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(華東理工大學(xué),生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,上海 200237)

紫娟茶提取物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用

趙瑜,周家春,張靖?jìng)?張宛昕,趙黎明*,蔣麗華*

(華東理工大學(xué),生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,上海 200237)

目的:探究紫娟茶提取物是否具有一定潛在的降血壓、降血糖和減肥功效,并分析紫娟茶提取物中茶多酚和花色苷在其中起到的作用。方法:對(duì)紫娟茶進(jìn)行提取,將紫娟茶粗提物(ZTE1)再分離為花色苷的粗提物(ZTE2)與茶多酚的粗提物(ZTE3),將ZTE2進(jìn)一步純化分離出兩種純化花色苷——飛燕草-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(delphinidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN3)和矢車(chē)菊-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(cyanidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN4);分別評(píng)價(jià)ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用,并與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)了AN3和AN4對(duì)三種酶的抑制類型。結(jié)果:ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4對(duì)三種酶均有一定的抑制作用,粗提取物中,ZTE3對(duì)三種酶、ZTE1對(duì)α-淀粉酶和胰脂肪酶、ZTE2對(duì)α-淀粉酶的抑制超過(guò)或相當(dāng)于EGCG的效果,其中ZTE3對(duì)ACE、ZTE2對(duì)α-淀粉酶、ZTE1對(duì)胰脂肪酶的抑制效果最強(qiáng);純化花色苷中,AN3對(duì)α-淀粉酶的抑制效果較好,與EGCG無(wú)顯著性差異,AN3對(duì)三種酶的抑制效果均優(yōu)于AN4;此外,AN3和AN4對(duì)三種酶均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,抑制常數(shù)Ki分別為:0.33、0.37 mmol/L;0.39、0.41 mg/mL;0.22、0.78 mg/mL。結(jié)論:紫娟茶對(duì)高血壓、高血糖和肥胖癥有一定的潛在功效。

紫娟茶提取物,總酚,花色苷,茶多酚,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶,α-淀粉酶,胰脂肪酶

代謝綜合癥,包括高血壓、高血糖、高血脂和肥胖癥等,已經(jīng)在世界各地迅速蔓延,嚴(yán)重威脅了人類的健康。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)是參與維持血管張力過(guò)程中的重要酶[1],抑制這種酶被認(rèn)為是一個(gè)控制高血壓患者血壓的有效治療方法,而ACE抑制模型被證明是一個(gè)有效篩選抗高血壓藥物和功能食品的方法。α-淀粉酶抑制劑可以減緩高血糖或糖尿病患者碳水化合物的消化,導(dǎo)致葡萄糖吸收速度的降低,從而減弱餐后血糖的上升[2]。脂肪酶對(duì)脂肪在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的作用,抑制胰脂肪酶在肥胖治療中一直被作為靶標(biāo)使用[3]。

許多研究已經(jīng)證明,一些天然產(chǎn)物對(duì)高血壓、高血糖和肥胖具有預(yù)防或治療的效果,茶就是其中之一。紫娟茶,山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)茶組植物(Camelliasinensis(L.)O. Kuntze)茶種(Camelliasinensis)中的普洱茶變種(C.sinensisvar.assamica),源于云南大葉群體國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種——勐海大葉茶中單株培育而成[4]。紫娟茶富含多酚成分,特別是茶多酚和花色苷,已被學(xué)者們所關(guān)注。在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室利用高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜(highresolution time of flight mass spectrometry HRTOF-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分離鑒定出紫娟茶中的四種花色苷,分別是飛燕草-3-O-β-半乳糖苷(delphinidin-3-O-β-D-galactoside,AN1)、矢車(chē)菊-3-O-β-半乳糖苷(cyanidin-3-O-β-D-galactoside,AN2)、飛燕草-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(delphinidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN3)和矢車(chē)菊-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(cyanidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN4),后兩種花色苷占到了紫娟茶花色苷總量的75%,并且僅在三種茶樹(shù)品種中發(fā)現(xiàn),被證實(shí)具有良好的清除自由基能力,并且優(yōu)于合成的抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)[5]。

