胥偉，姜依何，吳丹，趙仁亮，朱旗

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

高通量測(cè)序研究霉變黑毛茶的真菌多樣性

胥偉，姜依何，吳丹，趙仁亮，朱旗*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

為了解高濕條件下霉變黑毛茶的微生物情況，通過(guò)人工促霉培養(yǎng)和Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)研究了黑毛茶霉變過(guò)程的真菌多樣性，并探討了不同OTU（Operational Taxonomic Unit）閾值劃分對(duì)真菌多樣性生物信息學(xué)分析的影響。結(jié)果表明，高濕條件下霉變黑毛茶的真菌分類(lèi)學(xué)地位集中于 2門(mén)（Ascomycot, Basidiomycota）6屬（Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia和Cryptococcus），其中曲霉屬（Aspergillus）真菌相對(duì)豐度值最大，達(dá) 98%以上。不同 OTU閾值劃分水平導(dǎo)致了同一樣本的分類(lèi)學(xué)地位、多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)組成的分析結(jié)果存在差異。相似性0.97水平下的OTU聚類(lèi)真菌群落Shannon多樣性指數(shù)為 0.15～0.43，0.99水平下 Shannon多樣性指數(shù)為 0.28～0.58。曲霉屬（Aspergillus）真菌為高濕條件下導(dǎo)致倉(cāng)儲(chǔ)黑毛茶霉變的優(yōu)勢(shì)真菌種群。

黑毛茶；霉變；真菌多樣性

茶樹(shù)鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆、干燥等 工序制得黑毛茶[1]，渥堆是其品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序[2]，渥堆過(guò)程中，受濕熱和微生物[3-8]的共同作用，茶葉內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化，形成黑毛茶獨(dú)有的品質(zhì)特征。由黑毛茶精制而成的黑茶產(chǎn)品因其良好的減肥降脂及促消化功效[9-11]而深受消費(fèi)者青睞，其年產(chǎn)量不斷增加而成為我國(guó)第二大茶類(lèi)[12]。由于黑毛茶采摘較粗老，加工成的黑毛茶需在存放1～2年才進(jìn)行精制，通過(guò)精制和拼配加工成各種黑茶成品。同時(shí)，銷(xiāo)售后的成品黑茶，民間也有通過(guò)存放以改善其粗澀口感的習(xí)俗。但在黑毛茶倉(cāng)儲(chǔ)或成品黑茶存放過(guò)程中，由于環(huán)境條件的變化，特別是在南方的梅雨季節(jié)，茶葉表面極易滋生霉菌，輕者有風(fēng)霉味，重者失去飲用價(jià)值，甚至產(chǎn)生飲用安全問(wèn)題。生產(chǎn)實(shí)踐中，在高濕條件下，黑毛茶極易因其多孔徑特點(diǎn)而吸濕回潮，導(dǎo)致微生物迅速繁殖而引起霉變[13-14]。為了解黑茶霉變的發(fā)生規(guī)律，在黑毛茶等溫吸濕模型建立的基礎(chǔ)上[15]，人工設(shè)定溫、濕度環(huán)境促進(jìn)霉菌在黑毛茶上的生長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)高濕條件下霉變黑毛茶真菌多樣性的研究，為倉(cāng)儲(chǔ)中的黑毛茶安全評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

湖南內(nèi)銷(xiāo)黑毛茶（2016年 5月產(chǎn)于湖南省桃源縣，水分含量：(10.05±0.20)%；DNA抽提試劑盒（OMEGA-soil DNA Kit, Omega Bio-Tek, USA）；2% agarose gels（biowest agArose, biowest, Espana）；FastPfu Polymerase（FastPfu Polymerase, TransGen, China）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Axygen, USA）；Illumina MiSeq platform（TruSeq? DNA Sample Prep Kit, Illumina, USA）。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-150-HSII恒溫恒濕箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；KL300 LED體式顯微鏡，LEICA； Eppendorf N13462C 移 液 器 ， Eppendorf；ABSON MiFly-6小型離心機(jī)，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5430 R小型離心機(jī)，Eppendorf；Eppendorf 5424R高 速 臺(tái) 式 冷 凍 離 心 機(jī) ， Eppendorf；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，Thermo Fisher Scientific；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀，ABI；Illumina Miseq測(cè)序儀，Illumina；Illumina hiseq測(cè)序儀，Illumina；BioTek ELx800酶標(biāo)儀 ， Biotek； TBS380 微 型 熒 光 計(jì) ，TurnerBioSystems； Covaris M220， Gene Company Limited；QL-901旋渦混合器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R粉碎研磨儀，上海萬(wàn)柏生物科技有限公司。

