體外表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞活性，抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)[19，20]。我們應(yīng)用抗VEGF單克隆抗干預(yù)DEN所致原發(fā)性肝癌大鼠，發(fā)現(xiàn)其也具有預(yù)防或抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，或許為將其應(yīng)用于臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究在造模方法上，首先利用氯仿攻擊肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死，促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)及增生，然后采用DEN對(duì)增殖狀態(tài)下的肝細(xì)胞進(jìn)行攻擊，可最大程度地發(fā)揮致癌效果，該方法亦是經(jīng)典原發(fā)性肝癌造模手段之一。結(jié)果顯示本研究模型大鼠均造模成功，亦再次證實(shí)了該方法的可靠性[21]。在藥物干預(yù)組大鼠，癌變率、肝臟質(zhì)量、表面癌結(jié)節(jié)數(shù)及肝臟指數(shù)均低于模型組，病理學(xué)觀察結(jié)果亦顯示，抗VEGF單克隆抗體具有降低DEN誘導(dǎo)大鼠癌癥發(fā)生的作用。此外，藥物干預(yù)大鼠血清ALT和AST等肝功能生化指標(biāo)均明顯低于模型組，提示抗VEGF單克隆抗體可有效緩解DEN所致的肝損傷。本研究采用免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織VEGF強(qiáng)陽(yáng)性，藥物干預(yù)組陽(yáng)性程度減低。定量分析結(jié)果顯示，藥物干預(yù)組肝組織VEGF表達(dá)量明顯低于模型組，提示抗VEGF單克隆抗體可通過抑制原發(fā)性肝癌大鼠VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，最終發(fā)揮其抗癌作用。

盡管本課題結(jié)果較為客觀，但仍存在部分問題。首先，本研究雖根據(jù)藥物說明書選用了準(zhǔn)確的給藥劑量，未對(duì)劑量進(jìn)行調(diào)整，但作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，后期研究中還應(yīng)適當(dāng)改變劑量，用于探討藥物的量效關(guān)系；其次，盡管抗VEGF單克隆抗體的藥物作用機(jī)制較為明確，本研究亦得到了完全吻合的結(jié)果，但其治療效果是否還存在其他的機(jī)制或作用通路，也是值得深入發(fā)掘的一項(xiàng)重要工作，后期還需完善；最后，由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體實(shí)際的差別，本研究結(jié)論是否適合于臨床，還需要進(jìn)行長(zhǎng)期的驗(yàn)證性研究。

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（收稿：2016-10-28）

（本文編輯：陳從新）

Inhibition of tumor growth and vascular endothelial growth factor expression of bevacizumab in rats with diethylnitrosamine-induced hepatic neoplasma

Zhang Fengli，Tian Hua，Wu Jieqiong.Department of Gastroenterology，Second Affiliated Hospital，Shaanxi TCM University，Baoji 712000，Shaanxi Province

Objective To investigate the inhibition of tumor growth and vascular endothelial growth factor（VEGF） expression of bevacizumab in rats with diethylnitrosamine-induced hepatic neoplasma.Methods 30 SD rats were randomly divided into control，modeland bevacizumab-intervened groups.The combination of tetrachloromethane and diethylnitrosamine（DEN）were used to establish liver cancer in rats. The bevacizumab or saline was given intraperitoneally for 12 weeks.The sera and liver tissues were obtained.The liver weights，surface carcinoma nodule numbers，canceration rates and liver index were detected.The VEGF expression was stained immunohistochemically.Results The liver weights，surface carcinoma nodule numbers，canceration rates and liver index were （17.51 ±2.53） g，（6.86 ±0.82），30% and （4.10 ±0.79） in the bevacizumab-intervened group，significantly lower than those in the model group [（23.71 ±3.01），（21.91 ±2.75），100.0% and （5.90 ±1.01），respectively，P ＜0.05]；serum AST，ALT and TBIL levels were （101.58 ±19.83） IU/L，（241.52 ±36.58） IU/L and（62.93±3.03） μmol/L in the bevacizumab-intervened group，significantly lower than those in the model group（P＜0.05）；Liverpathologicalexamination showed thatthe liverinjures，canceration and VEGF expression were alleviated in the bevacizumab-intervened group.Conclusions The application of Bevacizumab has a good inhibitory effect on DEN-induced canceration in rats，which warrants further study.

Hepatoma；Diethylnitrosamine；Bevacizumab；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.014

張鋒利，女，37歲，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師。主要從事肝臟病和功能性胃腸病防治研究。E-mail:zhangfengli197902@163.com

吳潔瓊，E-mail:2962128717@qq.com