雖然我們對(duì)紫娟茶進(jìn)行了部分研究,但對(duì)它的生理活性,特別是降血壓、降血糖和抗肥胖特性等都還不清楚。本研究提取并量化了紫娟茶中的總酚、花色苷和茶多酚,探究了紫娟茶提取物對(duì)ACE、α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制作用,通過(guò)比較紫娟茶的粗提取物、純化花色苷AN3和AN4、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)對(duì)三種酶的抑制作用,探尋紫娟茶中對(duì)降血壓、降血糖和抗肥胖起重要作用的關(guān)鍵組分。并且針對(duì)AN3和AN4對(duì)三種酶的抑制類型、抑制常數(shù)等也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探討。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紫娟茶葉 市售;Amberlite XAD-7HP大孔吸附樹(shù)脂 美國(guó)羅門(mén)哈斯公司;Silica gel 60 C18樹(shù)脂(45～63 μm) 德國(guó)默克公司;三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA) 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;沒(méi)食子酸(Gallic acid,GA)、(+)-兒茶素(Catechin,C)、(-)-兒茶素沒(méi)食子酸酯(Catechin gallate,CG)、(-)-表兒茶素(Epicatechin,EC)、(-)-表兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)、(-)-表沒(méi)食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、(-)-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)、(-)-沒(méi)食子兒茶素(Gallocatechin,GC)、(-)-沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Gallocatechin gallate,GCG)、矢車(chē)菊-3-O-β-D-葡萄糖苷、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-來(lái)源于兔肺(ACE)(EC 3.4.15.1)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物(N-Benzoyl-Gly-His-Leu,HHL)、豬胰腺α-淀粉酶(EC 3.2.1.1) Sigma-Aldrich(中國(guó))貿(mào)易有限公司;甲醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙腈(HPLC級(jí))、鹽酸(HCl)、三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)、氯化鈉(NaCl)、可溶性淀粉、麥芽糖、月桂酸4-硝基苯酯(4-Nitrophenyl laurate,p-PNL)、醋酸鈉、豬胰腺脂肪酶(EC 3.1.1.3)、聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通X-100) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS) 上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司;氫氧化鈉(NaOH)、酒石酸鉀鈉、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉(Na2SO3)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;其中化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純。

CP214C電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;BT-100SD定時(shí)恒流泵 上海滬西儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;自流柱(Φ25 mm×600 mm) 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;磁力攪拌機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;移液槍 Dragon Lab;超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;島津10A高效液相色譜儀 島津有限公司;FE20精密pH計(jì) 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療機(jī)械五廠;高速離心機(jī) Thermo Fisher;UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫娟茶的提取 紫娟茶提取物(Zijuan tea extract,ZTE)的制備參照實(shí)驗(yàn)室已總結(jié)的方法[5]:利用含0.1%三氟乙酸(TFA)的85%甲醇溶液提取干燥的紫娟茶葉,然后用乙醚和氯仿分別萃取。將濃縮水溶液緩慢滴入已處理好的Amberlite XAD-7HP層析柱中,先用去離子水洗滌,再用含0.1%TFA的100%甲醇溶液洗脫,直至無(wú)有色物質(zhì)洗脫下來(lái)為止,收集甲醇洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,冷凍干燥,得到紫娟茶粗提物(ZTE1)。隨后,將ZTE1粉末用乙酸乙酯萃取,得到不溶物——花色苷的粗提物(ZTE2)和可溶物——茶多酚的粗提物(ZTE3),分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥待用。

1.2.2 花色苷的分離和純化 將ZTE2用5%甲醇溶液溶解后緩慢滴入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的Silica gel 60 C18柱中,依次用0%、10%、20%、30%、40%和50%的甲醇溶液(含0.1% TFA,分別使用1 L洗脫液)進(jìn)行梯度洗脫。得到四段紅色組分,分別定義為AN1、AN2、AN3和AN4,分段回收,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定 分別配制1 mg/mL的ZTE1、ZTE2和ZTE3溶液測(cè)定其總酚含量,總酚的含量利用Folin-Ciocalteu法進(jìn)行測(cè)定[6],結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。

1.2.4 茶多酚的定性和定量測(cè)定 配制不同濃度的GA、C、CG、EC、ECG、EGC、EGCG、GC和GCG的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制備所需濃度梯度后,進(jìn)行HPLC分析,以峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算。定性和定量測(cè)定1 mg/mL的ZTE1、ZTE2和ZTE3溶液中的茶多酚。

1.2.5 花色苷的含量測(cè)定 配制不同濃度的矢車(chē)菊-3-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進(jìn)行HPLC分析,以峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算,結(jié)果以矢車(chē)菊-3-O-β-D-葡萄糖苷當(dāng)量表示。

1.2.6 HPLC-DAD分析 所有樣品,包括ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN1、AN2、AN3、AN4和矢車(chē)菊-3-O-β-D-葡萄糖苷、GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG的標(biāo)準(zhǔn)品,均使用如下檢測(cè)條件:

色譜柱:Inertsil/Wondasil ODS色譜(250 mm×4.6 mm;i.d.:5 μm)；

檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm和520 nm;柱溫:28 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.8 mL/min;

流動(dòng)相條件:流動(dòng)相A:10%乙腈溶液(含0.1% TFA);

流動(dòng)相B:50%乙腈溶液(含0.1% TFA);

梯度洗脫:0～45 min,B相0～75%;45～50 min,B相75%～75%。

每個(gè)樣品進(jìn)樣前需經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜去除雜質(zhì)。

1.2.7 ACE、α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制實(shí)驗(yàn) 紫娟茶提取物ZTE1、ZTE2和ZTE3,純化花色苷AN3和AN4,以及EGCG標(biāo)準(zhǔn)品均被作為三種酶的抑制劑樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AN3和AN4作為花色苷的典型代表,EGCG作為兒茶素的代表,分別進(jìn)行測(cè)試比較。

1.2.7.1 ACE的抑制實(shí)驗(yàn) ACE活性的測(cè)定參照Actis-Goretta等人的方法[7]并稍加改動(dòng),以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物(HHL)作為底物,與ACE反應(yīng)后測(cè)定其生成的馬尿酸含量,生成的馬尿酸通過(guò)比對(duì)馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖來(lái)定性和定量。

色譜條件：色譜柱:WondaSil C18(250 mm×4.6 mm;i.d.:5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):228 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;流速:1 mL/min;流動(dòng)相:超純水(含0.1% TFA)和100%乙腈;洗脫條件:75%/25%(v/v)等度洗脫。

每個(gè)樣品進(jìn)樣前經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜去除雜質(zhì)。

取20 μL ACE溶液(0.1 U/mL),加入100 μL樣品,37 ℃水浴30 min,加入100 μL已預(yù)熱的HHL溶液(5.0 mmol/L),再在37 ℃水浴中反應(yīng)60 min,加入300 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng),過(guò)0.22 μm濾膜,進(jìn)HPLC分析馬尿酸的生成量。以不加樣品作為對(duì)照組,不加樣品和ACE作為空白組。因?yàn)樽暇瓴杼崛∥锞哂蓄伾?對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有影響,因而以加樣品不加ACE作為實(shí)驗(yàn)空白組以除去抑制劑本身顏色可能引起的影響。

表1 ACE抑制率體外測(cè)定方法Table 1 Determination of the inhibition rate of ACE in vitro

樣品對(duì)ACE的抑制率按如下公式計(jì)算:

式(1)

式中:A表示實(shí)驗(yàn)組的峰面積,B表示實(shí)驗(yàn)空白組的峰面積,C表示對(duì)照組的峰面積,D表示空白組的峰面積。

計(jì)算出各樣品的抑制率后,使用半數(shù)抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件——藥物抑制濃度計(jì)算軟件(LOGIT法,版本1.0.0)計(jì)算各樣品對(duì)ACE的半數(shù)抑制濃度。

1.2.7.2 紫娟茶提取物和EGCG對(duì)α-淀粉酶的抑制作用 抑制α-淀粉酶活性的檢測(cè)參照Marcia等人的方法[8]并稍加改動(dòng)。取0.5 mLα-淀粉酶溶液,加入0.5 mL樣品,25 ℃水浴10 min,加入0.5 mL已預(yù)熱10 min的1%淀粉溶液,再在25 ℃水浴中反應(yīng)10 min,加入1 mL DNS顯色劑,沸水浴10 min,迅速流水冷卻,加入15 mL去離子水稀釋,混勻后以緩沖液為參比液,使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在540 nm下測(cè)定其吸光度,制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算麥芽糖的生成量。以不加樣品作為對(duì)照組,不加樣品和α-淀粉酶作為空白組,加樣品不加α-淀粉酶作為實(shí)驗(yàn)空白組。

表2 α-淀粉酶抑制率體外測(cè)定方法Table 2 Determination of the inhibitionrate of α-amylase in vitro

樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算同1.2.7.1。

1.2.7.3 紫娟茶提取物和EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制作用 抑制胰脂肪酶活性的檢測(cè)參照McDougall等人的方法[9]并稍加改動(dòng)。取0.5 mL 胰脂肪酶溶液,加入0.5 mL待測(cè)樣品和3 mL 0.1 mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液,37 ℃水浴10 min后,加入1.5 mL已預(yù)熱10 min的p-PNL溶液,繼續(xù)在37 ℃水浴中反應(yīng)2 h,4 ℃、16000 r/min離心2.5 min后取上清,以緩沖液為參比液,使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400 nm下測(cè)定其吸光度。以不加樣品作為對(duì)照組,不加樣品和胰脂肪酶作為空白組,加樣品不加胰脂肪酶作為實(shí)驗(yàn)空白組。

表3 胰脂肪酶抑制率體外測(cè)定方法Table 3 Determination of the inhibition rate ofpancreatic lipase in vitro

樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算同1.2.7.1。

1.2.8 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、α-淀粉酶和胰脂肪酶的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 紫娟茶中花色苷單體AN3和AN4對(duì)ACE作用的動(dòng)力學(xué)研究 分別配制3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mmol/L的HHL底物溶液,0、0.4、0.6 mg/mL的AN3和0、0.5、1.0 mg/mL的AN4樣品溶液,分別在不同底物濃度和不同樣品濃度的條件下按1.2.7.1的方法僅反應(yīng)10 min即終止,通過(guò)HPLC譜圖測(cè)定ACE的反應(yīng)速率,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweawer-Burk),以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制動(dòng)力學(xué)曲線。AN3和AN4對(duì)ACE的抑制類型可根據(jù)圖來(lái)判斷:直線相交于X軸為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,直線相交于Y軸為競(jìng)爭(zhēng)性抑制,直線相交在象限內(nèi)為混合型抑制,直線平行不相交的則為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。所得直線的縱坐標(biāo)截距為1/Vmax,橫坐標(biāo)截距即為-1/Km。

1.2.8.2 紫娟茶中花色苷單體AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶作用的動(dòng)力學(xué)研究 分別配制0.5%、0.75%、1.0%、1.25%和1.5%的淀粉溶液,0、0.8、1.6 mg/mL的AN3和0、1.2、2.0 mg/mL的AN4樣品溶液作為抑制劑,分別在不同底物濃度和不同抑制劑濃度的條件下按1.2.7.2的方法反應(yīng)5 min即終止,測(cè)定α-淀粉酶的反應(yīng)速率,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweawer-Burk),以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制動(dòng)力學(xué)曲線。同1.2.8.1,根據(jù)圖判斷AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶的抑制類型。

1.2.8.3 紫娟茶中花色苷單體AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶作用的動(dòng)力學(xué)研究 分別配制0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%的p-PNL底物溶液,0、0.4、0.6 mg/mL的AN3和0、0.5、1.0 mg/mL的AN4樣品溶液作為抑制劑,分別在不同底物濃度和不同抑制劑濃度的條件下按1.2.7.3的方法反應(yīng)30 min即終止,測(cè)定胰脂肪酶的反應(yīng)速率,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweawer-Burk),以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制動(dòng)力學(xué)曲線。根據(jù)圖判斷AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制類型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot 10.0作圖,SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較,若方差齊時(shí),采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊,采用Tamhane’s檢驗(yàn),差異顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1紫娟茶提取物中的總酚、茶多酚和花色苷

300 g紫娟茶經(jīng)過(guò)提取后得到31.2 g ZTE1,20 g ZTE1經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到4.3 g ZTE2和14.6 g ZTE3,分別占21.5%和73%。1 mg/mL的ZTE1、ZTE2和ZTE3中總酚含量分別為(1.65±0.27)、(0.74±0.21)和(0.98±0.29) mg/mg(以沒(méi)食子酸為當(dāng)量)。圖1為GA、C、CG、EC、ECG、EGC、EGCG、GC和GCG的混標(biāo)HPLC圖譜,比對(duì)該混標(biāo)圖譜及實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)花色苷的鑒定,得到圖2所示的三種提取物在280 nm和520 nm下的HPLC譜圖。從280 nm的譜圖中可見(jiàn),ZTE1中除了幾種常見(jiàn)的茶多酚外,還有一些其他尚未鑒定的酚類物質(zhì)。

圖1 混標(biāo)高效液相色譜圖(280 nm)Fig.1 The HPLC profile determined at 280 nm

圖2 紫娟茶提取物ZTE1,ZTE2,ZTE3高效液相色譜圖(280 nm和520 nm)Fig.2 The HPLC profile of ZTE1,ZTE2,and ZTE3(determined at 280 nm and 520 nm)