1.3 促霉處理及保存

稱(chēng)取黑毛茶盛于培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿開(kāi)口，每份培養(yǎng)皿15 g茶樣），分5層，每層15份放置于恒溫恒濕箱，溫度 25℃，相對(duì)濕度 RH 90%。人工培養(yǎng)經(jīng)體式顯微鏡鏡檢觀察到有霉菌菌絲存在時(shí)開(kāi)始取樣，隔48 h取1次樣品，共獲得培養(yǎng)至第 3、5、7、9、11、13、15 d的樣品，分層取樣并迅速置于無(wú)菌袋中混合均勻密封保存（樣品編號(hào)分別為：1、2、3、4、5、6、7），－20℃凍存。

1.4 基因組DNA提取

參考葛英亮[16]的方法采用 E.Z.N.A. Soil DNA基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組 DNA的提取，－20℃凍存。電泳檢測(cè)參數(shù)：瓊脂糖凝膠1%，電場(chǎng)強(qiáng)度：5 V·cm-1，時(shí)間30 min。

1.5 18 S rDNA PCR擴(kuò)增

參考Wei Zhang[17]的方法進(jìn)行18 S r DNA PCR擴(kuò)增，參數(shù)調(diào)整如下。

反 應(yīng) 體 系 ： 引 物 ： SSU0817F: 5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3', 1196R: 5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'；5×FastPfu Buffer，4 μL；2.5 mmol·L-1dNTPs，2 μL；Forward Primer (5 mmol·L-1)，0.8 μL； Reverse Primer (5 μmol·L-1)，0.8 μL；FastPfu Polymerase，0.4 μL；BSA，0.2 μL；Template DNA，10 ng；ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃變性3 min；以95℃ 30 s，55℃，30 s，72℃，45 s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72～10℃，10 min。

1.6 Miseq高通量測(cè)序

Illumina MiSeq高通量基因測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.7 測(cè)序數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計(jì)

Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序得到的序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接（merge）成1條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)：過(guò)濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于 20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的read；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接（merge）成 1條序列，最小 overlap長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為 0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為 0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。軟件平臺(tái)：Trimmomatic、FLASH。該工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.8 物種注釋

采用RDP classifier貝葉斯算法[18]分別對(duì)97%和99%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析[19]，并在各個(gè)分類(lèi)學(xué)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。軟件平臺(tái)：Qiime[20]。生物信息學(xué)分析工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.9 多樣性指數(shù)計(jì)算

霉變黑毛茶真菌多樣性指標(biāo)：采用 Chao指數(shù)和 Ace指數(shù)計(jì)算菌群豐富度；采用Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)計(jì)算菌群多樣性；采用 Coverage指數(shù)計(jì)算測(cè)序深度。軟件平臺(tái)：mothur version v.1.30.1[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工促霉培養(yǎng)黑毛茶茶樣鏡檢結(jié)果

采用恒溫恒濕培養(yǎng)的方法模擬高濕條件下的黑毛茶倉(cāng)儲(chǔ)進(jìn)行促霉培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行1次體式顯微觀察，培養(yǎng)至72 h時(shí)，黑毛茶表面在體式顯微鏡下可觀察到霉菌菌絲，表明高濕條件下霉菌菌絲開(kāi)始在黑毛茶表面生長(zhǎng)。體式顯微鏡可觀察到霉菌菌絲在茶葉表面交織生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，霉菌菌絲開(kāi)始特異化形成孢囊梗并產(chǎn)生產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 不同樣品優(yōu)化序列及OTU統(tǒng)計(jì)信息

