梁 亮,張寅斌，昝 瑛，張 揚(yáng) ，張淑群

肝細(xì)胞癌組織miR-139水平及其靶基因功能的生物信息學(xué)分析*

梁 亮,張寅斌，昝 瑛，張 揚(yáng) ，張淑群

作者單位：710004西安市 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科

目的探討肝細(xì)胞癌（HCC）組織miR-139水平及其臨床意義，并對(duì)其潛在的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為miR-139在HCC發(fā)病機(jī)制中的作用研究提供理論基礎(chǔ)。方法通過(guò)分析國(guó)際癌癥和腫瘤基因圖譜（TCGA）HCC數(shù)據(jù)庫(kù)，比較HCC組織與癌旁組織mir-139水平，分析不同臨床和病理學(xué)（TNM）分期腫瘤組織mir-139水平差異及其與患者生存之間的關(guān)系。通過(guò)mirTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲取經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miR-139靶基因，并利用DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-139靶基因進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。結(jié)果HCC組織mir-139水平（143.12±117.55）顯著低于癌旁組織【（486.48±145.18）g，P＜0.01】；隨著TNM分期增加，癌組織mir-139水平呈逐漸下降趨勢(shì)（I期、II期、III期、IV期分別為161±104、124.1±132.5、128±128.5、91.08±77.88，P＜0.01）；癌組織 mir-139 水平與 TNM 分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.2563，P＜0.001）；隨著腫瘤T分期的增加，癌組織mir-139水平呈逐漸下降趨勢(shì)（I期、II期、III期、IV期分別為159.8±101.8、121.3±129.2、135.3±131.5、72.57±48.52，P＜0.01），且腫瘤組織 mir-139 水平與 HCC T 分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.2586，P＜0.001），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）無(wú)顯著性相關(guān)（均P＞0.05）；腫瘤組織mir-139水平與患者生存呈正相關(guān)，將癌組織mir-139水平由低到高分為4個(gè)區(qū)間，其中位生存時(shí)間分別為16.05 m、16.12 m、24.05 m 和24.19 m，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank，P＜0.001）；miR-139靶基因功能主要富集于與啟動(dòng)子結(jié)合、RNA聚合酶II介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳遞等分子功能上，相關(guān)信號(hào)通路主要富集于各種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路傳遞等。結(jié)論HCC組織miR-139水平降低，且與患者臨床分期和生存呈負(fù)相關(guān)。miR-139靶基因功能顯著富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和腫瘤相關(guān)信號(hào)通路傳遞，提示miR-139在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起到潛在的抑癌基因作用，并可能作為新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

肝細(xì)胞癌；miR-139；癌癥和腫瘤基因圖譜；基因?qū)嶓w論

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)居惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，且其發(fā)生率和死亡數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[1，2]。HCC的發(fā)生大多與慢性肝病相關(guān) ，包括病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝等[1]。HCC患者術(shù)后腫瘤的高復(fù)發(fā)率仍是威脅患者長(zhǎng)期生存的主要因素。目前，對(duì)于無(wú)法實(shí)施手術(shù)的晚期HCC患者也尚無(wú)理想的治療方案。因此，對(duì)HCC發(fā)生及復(fù)發(fā)的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找新的治療靶點(diǎn)有著極其重要的臨床和科學(xué)意義。MicroRNA（miRNA）通過(guò)與目標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3，4]。研究表明，多種miRNA在HCC的發(fā)病和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著重要的角色，如 miR-9、miR-21和miR-139等[5-8]，其中miR-139在HCC發(fā)病中主要起到抑癌基因的作用，可以抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7，9-11]。然而，就我們所知，這些研究均為基于細(xì)胞系的體外研究，miR-139在HCC組織中的表達(dá)，以及與臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系尚無(wú)研究成果發(fā)表。因此，本研究通過(guò)分析腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC的病例，比較了HCC組織和癌旁肝組織miR-139水平差異，并進(jìn)一步分析了其水平與腫瘤病理學(xué)分期和患者生存的關(guān)系。本研究還對(duì)miR-139的靶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)性地研究了miR-139在HCC發(fā)病中的可能作用機(jī)制，為探索HCC發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 HCC病例及其癌組織和癌旁組織miR-139水平資料的獲取 自TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載有關(guān)HCC的臨床資料和mir-139水平數(shù)據(jù)（miRNASeq 3級(jí)數(shù)據(jù)）。選擇的數(shù)據(jù)集為L(zhǎng)iver Hepatocellular Carcinoma（LIHC）。截至 2016年4月，該數(shù)據(jù)集包含了377例HCC患者和49例對(duì)照癌旁組織，其中全部377例HCC均有臨床隨訪(fǎng)信息，372例有miRNA數(shù)據(jù)。因此，本研究選擇有miRNA數(shù)據(jù)的372例樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究符合TCGA發(fā)布的發(fā)表指導(dǎo)規(guī)范（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）。