幾種主要的茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表4所示,所有曲線在一定的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到三種紫娟茶提取物中各個(gè)茶多酚的含量如表5所示。ZTE3中的茶多酚總量最多,是ZTE2的7倍多,可知紫娟茶中的茶多酚經(jīng)過(guò)乙酸乙酯的洗滌大多被分配到了ZTE3中。酯型兒茶素(EGCG、ECG、GCG和CG)的總量在三種提取物的茶多酚中各占69%、28%和83%。最重要的茶多酚——EGCG,在ZTE3中的含量是ZTE2中的約20倍,在三種提取物的茶多酚中分別占到了46%、18%和49%;ECG在ZTE3中的含量是ZTE2中的100倍以上;而GCG和CG在ZTE2和ZTE3中差異不大。非酯型兒茶素(C、EC、GC和EGC)的總量在ZTE2((33.15±1.23) mg/g)和ZTE3((57.47±2.56) mg/g)中也有顯著性差異。

表4 茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 4 The calibration curve equations of catechins

注:*:x單位μg;y單位×105。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作已鑒定出ZTE2分離純化后得到的4種紅色組分——AN1、AN2、AN3和AN4分別為飛燕草-3-O-β-半乳糖苷、矢車(chē)菊-3-O-β-半乳糖苷、飛燕草-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷和矢車(chē)菊-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷[5],ZTE1和ZTE2中花色苷總量分別為(5.11±0.13)、(17.12±0.41) mg/g(以矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷為當(dāng)量),ZTE3中未檢出花色苷?？梢?jiàn),紫娟茶中的花色苷經(jīng)過(guò)乙酸乙酯的洗滌已基本完全轉(zhuǎn)移到ZTE2中,這也證實(shí)了M??tt?-Riihinen等人的研究:乙酸乙酯可以有效地分離花色苷和大多數(shù)的兒茶素[10]。

分別觀察通過(guò)1.2.1～1.2.2制備得到的AN3和AN4在280、520 nm的HPLC譜圖(圖3和圖4),二者分別在兩種波長(zhǎng)下的峰型幾乎重合,可得知樣品中無(wú)其他酚類物質(zhì),證明該制備方法可以很好的將AN3和AN4從紫娟茶中分離出來(lái),純度分別達(dá)到96.7%和98.4%。而AN1和AN2在280 nm的HPLC譜圖中,除了在與520 nm的HPLC譜圖相同的保留時(shí)間處出峰外,還有其他雜峰的產(chǎn)生。并且,AN3和AN4占據(jù)了紫娟茶中花色苷總量的約75%[5],因而二者被應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

表5 茶多酚在紫娟茶提取物(ZTE1,ZTE2和ZTE3)中的含量Table 5 The contents of catechins in Zijuan tea extracts(ZTE1,ZTE2,and ZTE3)

圖3 紫娟茶中花色苷單體AN3的高效液相色譜圖Fig.3 The HPLC profile of AN3

圖4 紫娟茶中花色苷單體AN4的高效液相色譜圖Fig.4 The HPLC profile of AN4

2.2ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)ACE酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 對(duì)ACE酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)ACE的抑制效果如圖5所示。三種提取物中,ZTE3對(duì)ACE的抑制效果最強(qiáng),其次是ZTE1,最后是ZTE2。樣品在0.025～0.4 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)ACE的抑制效果隨著濃度的升高而有所增加,在0.4 mg/mL的濃度下,三種提取物對(duì)ACE的抑制效果均超過(guò)了70%,其中ZTE1和ZTE3甚至超過(guò)了90%。

圖5 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)ACE的抑制作用Fig.5 ACE inhibitory activities ofZTE1,ZTE2 and ZTE3

AN3和AN4對(duì)ACE的抑制效果如圖6所示。由圖中可看出,在0.4～1.2 mg/mL的濃度范圍內(nèi),AN3對(duì)ACE的抑制效果明顯強(qiáng)于AN4。在1.2 mg/mL的濃度下,AN4對(duì)ACE的抑制率略高于50%,而AN3對(duì)ACE的抑制率則超過(guò)了80%。