采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了黑毛茶霉變過(guò)程的真菌種群，通過(guò)對(duì)真菌18 S區(qū)進(jìn)行測(cè)序，設(shè)置不同相似度水平值（0.97，0.99）進(jìn)行歸類(lèi)操作。去除嵌合體和沒(méi)有重復(fù)的單序列，0.97相似水平下7個(gè)樣品共獲得257 471條tags，被歸類(lèi)于7個(gè)OTUs（圖2）。樣品tags數(shù)隨霉變時(shí)間的變化見(jiàn)圖3，平均 tags數(shù)為 36 782±3 858。0.99相似水平下 7個(gè)樣品共獲得 234 122條 tags，被歸類(lèi)于25個(gè)OTUs（圖2），樣品tags數(shù)隨霉變時(shí)間的變化見(jiàn)圖 3，平均 tags數(shù)為 33 446 ±3 844。優(yōu)化后測(cè)序數(shù)據(jù)序列堿基長(zhǎng)度401～420 bp的序列達(dá)262 107條，約占總序列的99.91%。

2.3 霉變黑毛茶的OTU及分類(lèi)學(xué)地位統(tǒng)計(jì)

將通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序所得的序列優(yōu)化后比對(duì)至OTU代表序列，生成OTU表格，優(yōu)選 OTU 序列檢索數(shù)據(jù)庫(kù)https://unite.ut.ee/index.php進(jìn)行分類(lèi)學(xué)地位統(tǒng)計(jì)，分類(lèi)學(xué)地位對(duì)比情況見(jiàn)表1。

圖1 高濕條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的黑毛茶體式顯微鏡檢圖Fig. 1 The Stereomicroscope examination of raw dark tea under high humidity during different culture times

圖2 不同相似水平下不同霉變時(shí)間的OTUs值Fig. 2 The OTUs of different mildew time under different similarity levels

圖3 不同霉變時(shí)間樣品的Tags值Fig. 3 The tags of different mildew times

基于不同相似水平（0.97, 0.99）進(jìn)行歸類(lèi)操作形成的OTU單元存在較大差別，相似水平提高后獲得的總OTU值減少，但OTU種類(lèi)數(shù)增加至3倍左右，有利于真菌種群的分析及多樣性計(jì)算。Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)基于 18 S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)得出分類(lèi)學(xué)地位及多樣性指數(shù)，目前普遍認(rèn)為該方法在 0.97的相似水平下得出的屬水平分類(lèi)學(xué)地位較可靠[16,22-24]。從霉變過(guò)程取得的7個(gè)黑毛茶樣品真菌種群變化不大，基于 0.97相似水平得出的屬水平分類(lèi)學(xué)地位有：曲霉屬（Aspergillus）、地霉屬（Galactomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）；基于0.99相似水平得出的屬水平分類(lèi)學(xué)地位有：曲霉屬（Aspergillus）、甲醇誘導(dǎo)型酵母屬（Ogataea）、畢赤酵母屬（Pichia）、地霉屬（Galactomyces）、隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）。對(duì)比可發(fā)現(xiàn)提高相似水平值后新增加了甲醇誘導(dǎo)型酵母屬（Ogataea）真菌。原因在于此屬物種序列與 0.97水平下注釋出的真菌種群中某個(gè)屬的序列水平相似度很高，不能被區(qū)分。黑毛茶的霉變過(guò)程真菌種群變化不大，并表現(xiàn)出越往后期種群數(shù)量越單一的規(guī)律，這可能與本研究設(shè)置的霉變條件有較大關(guān)系，該霉變條件下某類(lèi)真菌較優(yōu)的適應(yīng)了該環(huán)境而得到生長(zhǎng)繁殖，在與其他物種競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中取得了優(yōu)勢(shì)。

表1 霉變黑毛茶的真菌多樣性分類(lèi)學(xué)地位統(tǒng)計(jì)Table 1 Taxonomic status of the fungi diversity in mildew dark tea

2.4 霉變黑毛茶的Alpha多樣性指數(shù)

