雷麗萍，朱躍驊，張劍，楊文鴿，李普友，劉艷杰，錢云霞*

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2. 浙江海味鮮海洋科技發(fā)展股份有限公司，浙江 臺州 318000

茶多酚對冰藏大黃魚品質(zhì)及微生物的影響

雷麗萍1，朱躍驊1，張劍1，楊文鴿1，李普友2，劉艷杰1，錢云霞1*

1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2. 浙江海味鮮海洋科技發(fā)展股份有限公司，浙江 臺州 318000

采用生物保鮮劑茶多酚對大黃魚進(jìn)行浸泡處理，研究了大黃魚在冰藏保鮮過程中品質(zhì)及微生物的變化。通過測定感官評分值、菌落總數(shù)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N值）及硫代巴比妥酸值（TBA值），評價(jià)大黃魚在冰藏過程中品質(zhì)變化，同時(shí)采用16 S rDNA克隆文庫及限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)對大黃魚在冰藏條件下的腐敗菌進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在冰藏過程中，茶多酚處理組的菌落總數(shù)、pH值、TVB-N值、TBA值均低于對照組，感官評分值優(yōu)于對照組，大黃魚在冰藏條件下貨架期由12～16 d延長至20～24 d，茶多酚處理組保鮮效果較好。新鮮大黃魚細(xì)菌種類比較豐富，達(dá)15種類型，而腐敗后細(xì)菌種類明顯減少，在腐敗末期，對照組（20 d）的細(xì)菌種類有8種，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）和希瓦氏菌（Shewanella）為主要腐敗菌，所占比例分別為43.7%和39.6%。而茶多酚處理組（24 d）細(xì)菌種類較對照組更少，其腐敗菌主要為假單胞菌屬（Pseudomonas），占細(xì)菌總量的76.8%。

大黃魚；茶多酚；冰藏保鮮；RFLP；腐敗菌

大黃魚（Pseudosciaena crocea）是我國近海重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1]，也是中國特有的地方性魚類，主要分布于黃海南部、東海、臺灣海峽、南海雷州半島以東[2]。其肉質(zhì)鮮嫩，富含蛋白質(zhì)、維生素和無機(jī)質(zhì)等[3]，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。然而，相對于其他肉制品，魚肉極易腐敗變質(zhì)。新鮮魚肉的腐敗主要是因?yàn)槟承┘?xì)菌生長和代謝生成胺、硫化物、醛、酮、酯、有機(jī)酸等，產(chǎn)生不良?xì)馕?，味道劣變，使食品變得感官上不可接受，這些細(xì)菌就是該魚肉的特定腐敗菌（Specific spoilage organism，SSO）[4-6]。一般來說，SSO種類單一，在特定環(huán)境里有較強(qiáng)的忍耐力，在食品貯藏過程中逐步處于優(yōu)勢地位，最終導(dǎo)致食品腐敗。

生物保鮮劑是指從動植物、微生物中提取的天然的或利用生物工程技術(shù)改造獲得的對人體安全的保鮮劑[7]，具有安全、無毒、高效等優(yōu)點(diǎn)，目前已被普遍應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮中，用以延長水產(chǎn)品的保鮮期。茶多酚是茶葉中一類主要的化學(xué)成分，活性成分是以兒茶素為代表的黃烷醇類，由于兒茶素有較強(qiáng)的清除自由基的能力[8]，因此，茶多酚具有較好的抗氧化作用和抑菌作用[9]，已作為主要的生物保鮮劑應(yīng)用于食品的保鮮防腐[10]。