圖6 AN3和AN4對(duì)ACE的抑制作用Fig.6 ACE inhibitory activities of AN3 and AN4

圖7 EGCG對(duì)ACE的抑制作用Fig.7 ACE inhibitory activity of EGCG

EGCG對(duì)ACE的抑制效果如圖7所示。由圖可知,在0.02～0.30 mg/mL的濃度范圍內(nèi),EGCG對(duì)ACE的抑制效果隨著濃度的升高而增強(qiáng)。EGCG對(duì)ACE的抑制效果在濃度為0.02～0.05 mg/mL時(shí)有一顯著升高,而在0.05～0.20 mg/mL抑制效果趨于在平緩中小幅度增加,而在0.30 mg/mL的濃度下,其對(duì)ACE的抑制率已接近90%。Hara等人[11]早在1987年即報(bào)道了EGCG對(duì)ACE的抑制效果在主要的幾種茶多酚中是最強(qiáng)的,所以我們選擇EGCG作為陽(yáng)性對(duì)照,將紫娟茶提取物的ACE抑制效果與EGCG相比較。由圖6和圖7可看出,紫娟茶中的兩種花色苷單體AN3和AN4對(duì)ACE的抑制效果明顯低于EGCG,可知AN3和AN4在紫娟茶的降壓效果中并未起到主要的作用。

紫娟茶提取物和純化花色苷,包括ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4,以及EGCG對(duì)ACE的IC50值如圖8所示。提取物中,ZTE3對(duì)ACE的抑制效果最強(qiáng),ZTE1、EGCG均與其沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),而ZTE2則遜色于二者(p<0.05)。純化花色苷單體AN3和AN4對(duì)ACE的IC50值明顯高于EGCG,尤其是AN4((1.17±0.03) mg/mL),是EGCG((0.04±0.00) mg/mL)的近30倍。提取物ZTE2和單體AN3、AN4對(duì)ACE較弱的抑制效果、含大量茶多酚的ZTE3對(duì)ACE最強(qiáng)的抑制效果表明,紫娟茶的降血壓功效可能由茶多酚引起。

圖8 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)ACE的半數(shù)抑制濃度Fig.8 ACE IC50 of ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4 and EGCG注：標(biāo)注不同字母表示數(shù)據(jù)有顯著差異(p<0.05)，圖12、圖18同。

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制雙倒數(shù)曲線圖(Lineweaver-Burk)。如圖9和圖10所示,由直線分別相交于X軸負(fù)半軸上——即米氏常數(shù)Km不變,反應(yīng)速率隨著抑制劑濃度的升高而降低——即表觀最大反應(yīng)速率降低可知,紫娟茶提取物中的花色苷AN3和AN4對(duì)ACE的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,即抑制劑、底物能同時(shí)與ACE結(jié)合,但此復(fù)合物不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,AN3和AN4對(duì)ACE的抑制常數(shù)Ki分別為0.33、0.37 mmol/L。抑制常數(shù)Ki也就是酶與抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù),其倒數(shù)1/Ki反映了抑制劑與酶的親和力,Ki值越小,其親和力越大,因此AN3對(duì)ACE的親和力大于AN4可能是AN3的抑制作用強(qiáng)于AN4的原因之一。盡管AN3和AN4的Ki值遠(yuǎn)大于典型的ACE抑制劑型化學(xué)合成降壓藥物——卡托普利的Ki值(1.4 nmol/L)[12],但作為一種天然產(chǎn)物,其效果仍然值得關(guān)注。

圖9 AN3對(duì)ACE的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk of AN3 on ACE

圖10 AN4對(duì)ACE的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.10 Lineweaver-Burk of AN4 on ACE

2.2.2 對(duì)α-淀粉酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究 紫娟茶提取物、純化花色苷和EGCG對(duì)α-淀粉酶的抑制效果如圖11所示。所有樣品的抑制率都隨著濃度的增加而增加。粗提物中,與ZTE1和ZTE3相比,ZTE2展現(xiàn)出明顯優(yōu)于其他樣品的抑制效果(p<0.05)。而純化的花色苷AN3和AN4相比,AN3具有更好的抑制α-淀粉酶的效果。EGCG抑制α-淀粉酶的效果與AN3相當(dāng)。含有主要花色苷的粗提物組分ZTE2具有最強(qiáng)的抑制α-淀粉酶的效果,且單體花色苷AN3的效果與EGCG相當(dāng),可推測(cè)紫娟茶的降血糖功效主要由花色苷引起。

圖11 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.11 α-Amylase inhibitory activities ofZTE1,ZTE2,ZTE3,AN3,AN4 and EGCG