通過(guò)Alpha多樣性指數(shù)可以反映各樣品之間微生物群落的豐度和多樣性指數(shù)的差異。Alpha 多樣性指數(shù)的計(jì)算要求測(cè)序深度能夠覆蓋整個(gè)微生物群落。物種觀測(cè)稀釋性曲線[25]表明，觀測(cè)到OTU數(shù)量隨著隨機(jī)抽取的測(cè)序數(shù)量的增加而逐漸呈現(xiàn)水平趨勢(shì)（圖4），表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，其數(shù)據(jù)可以反映樣本真實(shí)多樣性情況。基于不同相似水平（0.97, 0.99）形成的歸類(lèi)操作單元進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖4 不同相似水平下觀測(cè)指數(shù)稀釋性曲線Fig. 4 The morphology microscopic observations of raw dark tea under different similarity levels

表2 霉變黑毛茶真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha community diversity index of gungus in mildew dark tea

Alpha多樣性分析檢驗(yàn)用來(lái)估計(jì)樣品微生物群落的物種豐富度和多樣性，包括 Ace、Chao、Coverage、Shannon、Simpson等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)。Coverage值均高達(dá)0.999以上，表明本次測(cè)序?qū)悠分姓婢母采w率很高，證明選擇測(cè)序深度適合，可以滿(mǎn)足樣品中真菌多樣性分析的需要；Ace指數(shù)和Chao指數(shù)反應(yīng)出霉變過(guò)程真菌群落豐富度較低，Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)則表明黑毛茶霉變過(guò)程真菌多樣性程度較低；同時(shí)提高相似水平值后的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均有所提高，Shannon指數(shù)有所提高，Simpson指數(shù)有所降低。相似水平提高后進(jìn)行歸類(lèi)操作形成的 OTU統(tǒng)計(jì)分析得出的Alpha值與理論值相吻合。多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與分類(lèi)學(xué)地位的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相匹配，表明黑毛茶在高濕條件下的霉變過(guò)程中真菌種群豐度和多樣性指數(shù)都有所降低，可為黑茶的霉變防范、預(yù)測(cè)及安全評(píng)價(jià)提供相關(guān)依據(jù)。

2.5 霉變黑毛茶的真菌群落組成分析

基于不同相似水平（0.97，0.99）形成的歸類(lèi)操作單元進(jìn)行群落組成分析、真菌群落相關(guān)性分析及樣本間相關(guān)性分析，具體統(tǒng)計(jì)見(jiàn)群落組成圖（圖5）、群落Heatmap圖（圖6），真菌群落組成分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3（可注釋分類(lèi)學(xué)地位）及表4（未注釋出分類(lèi)學(xué)地位）。

圖5 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 5 Genus-level community structure of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

圖6 基于屬水平霉變黑毛茶不同相似水平真菌群落Heatmap圖Fig. 6 Genus-level community heatmap of fungus in mildew raw dark tea based on different similar levels

不同相似度水平下的注釋結(jié)果均表明霉變過(guò)程的黑毛茶樣品真菌種群主要為曲霉屬（Aspergillus）真菌，占比達(dá)98%以上，其次為德巴利酵母屬（Debaryomyces）真菌（表3）。0.99相似度水平的物種注釋結(jié)果較 0.97水平下豐富（表3），新增甲醇誘導(dǎo)型酵母屬（Ogataea）（表3）真菌注釋結(jié)果及未能清晰注釋的 Ascomycota unclassified、Eurotiales unclassified和Trichocomaceae unclassified（表4）等3個(gè)屬的真菌。從研究材料考慮，黑毛茶霉變過(guò)程以占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的曲霉屬（Aspergillus）真菌所表征，清晰闡述該屬真菌的具體種類(lèi)及生物學(xué)特性是黑茶倉(cāng)儲(chǔ)及安全評(píng)價(jià)亟待解決的問(wèn)題。從研究方法考慮，基于0.97的相似度水平對(duì)于真菌18 S條帶的物種注釋存在一定的局限性，18 S r DNA為高度保守序列，在進(jìn)化過(guò)程中變異程度低，較難區(qū)分注釋親緣關(guān)系較近的真菌種群分類(lèi)學(xué)地位。

表3 霉變黑毛茶的真菌群落組成（可注釋?zhuān)㏕able 3 The fungal community composition in mildew dark tea (can be noted)

表4 霉變黑毛茶的真菌群落組成（未能注釋?zhuān)㏕able 4 The fungal community composition in mildew dark tea (can not be noted)