為了抑制大黃魚在貯藏過程中特定腐敗菌的生長，本文用茶多酚浸泡處理大黃魚后進(jìn)行冰藏保鮮，期間定期測定其感官評分值、細(xì)菌總數(shù)、pH值、TVB-N值、TBA值，以評價(jià)茶多酚對大黃魚的冰藏保鮮效果。研究水產(chǎn)品的特定腐敗菌，對水產(chǎn)品的質(zhì)量預(yù)測和延長貨架期特別重要，由于傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)形態(tài)鑒定方法操作繁瑣、準(zhǔn)確性低、耗時(shí)長，而分子生物學(xué)方法可以方便、快捷地獲得菌落指紋和特征核苷酸序列等[11]，故本文采用16 S rDNA克隆文庫和RFLP相結(jié)合的技術(shù)，分析了大黃魚未浸泡及使用茶多酚浸泡后在冰藏條件下的特定腐敗菌，為大黃魚的貯藏保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

大黃魚，由浙江海味鮮海洋科技發(fā)展股份有限公司提供；茶多酚（食品級，淡黃色粉末，95%），購自寧波市鎮(zhèn)海海鑫生物制品有限公司；丙二醛（MDA）測試盒，南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將鮮活大黃魚以碎冰凍死后，無菌超純水清洗，然后置于無菌紗布上瀝干，平行于脊骨將魚肉切分成3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm的魚片，將魚片均勻分成2組。一組用0.20%茶多酚浸泡（TP處理組）[12]，另一組用無菌超純水浸泡（對照組C）；浸泡10 min后，取出，無菌紗布上瀝干后用蒸煮袋包裝[13]，置于碎冰上，于冰箱冷藏室中冰浴貯藏。其間每4 d測定1次化學(xué)成分和微生物含量，并進(jìn)行感官評價(jià)，同時(shí)提取魚肉微生物 DNA。每次隨機(jī)取樣 3組，測平均值。

1.2.2 感官評分

由6人組成專人評定小組，分別從魚片的氣味、色澤和狀態(tài)進(jìn)行評分[14]。按照歐盟1995年感官評定測試方法規(guī)定的9級評分法，感官最高分值為9分，其中：7～9分（不包括9分）為新鮮；6～7分（不包括7分）為感官一級鮮度；4～6分（不包括6分）為感官二級鮮度；小于4分為不新鮮[15]。

1.2.3 細(xì)菌總數(shù)的測定

微生物菌落總數(shù)按照 GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測定》方法[16]，采用平板傾注法計(jì)數(shù)測定。

1.2.4 pH值測定

按GB/T 5009.45—2003酸度計(jì)法[17]，稱取5 g魚肉于燒杯中剪碎，加入45 mL純水，均質(zhì)2 min，靜置，取上清液，測其pH值。

1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定

按SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》方法[18]，使用半微量蒸餾法測定大黃魚肌肉中TVB-N值。

1.2.6 硫代巴比妥酸（TBA值）測定

用丙二醛（MDA）測試盒進(jìn)行測定。

1.2.7 RFLP分析方法

（1）細(xì)菌總DNA提取和16S rDNA的PCR擴(kuò)增

CTAB法提取大黃魚肌肉細(xì)菌總 DNA，具體參考 Shin等[19]的方法。使用細(xì)菌通用上下游引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'）對細(xì)菌總DNA的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增[20]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：4 μL DNA，25 μL primx Taq（TaKaRa公司），上下游引物各1 μL，19 μL H2O。PCR條件：94℃，5 min；94℃，30 s；53℃，45 s；72℃，90 s；30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余用 DNA凝膠回收試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）切膠純化。

（2）16 S rDNA克隆文庫構(gòu)建及RFLP分析

將純化的 16 S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD-18T載體連接后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取50個(gè)陽性克隆子于25%甘油中，置于－80℃低溫冰箱中保存。用pMD-18T載體通用引物M13f/r對這些克隆子進(jìn)行擴(kuò)增，PCR條件：94℃，5 min；94℃，30 s；53℃，45 s；72℃，90 s；循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用Msp Ⅰ（TaKaRa公司）限制性內(nèi)切酶消化（37℃過夜），酶切體系（20 μL）：6 μL PCR產(chǎn)物，2 μL 10×Buffer，2 μL BSA，1 μL Msp Ⅰ，9 μL H2O。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳分析。