如圖12所示,ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)α-淀粉酶的IC50值分別為(0.89±0.01)、(0.65±0.01)、(1.18±0.03)、(1.57±0.02)、(1.98±0.01)、(1.54±0.01) mg/mL。Hara等人研究了茶多酚抑制人體唾液α-淀粉酶,其中EGCG的IC50為260 μmol/L(0.12 mg/mL)[13];Matsui等人研究了一些花色苷對(duì)人體唾液α-淀粉酶的抑制作用[14]。二者同本實(shí)驗(yàn)一樣,均使用淀粉作為反應(yīng)底物。而Tadera等人使用一種合成底物——BPNPG7進(jìn)行反應(yīng),該實(shí)驗(yàn)中EGCG和矢車(chē)菊素對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的抑制作用較弱。但隨后他們又使用水溶性淀粉作為底物探討EGCG和矢車(chē)菊素對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的抑制效果,結(jié)果顯示EGCG和矢車(chē)菊素對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的IC50值分別為400、80 μmol/L(0.18、0023 mg/mL)[15]。由此可見(jiàn),不同的檢測(cè)方法中因使用的底物和酶的濃度及用量不同會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Tadera等人證實(shí)的花色苷對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的抑制效果優(yōu)于茶多酚保持一致。

圖12 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)α-淀粉酶的半數(shù)抑制濃度Fig.12 α-Amylase IC50 ofZTE1,ZTE2,ZTE3,AN3,AN4 and EGCG

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制雙倒數(shù)曲線圖。如圖13和圖14所示,紫娟茶提取物中的花色苷AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶的抑制常數(shù)Ki分別為0.39、0.41 mg/mL。AN3的抑制常數(shù)Ki小于AN4,即AN3對(duì)α-淀粉酶的親和力比AN4大,因此AN3對(duì)α-淀粉酶的親和力大于AN4可能是AN3的抑制作用強(qiáng)于AN4的原因之一。

圖13 AN3對(duì)α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.13 Lineweaver-Burk ofAN3 on α-amylase

圖14 AN4對(duì)α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.14 Lineweaver-Burk of AN4 on α-amylase

2.2.3 對(duì)胰脂肪酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果如圖15所示。從圖中可看出,各樣品在0.2～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)胰脂肪酶的抑制效果隨著濃度的升高而有所增加,然而在不同的濃度下三種粗提物對(duì)胰脂肪酶抑制效果的強(qiáng)弱卻明顯不同——在高濃度(1.0 mg/mL)下,樣品的抑制效果由強(qiáng)到弱依次是ZTE3>ZTE1>ZTE2,而在低濃度(0.2 mg/mL)下,樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制效果的順序完全相反。可看出在此濃度變化范圍內(nèi),ZTE2隨著濃度的降低對(duì)胰脂肪酶抑制效果的降低程度最小,在低濃度下也能維持一定的抑制率。

圖15 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.15 Pancreatic lipase inhibitory activities ofZTE1,ZTE2 and ZTE3

從圖16中可看出兩種紫娟茶花色苷單體AN3和AN4在0.2～1.8 mg/mL的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加對(duì)胰脂肪酶的抑制率有所增加,且AN3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果明顯強(qiáng)于AN4。

圖16 AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.16 Pancreatic lipase inhibitory activities of AN3 and AN4

EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制效果如圖17所示。由圖中可知,EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制效果與濃度存在接近線性的依存性,且其效果明顯強(qiáng)于紫娟茶純化花色苷單體AN3和AN4。

圖17 EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.17 Pancreatic lipase inhibitory activities of EGCG

紫娟茶提取物,包括ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4,以及EGCG對(duì)胰脂肪酶的IC50值如圖18所示。粗提物中,ZTE1對(duì)胰脂肪酶的抑制效果最強(qiáng),ZTE3、EGCG與其均無(wú)顯著性差異(p>0.05),ZTE2的效果最弱(p<0.05)。而純化的花色苷AN4對(duì)胰脂肪酶的IC50值(2.47±0.13)mg/mL明顯高于AN3和EGCG,是EGCG(0.55±0.02)mg/mL的約4.5倍。

圖18 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)胰脂肪酶的半數(shù)抑制濃度Fig.18 Pancreatic lipase IC50 ofZTE1,ZTE2,ZTE3,AN3,AN4 and EGCG

ZTE1和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果略強(qiáng)于EGCG，符合Koo & Noh[16]所研究的綠茶提取物的降脂效果強(qiáng)于單一的EGCG這一結(jié)論。Ikeda等人[17]提出,沒(méi)食子酸酯型兒茶素更有益于膽固醇的吸收,紫娟茶粗提物ZTE1、ZTE2和ZTE3中酯型兒茶素含量的總和分別為(143.22±2.97)、(12.85±2.45)、(278.61±12.01) mg/g,可以為解釋ZTE1和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果提供一定的依據(jù)。