黑毛茶霉變過(guò)程真菌多樣性及豐度變化見(jiàn)Heatmap圖（圖6），橫軸樣品為不同霉變時(shí)間的黑毛茶樣品，縱軸顯示各屬真菌種類(lèi)，不同顏色表示各屬真菌在樣品中的豐度，圖上方進(jìn)化樹(shù)表明樣品間的相似程度：0.99相似度水平下的進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析結(jié)果更能還原實(shí)際樣本情況，1號(hào)樣品為一類(lèi)，2、3、4、5、6、7號(hào)樣品為一類(lèi)，表明相似度水平越高，樣本間聚類(lèi)分析結(jié)果更科學(xué)。該進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析表明黑毛茶霉變初期（1～3 d）真菌種群變化迅速，第5天開(kāi)始種群多樣性變化速度減緩，多樣性呈逐漸下降趨勢(shì)，至第15天時(shí)最低，這與Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果相一致。該結(jié)果表明隨著霉變時(shí)間的延長(zhǎng)，適宜室溫高濕條件下的曲霉屬（Aspergillus）真菌得到生長(zhǎng)繁殖，其他類(lèi)真菌種群生長(zhǎng)受到相對(duì)抑制。圖左側(cè)進(jìn)化樹(shù)將曲霉屬（Aspergillus）真菌聚為一類(lèi)，并與其他類(lèi)真菌有較遠(yuǎn)的遺傳距離，在霉變進(jìn)程中屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌種群。在所檢樣品中，許多豐度極低的酵母屬真菌種群亦被檢出，表明高通量測(cè)序技術(shù)能檢測(cè)出樣本中含量極微的真菌種群信息，對(duì)分析種群多樣性有著傳統(tǒng)分析方法無(wú)法比擬的優(yōu)越性。

3 討論

黑茶微生物學(xué)的研究多基于微生物與其品質(zhì)形成機(jī)理的相互關(guān)系開(kāi)展微生物的種群鑒定及功能注釋等方面的研究[3-7]，但鮮見(jiàn)黑茶生霉劣變過(guò)程中的真菌種群多樣性分析及物種注釋。采用高通量測(cè)序技術(shù)直接從樣本中提取微生物基因組總DNA，并對(duì)18 S條帶進(jìn)行特異性擴(kuò)增，解決了不可培養(yǎng)及低豐度真菌在傳統(tǒng)方法中無(wú)法檢出的局限。如形態(tài)學(xué)鑒定法對(duì)貯藏期的黑茶樣本進(jìn)行研究?jī)H發(fā)現(xiàn)黑曲霉（Aspergillus niger）、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）、 產(chǎn) 黃 青 霉 （ Penicillium chrysogenum）、根霉屬（Rhizopus spp.）、木霉屬（Trichoderma spp.）、酵母（分類(lèi)學(xué)地位未知）等真菌種群[26-28]。本方法基于Miseq平臺(tái)測(cè)序技術(shù)，研究了高濕條件下黑茶霉變的主要真菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性特性，不僅了解了黑毛茶霉變過(guò)程中主要真菌種群為曲霉屬（Aspergillus），而且解析出其豐度值高達(dá)98%以上，同時(shí)低豐度的甲醇誘導(dǎo)型酵母屬（Ogataea）、畢赤酵母屬（Pichia）、地霉屬（Galactomyces）、隱球菌屬（Cryptococcus）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）等真菌亦有檢出，這與Abe M等[3]和Xu A等[5]采用DGGE技術(shù)鑒定貯藏期茯磚茶和普洱茶的結(jié)果較一致，但更加全面地揭示出低豐度地霉屬（Galactomyces）、甲醇誘導(dǎo)型酵母屬（Ogataea）、隱球菌屬（Cryptococcus）等真菌種群，表明該研究方法具有傳統(tǒng)鑒定法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，這與陳慶金等[29]的觀點(diǎn)一致。