（3）測序及序列分析

把不同 RFLP分型的克隆子送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，將測得的16 S rDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行Blast比對。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 Origin 8.5繪圖，SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評分的變化

冰藏過程中大黃魚感官評分值變化見圖1。從圖中可以看出，茶多酚處理組與對照組的感官評分值在整個(gè)冰藏保鮮過程中都呈下降趨勢。在保鮮前期，感官評分差異不大，而從第12天開始，茶多酚處理組和對照組差異顯著（P＜0.05），此時(shí)對照組已降為感官二級鮮度（感官評分值5.6），茶多酚處理組仍在一級鮮度范圍內(nèi)；第16天時(shí)對照組已為感官不新鮮（感官評分值3.8），而茶多酚處理組還屬于感官二級鮮度范圍內(nèi)（感官評分值5.9），直至第20天時(shí)感官評定結(jié)果才為不新鮮?？梢姡瓒喾咏萏幚砜裳泳彺簏S魚在冰藏過程中品質(zhì)的劣變。

2.2 菌落總數(shù)的變化

微生物是導(dǎo)致魚類等水產(chǎn)品腐敗的主要原因，通過測定菌落數(shù)可以判斷魚類的腐敗程度[21]。

參考SC 127—1984標(biāo)準(zhǔn)，新鮮大黃魚的菌落總數(shù)小于 104CFU·g-1為一級品，菌落總數(shù)104～106CFU·g-1為二級品[22]。圖2-A為大黃魚在冰藏過程中菌落總數(shù)的變化趨勢。結(jié)果顯示，茶多酚處理組和對照組菌落數(shù)都隨著冰藏時(shí)間的延長呈上升趨勢，新鮮大黃魚的初始菌落總數(shù)為103.28CFU·g-1，茶多酚處理組和對照組從第8天開始菌落數(shù)差異顯著（P＜0.05），且對照組在第8天菌落總數(shù)大于104CFU·g-1，此時(shí)茶多酚處理組未超過104CFU·g-1；對照組在冰藏第16天時(shí)細(xì)菌總數(shù)已超106CFU·g-1，而茶多酚處理組在第20天才達(dá)106CFU·g-1。分析顯示，由于在大黃魚冰藏保鮮過程中茶多酚浸泡處理有明顯的抑菌作用，所以茶多酚處理組菌落總數(shù)比對照組少且增長較緩慢。

圖1 冰藏過程中大黃魚的感官評分值變化Fig. 1 Changes in sensory evaluation values of Pseudosciaena crocea during iced storage

2.3 pH值的變化

經(jīng)過 0.2%茶多酚浸泡處理，大黃魚冰藏期間pH值的變化如圖2-B所示。從圖中可以看出，在整個(gè)冰藏過程中，茶多酚處理組的pH值都顯著低于對照組（P＜0.05），可能是因?yàn)椴瓒喾泳哂卸喾咏Y(jié)構(gòu)，酚羥基游離出的H+，對降低大黃魚肉的pH起到了一定的作用[23]。同時(shí)，在冰藏前期對照組和茶多酚處理組的pH值呈現(xiàn)降低趨勢，這可能是因?yàn)轸~死后肌肉內(nèi)會進(jìn)行酵解反應(yīng)[24]，但隨著魚肉腐敗，細(xì)菌大量生長繁殖，導(dǎo)致堿性物質(zhì)生成[25]，從冰藏第4天開始，pH又逐漸上升。