1.2 HCC組織和癌旁組織miR-139水平檢測(cè)的方法 使用AllPrep RNA mini kit（Qiagen）試劑盒，采用TRIzol法提取組織總RNA，包括microRNA。采用Agilent Bioanalyzer檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量，28S/18S比值≥1或RIN≥7的RNA被用于后續(xù)檢測(cè)。采用Illumina hiseq 2000進(jìn)行microRNA測(cè)序法得到miR-139及其他microRNA水平。

1.3 miR-139靶基因的生物信息學(xué)分析 通過(guò)mirTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）獲取經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miR-139的靶基因[12]。應(yīng)用DAVID BioinformaticsResources6.7在線(xiàn)工具（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)miR-139靶基因進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，采用Fisher Exact Test計(jì)算KEGG信號(hào)通路的P值，以P＜0.05為顯著性閾值。應(yīng)用DAVID對(duì)miR-139靶基因進(jìn)行 Gene Ontology（GO）分子功能富集分析，以P＜0.01為顯著性閾值。

1.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，腫瘤組織和癌旁組織miR-139水平的比較采用t檢驗(yàn)，不同病理學(xué)分期和T分期HCC組織miR-139水平采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，miR-139水平與 HCC TNM分期或與T分期間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)腫瘤組織miR-139水平對(duì)患者預(yù)后的影響進(jìn)行單因素回歸分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，應(yīng)用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)（Log-rank test）分析生存率差異，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè) P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織與癌旁組織miR-139水平比較 HCC組織miR-139水平為（143.12±117.55），顯著低于癌旁組織的（486.48±145.18），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖 1）。

圖1 HCC腫瘤組織與癌旁組織miR-139水平比較 HCC腫瘤組織miR-139水平顯著低于癌旁組織（**P＜0.01）

2.2 不同TNM分期腫瘤組織miR-139水平比較 隨著TNM分期增加，癌組織mir-139水平呈逐漸下降趨勢(shì)（I期、II期、III期、IV 期分別為 161±104、124.1 ±132.5、128 ±128.5、91.08 ±77.88，P＜0.01，圖2A）；癌組織mir-139水平與TNM分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.2563，P＜0.001，圖 2B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤T分期的增加，癌組織mir-139水平呈逐漸下降趨勢(shì)（I期、II期、III期、IV 期分別為 159.8±101.8、121.3±129.2、135.3±131.5、72.57±48.52，P＜0.01，圖2C），且腫瘤組織mir-139水平與HCC T分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.2586，P＜0.001，圖 2D），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）無(wú)顯著性相關(guān)（圖2E和圖2F，均 P＞0.05）。

2.4 miR-139靶基因的生物信息學(xué)分析 檢索miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取88個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miR-139靶基因。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，按主要的GO富集度功能分類(lèi)，miR-139靶基因主要參與啟動(dòng)子結(jié)合、RNA聚合酶II介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)等（P＜0.01，表1）；對(duì)靶基因進(jìn)行 KEGG 信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)miR-139靶基因主要涉及的信號(hào)通路主要富集于各種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路傳導(dǎo)等（P＜0.01，表 2）。

圖2 HCC癌組織mir-139水平與TNM分期的相關(guān)性（**P＜0.01）

2.3 腫瘤組織mir-139水平與患者生存的關(guān)系 隨訪(fǎng)所有患者0～120.8個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為19.8個(gè)月。將HCC組織mir-139水平分為4個(gè)區(qū)間（由低到高為Q1～4），并計(jì)算每個(gè)區(qū)間組患者的生存時(shí)間。生存分析結(jié)果顯示，腫瘤組織mir-139水平與患者生存呈正相關(guān)，即腫瘤組織miR-139高水平患者生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于低水平者（中位生存時(shí)間 Q1～Q4分別為 16.05 m、16.12 m、24.05 m 和24.19 m），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank P＜0.01，圖 3）。