基于0.97的相似度水平下多樣性 Shannon指數(shù)為 0.15～0.43，Simpson 指數(shù) 0.7449～0.9492；基于 0.99的相似度水平下多樣性Shannon指數(shù)為0.28～0.58，Simpson指數(shù)0.7007～0.9032，該結(jié)果表明曲霉屬（Aspergillus）真菌是黑毛茶霉變過(guò)程中霉菌的優(yōu)勢(shì)菌群。陳建玲等[30]曾報(bào)道了普洱茶在高濕條件下的真菌毒素含量，從食品安全的角度而言，我們需要防范高濕條件下曲霉屬真菌可能產(chǎn)生的真菌毒素給消費(fèi)者帶來(lái)的安全隱患。高濕條件下，曲霉屬真菌代謝繁殖，使之成為黑毛茶霉變過(guò)程的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌種群，并隨著霉變程度的增加使之在真菌菌群多樣性結(jié)構(gòu)中的豐度進(jìn)一步加大。而黑毛茶霉變過(guò)程中霉菌的具體種名及豐度動(dòng)態(tài)變化需要進(jìn)一步研究。

需要留意的是，從我們已進(jìn)行的感官審評(píng)和傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)學(xué)方面的鑒定工作來(lái)看，人工促霉的黑茶樣本和存放環(huán)境不當(dāng)所導(dǎo)致的黑毛茶自然霉變樣本真菌種群存在差異，考慮霉變真菌種群受到樣本所處環(huán)境中的微生物菌群、環(huán)境基質(zhì)及外界條件等共同影響，該部分內(nèi)容將在以后的工作中進(jìn)行系統(tǒng)研究。

基于高通量測(cè)序結(jié)果的物種注釋在 OTU閾值劃分時(shí)需要留意，不同的OTU閾值劃分對(duì)物種的分類(lèi)學(xué)結(jié)果及多樣性指數(shù)會(huì)帶來(lái)一定的影響，特別是對(duì)豐度低的物種和樣本間聚類(lèi)分析進(jìn)行研究時(shí)建議提高相似度水平，有利于同源性高的物種和豐度低的物種注釋出分類(lèi)學(xué)結(jié)果，也有利于樣本間相似度分析時(shí)的結(jié)果更科學(xué)。

[1]齊桂年, 田鴻, 劉愛(ài)玲, 等. 四川黑茶品質(zhì)化學(xué)成分的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2004, 24(4): 266-269.

[2]安徽農(nóng)學(xué)院. 制茶學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 227-230.

[3]Abe M, Takaoka N, Idemoto Y, et al. Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 124(2): 199-203.

[4]Lyu C, Chen C, Ge F, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3165-3174.

[5]Xu A, Wang Y, Wen J, et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 146(1): 14-22.

[6]Zhao M, Xiao W, Ma Y, et al. Structure and dynamics of the bacterial communities in fermentation of the traditional Chinese post-fermented pu-erh tea revealed by 16S rRNA gene clone library [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29(10): 1877-1884.

[7]Zhao M, Zhang DL, Su XQ, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of Pu-erh tea [J]. Scientific Reports, 2015(5): 1-10.

[8]陳棟, 李晶晶, 方祥, 等. 廣東陳香茶后發(fā)酵過(guò)程中主要微生物種群和酶類(lèi)活性變化的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(6): 429-434.

[9]吳香蘭, 劉仲華, 曹丹, 等. 茯磚茶對(duì)小鼠腸道免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究[J]. 茶葉科學(xué), 2013, 33(2): 125-130.

[10]任洪濤, 周斌, 秦太峰, 等. 普洱茶揮發(fā)性成分抗氧化活性研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(3): 213-220.

[11]滕翠琴, 劉仲華, 龔受基, 等. 六堡茶對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(3): 230-238.

[12]梅宇, 王智超, 林璇. 2015年中國(guó)茶葉產(chǎn)銷(xiāo)形勢(shì)分析[J]. 茶世界, 2015(4): 21-30.

[13]HAAS D, PFEIFER B, Reiterich C, et al. Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 166(2): 316-322.

[14]MO HZ, ZHANG H, WU QH, et al. Inhibitory effects of tea extract on aflatoxin production by Aspergillus flavus [J]. Letters in Applied Microbiology, 2013, 56(6): 462-466.

[15]胥偉, 趙仁亮, 姜依何, 等. 湖南黑毛茶等溫吸濕模型建立及霉變安全性研究[J/OL]. 食品科學(xué). http://www.cnki.net/ kcms/detail/11. 2206. TS.20170303. 1431.086.html.