2.4 揮發(fā)性鹽基氮的變化

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是指肉類食品在貯藏過程中蛋白質(zhì)在微生物及酶的作用下分解產(chǎn)生氨及胺類等揮發(fā)性的堿性含氮化合物。TVB-N值與水產(chǎn)品的鮮度有較好的相關(guān)性[26]，因而，被用來評價(jià)魚類等水產(chǎn)品的腐敗程度[27]。圖 2-C顯示了大黃魚在冰藏期間TVB-N值的變化情況，在冰藏前期，茶多酚處理組和對照組的差異不顯著；大黃魚最初的TVB-N含量為98 mg·kg-1，而自第8天后，茶多酚處理組TVB-N值的上升速度明顯慢于對照組，且顯著低于對照組（P＜0.05）；第20天時(shí)，對照組的TVB-N值已達(dá)到342.5 mg·kg-1，而茶多酚處理組在保鮮第24天時(shí)TVB-N值才增至 326.2 mg·kg-1，可能是由于茶多酚具有抑菌活性，能減慢微生物的生長繁殖，使蛋白等物質(zhì)的降解緩慢，從而抑制了TVB-N值的增加。

2.5 硫代巴比妥酸的變化

硫代巴比妥酸（TBA）是指動物性油脂中不飽和脂肪酸經(jīng)氧化分解后產(chǎn)生的衍生物如丙二醛（MDA）等與TBA試劑反應(yīng)的結(jié)果。據(jù)Alasalvar等[28]的研究，TBA值可以用來評價(jià)魚類在貯藏過程中質(zhì)量的變化情況。由圖2-D可知，在冰藏期間茶多酚處理組和對照組的TBA值均逐漸上升，但茶多酚處理組保持在較低水平。對照組TBA值在冰藏第20天達(dá)到最大值，0.80 mg·kg-1，此時(shí)，茶多酚處理組TBA值為0.69 mg·kg-1。結(jié)果表明茶多酚處理能夠有效抑制大黃魚冰藏過程中脂肪的氧化，這是因?yàn)椴瓒喾幽苡行宄狙趸^程中產(chǎn)生的自由基，還能結(jié)合氧化酶清除活性氧，螯合金屬離子[29]，所以有較好的抗氧化性，能減緩脂肪的氧化分解。

圖2 冰藏過程中大黃魚肌肉理化指標(biāo)的變化Fig. 2 Changes in the physical and chemical indicators of Pseudosciaena crocea muscle during iced storage

2.6 大黃魚細(xì)菌16 S rDNA克隆文庫的RFLP分析

為突破傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，本研究建立細(xì)菌16 S rDNA克隆文庫，直接在分子水平上進(jìn)行腐敗菌鑒定。對新鮮魚肉和保鮮終點(diǎn)腐敗魚肉（對照組和茶多酚處理組）的細(xì)菌總DNA構(gòu)建了 16 S rDNA基因文庫 L0（冰藏前）、L20（對照組冰藏20 d）、LTP24（茶多酚處理組冰藏24 d），最后各挑取50個(gè)陽性克隆子用Msp I進(jìn)行RFLP分析。從圖3可以看出，L0文庫有15種RFLP分型，表明新鮮大黃魚肉中細(xì)菌種類比較豐富，而 L20文庫只有 8種RFLP分型（圖4），LTP24文庫為7種RFLP分型（圖5）。

2.7 不同RFLP分型的克隆子測序及序列比對分析

圖3 L0文庫RFLP酶切圖譜Fig. 3 RFLP restriction patterns of L0 library

圖4 L20文庫RFLP酶切圖譜Fig. 4 RFLP restriction patterns of L20 library

將各文庫中不同分型的克隆子測序，并將測序得到的16 S rDNA序列用blastn比對NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫，對比后的結(jié)果見表1。由表1可知，L0文庫的細(xì)菌種類較豐富，15種RFLP分型中含量最多的是氣單胞菌屬（Aeromonas sp.），主要為Aeromonas sp.和Uncultured Aeromonas sp.，所占比例為 40%。腐敗末期，對照組樣品（L20）的菌相有 8種，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）和希瓦氏菌（Shewanella）占絕對優(yōu)勢，分別為43.7%和39.6%，認(rèn)為假單胞菌和希瓦氏菌是對照組的特定腐敗菌（SSO）；茶多酚處理組（LTP24）腐敗終點(diǎn)的菌相有7種，假單胞菌屬（Pseudomonas）所占比例最高，為 76.8%，表明假單胞菌屬是茶多酚處理樣的SSO。當(dāng)達(dá)到貨架終點(diǎn)期時(shí)，由于茶多酚的殺菌抑菌作用，茶多酚處理組比對照組菌相單一。因此，大黃魚在冰藏條件下，對照組的SSO是假單胞菌和希瓦氏菌，這與Gram等[5]的研究結(jié)果一致；而茶多酚處理樣的SSO是假單胞菌屬。