圖3 HCC腫瘤組織mir-139水平與HCC患者生存的關(guān)系

表1 實(shí)驗(yàn)證實(shí)的 miR-139靶基因調(diào)節(jié)的GO細(xì)胞功能

表2 實(shí)驗(yàn)證實(shí)的 miR-139靶基因的KEGG信號(hào)通路分析

3 討論

HCC的發(fā)生大多與前期的慢性肝病相關(guān)[13]。70%～85%原發(fā)性肝癌屬于HCC[14]。miRNA作為內(nèi)源性小分子RNA，廣泛參與生物體內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程，如發(fā)育的進(jìn)程、干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及腫瘤發(fā)生等[15，16]。miR-139 在多種腫瘤，包括 HCC，水平下降，造成腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移[17-19]。Qiu et al[7]報(bào)道m(xù)iR-139通過(guò)下調(diào)ZEB1和ZEB2表達(dá)，抑制HCC細(xì)胞上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換、遷移及侵襲。Gu[10]報(bào)道m(xù)iR-139通過(guò)調(diào)節(jié)WNT/TCF-4信號(hào)通路活性，從而抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲。Fan[9]報(bào)道m(xù)iR-139下調(diào)c-Fos，抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Wong[11]報(bào)道 miR-139通過(guò)下調(diào) Rock2，抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。然而，這些研究均為基于細(xì)胞系的體外研究，miR-139在HCC組織水平以及與臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系如何尚不清楚。美國(guó)政府發(fā)起的癌癥和TCGA計(jì)劃，利用大規(guī)模測(cè)序?yàn)橹鞯幕蚪M分析技術(shù)，最終完成了一套完整的與癌癥基因組改變相關(guān)的“圖譜”，為理解癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，包括miRNA水平及患者基本臨床信息等。本研究通過(guò)分析TCGA HCC數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)miR-139在HCC組織水平顯著低于癌旁組織，與細(xì)胞系數(shù)據(jù)相一致。隨著TNM分期增加，HCC癌組織mir-139水平呈逐漸下降趨勢(shì)，且mir-139水平與HCC TNM分期呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤T分期的增加，HCC癌組織mir-139水平呈逐漸下降趨勢(shì)，且腫瘤組織mir-139水平與HCC T分期呈負(fù)相關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）無(wú)顯著性關(guān)系。生存結(jié)果分析顯示，腫瘤組織mir-139水平與患者生存呈正相關(guān)?？傊@些結(jié)果提示miR-139在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起抑制性作用，與細(xì)胞系結(jié)果一致。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和本研究結(jié)果，我們認(rèn)為miR-139在HCC的發(fā)病中起抑癌基因的作用，可能作為HCC新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

正確認(rèn)識(shí)miR-139與靶基因的相互作用，有助于對(duì)miR-139作用機(jī)制的理解。一個(gè)miRNA通常調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，而同一基因也常受多個(gè)miRNA調(diào)控，這種調(diào)控方式導(dǎo)致miRNA功能的研究具有復(fù)雜性。生物信息學(xué)可對(duì)復(fù)雜的信息進(jìn)行分析和處理，較為系統(tǒng)地研究某一miRNA的功能[20]。本研究通過(guò)mirTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲取經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miR-139的靶基因共88個(gè)。對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO功能分析發(fā)現(xiàn)，按主要的功能分類(lèi)，miR-139靶基因主要參與啟動(dòng)子結(jié)合、RNA聚合酶II介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的傳導(dǎo)。對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)miR-139靶基因涉及的信號(hào)通路主要富集于各種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和T細(xì)胞受體信號(hào)通路等。生物信息學(xué)分析的結(jié)果為MiR-139在HCC發(fā)病中的功能提供了潛在的作用機(jī)制和進(jìn)一步研究的理論依據(jù)。

因此，本研究揭示的miR-139在HCC發(fā)展進(jìn)程中的作用及分子機(jī)制將有助于進(jìn)一步了解HCC的發(fā)病機(jī)制，為以miR-139為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的反義核酸類(lèi)藥物治療HCC提供理論依據(jù)。

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（收稿：2017-02-21）

（本文編輯：陳從新）

Implication of miR-139 in hepatocellular carcinoma and bioinformatics analysis of its perimentally validated targets genes

Liang Liang，Zhang Yinbin，Zan Ying，et al. Department of Oncology，Second Affiliated Hospital，Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi Province，China

Objective The aim of this study was to investigate the implication of miR-139 in hepatocellular carcinoma（HCC） and the bioinformatics analysis of its perimentally validated targets genes.Methods By analyzing the data of HCC in The Cancer Genome Atlas（TCGA） database，we compared the miR-139 levels in HCC tissues and its adjacent liver tissues and analyzed the association between miR-139 levels with pathological stages and survivals of patients.We also retrieved the experimentally validated target genes from the mirTarBase database，and the gene ontology（GO） and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were made.Results Levels of miR-139 in HCC tissues（143.12±117.55） was significantly lower than that in adjacent tissues【（486.48±145.18），P＜0.01】；The patients were stratified into 4 groups based on the levels of mir-139 and the median survival in each groups from low to high were 16.05 m，16.12 m，24.05 m and 24.19 m，respectively，and there was a significant difference among differentgroups （Log-rank，P ＜0.001）；Go function analysis revealed that miR-139 targetgenes were mainly regulating binding with promoters and intracellular signaling transduction and KEGG analysis indicated that these genes were mainly involved in cancer-related pathways，B and T cellreceptor signaling and Ras signaling pathway.Conclusion miR-139 levels is down-regulated in HCC and is negatively correlated with pathological stages and survival of patients（both P＜0.05）.Bioinformatics analysis suggest that miR-139 contributes to cancer development mainly through regulating gene transcription and cancer-related signaling pathways.The presentstudy indicatesthatmiR-139 plays an inhibitory role in formation and development of HCC.

Hepatoma；miR-139；The Cancer Genome Atlas；Gene ontology

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.012

陜西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2016JM8126)

梁亮，女，36歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事乳腺腫瘤內(nèi)科治療。E-mail:liangliangsxp@126.com

張淑群，E-mail:zhangshuqun1971@aliyun.com