[16]葛英亮, 于水利, 時(shí)文歆, 等. 應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)解析O3-BAC飲用水處理過(guò)程細(xì)菌多樣性變化[J].食品科學(xué), 2016, 37(16): 223-228.

[17]Wei Zhang, Ruijuan Yang, Wenjun Fang, et al. Characterization of thermophilic fungal community associated with pile fermentation of Pu-erh tea [J]. International Journal of Food Microbiology, 2016, 227: 29-33.

[18]WANG Q, GARRITY G M, TIEDJE J M, et al. Naive bayesian classifier for rapid assignment of rrna sequences into the new bacterial taxonomy [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267.

[19]Urmas K? ljalg, R Henrik Nilsson, Kessy Abarenkov, et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi [J]. Molecular Ecology, 2013, 22: 5271-5277.

[20]Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336.

[21]Schloss PD, Gevers D, Westcott SL. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies [J]. PLoS ONE, 2011, 6(12): e27310.

[22]謝萍, 徐明生, 尹仲平, 等. Miseq測(cè)序研究散裝醬鹵鴨肉貯藏期間微生物群落多樣性[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(11): 120-126, 106.

[23]徐帥, 林奕岑, 周夢(mèng)佳, 等. 基于高通量測(cè)定肉雞回腸微生物多樣性及PICRUSt基因預(yù)測(cè)分析[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2016, 28(8): 2581-2588.

[24]曹碧璇, 胡濱, 劉愛(ài)平. 利用16S rRNA基因克隆文庫(kù)分析東北自然發(fā)酵酸菜中細(xì)菌多樣性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(11): 76-80.

[25]Katherine R Amato, Carl J Yeoman, Angela Kent, et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra) gastrointestinal microbiomes [J]. The ISME Journal, 2013, 7(7): 1344-1353.

[26]彭喜春, 于淼. 一款 10年陳熟普洱茶中可培養(yǎng)微生物的分離鑒定[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(15): 196-199.

[27]方祥, 陳棟, 李晶晶, 等. 普洱茶不同貯藏時(shí)期微生物種群的鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(2): 105-108, 160.

[28]鐘濤, 齊桂年, 胥偉, 等. 藏茶貯存過(guò)程中真菌種群的鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(10): 101-103, 106.

[29]陳慶金, 黃麗, 滕建文, 等. 基于 Miseq測(cè)序分析六堡茶陳化初期真菌多樣性[J]. 食品科技, 2015, 40(8): 67-71.

[30]陳建玲, 李文學(xué), 楊光宇, 等. 廣州某茶葉市場(chǎng)普洱茶中多種生物毒素污染現(xiàn)狀調(diào)查[J]. 癌變畸變突變, 2011, 23(1): 68-71.

RNA Sequencing Analysis of Fungi Community Diversity in Mildew Raw Dark Tea

XU Wei, JIANG Yihe, WU Dan, ZHAO Renliang, ZHU Qi*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In order to understand the feature of microbe in the mildew dark tea under high humidity conditions, Illumina Miseq high-throughput sequencing was performed to study fungi diversity by artificial culture of certain fungi. The influence of the OTU (Operational Taxonomic Unit) threshold on the bioinformatic analysis results of fungal diversity was also discussed. The results showed that the mildew dark tea fungus under high humidity conditions were mainly classified into 2 phylum (Ascomycota, Basidiomycota) and 6 genera (Aspergillus, Galactomyces, Ogataea, Debaryomyces, Pichia and Cryptococcus), with the highest abundance value of Aspergillus (＞98%). The different OTU thresholds resulted in the difference in the taxonomic status, diversity index and community structure in the same sample. The Shannon diversity index of OTU under the 0.97 was 0.15-0.43, and the Shannon diversity index under 0.99 was 0.28-0.58. Under high moisture conditions aspergillus was the major fungi causing dark tea mildew in storage.

raw dark tea, mildew, fungi community diversity

TS272.5+4；Q949.32

A

1000-369X（2017）05-483-10

2017-02-28

2017-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31571802）、湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14A066）、湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2016B283）

胥偉，男，博士研究生，主要從事茶葉加工及功能成分化學(xué)研究。*通訊作者：1965994459@qq.com