圖5 LTP24文庫RFLP 酶切圖譜Fig. 5 RFLP restriction patterns of LTP24 library

3 結(jié)論

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，經(jīng)茶多酚處理后的大黃魚，在冰藏條件下，其感官評分值下降緩慢，魚肉的細(xì)菌總數(shù)、pH值、TVB-N值、TBA值明顯低于對照組，有效延長貨架期4～8 d，該結(jié)果與陳曉眠等[30]對羅非魚冷藏保鮮的研究結(jié)果一致。16 S rDNA克隆文庫及RFLP技術(shù)可以準(zhǔn)確地確定水產(chǎn)品的特定腐敗菌種，研究結(jié)果顯示，新鮮大黃魚肉中細(xì)菌種類豐富；在冰藏末期，對照組未處理樣的優(yōu)勢腐敗菌是假單胞菌和希瓦氏菌；0.2%茶多酚處理樣的特定腐敗菌為假單胞菌屬。這也進(jìn)一步證明了茶多酚對水產(chǎn)品中腐敗菌的生長有較好的抑制作用，進(jìn)而能延長水產(chǎn)品的貨架期。

表1 各RFLP分型所含克隆子數(shù)及16S rDNA序列比對分析Table 1 Comparison of the number of clones and the sequence alignment of 16S rDNA in each RFLP typing

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Effects of Tea Polyphenols on Quality and Microorganisms of Pseudosciaena crocea during Iced Storage

LEI Liping1, ZHU Yuehua1, ZHANG Jian1, YANG Wenge1, LI Puyou2, LIU Yanjie1, QIAN Yunxia1*

1. College of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Zhejiang Haiweixian Marine Sci-tech. Development Co. Ltd, Taizhou 318000, China

The quality and microorganisms changes of large yellow croaker (Pseudosciaena crocea) during iced storage were studied using tea polyphenols as bio-preservatives in this study. The sensory evaluation values, total bacteria, pH value, total volatile base nitrogen (TVB-N value) and thiobarbituric acid (TBA value) were measured to evaluate the quality change of Pseudosciaena crocea. The 16 S rDNA clone library and restriction fragment length polymorphism (RFLP) were used to analyze the spoilage bacteria under iced storage condition. The results indicated that the total bacteria, pH value, TVB-N value and TBA value of the dipping group were significantly lower than those of the control group, and the sensory evaluation values of large yellow croaker were better than that of the control group. The shelf-life of dipping group extended from 12-16 days to 20-24 days at iced storage. So the dipping group had better preservation effect. The bacterial species of fresh pseudosciaen a crocea were abundant, reaching 15 types. And the species of bacteria in the spoilage fish decreased obviously. At the end of spoilage period, there were 8 species of bacteria in the control group (20 d), among which Pseudomonas and Shewanella were the dominant species, occupying 43.7% and 39.6% of the total microorganisms. And bacterial species in tea polyphenol dippingsample (24 d) were less than the control group. The dominant spoilage bacteria of dipping samples was Pseudomonas, taking a percentage of 76.8%.

Pseudosciaena crocea, tea polyphenols, iced storage, RFLP, spoilage organism

Q946.84+1；Q939.1

A

1000-369X(2017)05-523-09

2017-03-31

2017-05-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371793）、臺州市椒江區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.142035）

雷麗萍，女，碩士研究生，主要從事食品加工與安全方面的研究，E-mail：leiliping0810@163.com。*通訊作者：qianyunxia@nbu.edu.cn