粗提物ZTE1對(duì)胰脂肪酶最強(qiáng)的抑制效果、含大量茶多酚的ZTE3和花色苷單體AN3對(duì)胰脂肪酶較強(qiáng)的抑制效果表明,紫娟茶中的茶多酚和花色苷對(duì)胰脂肪酶的抑制具有一定的協(xié)同作用,其減肥功效由多酚類化合物共同引起,且酯型兒茶素可能具有重大貢獻(xiàn)。

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制雙倒數(shù)曲線圖(Lineweaver-Burk)。如圖19和圖20所示,紫娟茶提取物中的花色苷AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制常數(shù)Ki分別為0.22、0.78 mg/mL。AN3的抑制常數(shù)Ki遠(yuǎn)小于AN4,即AN3對(duì)胰脂肪酶的親和力比AN4大,因此AN3對(duì)胰脂肪酶的親和力大于AN4可能是AN3的抑制作用強(qiáng)于AN4的原因之一。

圖19 AN3對(duì)胰脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.19 Lineweaver-Burk of AN3 on pancreatic lipase

圖20 AN4對(duì)胰脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.20 Lineweaver-Burk of AN4 on pancreatic lipase

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)ACE酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用,證實(shí)了長(zhǎng)期飲用紫娟茶可能具有潛在的降血壓、降血糖和減肥效果。AN3和AN4對(duì)三種酶的抑制作用均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,且均為AN3強(qiáng)于AN4,這可能與它在B環(huán)3′、4′、5′位上的三羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)[18]。本研究對(duì)后期探索紫娟茶在體內(nèi)對(duì)代謝綜合癥的影響具有一定的借鑒作用,并對(duì)茶葉的功能性研究具有一定的意義。

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InhibitoryeffectsofZijuantea(Camelliasinensisvar.kitamura)extractsonangiotensinconvertingenzyme,α-amylaseandpancreaticlipaseinvitro

ZHAOYu,ZHOUJia-chun,ZHANGJing-wei,ZHANGWan-xin,ZHAOLi-ming*,JIANGLi-hua*

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,R&D Center of Separation and Extraction Technology inFermentation Industry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Objective:To explore whether the extracts of Zijuan tea has the potential to anti-hypertensive,anti-hyperglycemic and anti-obesity. Methods:The crude polyphenol fraction(defined as ZTE1)was extracted from Zijuan tea. ZTE1was then separated to the precipitated(defined as ZTE2)and the soluble(defined as ZTE3)with ethyl acetate. Subsequently,delphinidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside(AN3)and cyanidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside(AN4)were purified from ZTE2. The inhibitory activities of the three crude fractions and two anthocyanins towards angiotensin converting enzyme(ACE),α-amylase and pancreatic lipase were evaluated comparing with epigallocatechin gallate(EGCG). The inhibitory type of AN3and AN4towards ACE,α-amylase and pancreatic lipase was also explored. Results:All the Zijuan tea extracts had inhibitory activities towards the three enzymes. The inhibitory activities of ZTE3towards the three enzymes,ZTE1towardsα-amylase and pancreatic lipase,ZTE2towardsα-amylase were stronger than EGCG. Furthermore,ZTE3had the highest inhibitory acitivity against ACE,whereas ZTE2and ZTE1had the highest inhibitory acitivity againstα-amylase and pancreatic lipase,respectively. And the inhibitory activity of AN3towardsα-amylase was not significantly different to EGCG. The inhibitory activity of AN3was higher than AN4towards all the three enzymes. In addition,AN3and AN4were noncompetitive inhibitors of ACE,α-amylase and pancreatic lipase withKivalues of 0.33,0.37 mmol/L,0.39,0.41 mg/mL and 0.22,0.78 mg/mL. Conclusion:The extracts of Zijuan tea has the potential to anti-hypertensive,anti-hyperglycemic and anti-obesity.

Zijuan tea extracts;total phenols;anthocyanin;tea polyphenol;angiotensin converting enzyme;α-amylase;pancreatic lipase

TS201.2

A

1002-0306(2017)19-0012-10

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.003

2017-03-08

趙瑜(1989-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的分離提取和應(yīng)用,E-mail：rita_yu_zhao@163.com。

*通訊作者:趙黎明(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工技術(shù),E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn。

蔣麗華(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物的分離提取和應(yīng)用,E-mail：lhjiang@ecust.edu.cn。