王曉林，金龍哲，鐘方麗*，秦杰

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林延吉 133001）

麻椒總黃酮的純化工藝及其抗氧化性研究

王曉林1，金龍哲2，鐘方麗1*，秦杰1

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林延吉 133001）

對麻椒總黃酮的純化工藝條件及其體外抗氧化活性進行了研究。以總黃酮的比吸附量、吸附率及比解吸量、解吸率為考察指標(biāo)，采用單因素實驗對麻椒總黃酮的純化工藝進行考察；采用分光光度法探索了麻椒總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除活性。結(jié)果表明：LSA-21型大孔吸附樹脂對麻椒總黃酮純化的較佳工藝為：控制麻椒提取液總黃酮質(zhì)量濃度0.96 mg／m L左右，然后用石油醚脫脂，脫脂后麻椒提取液的上樣體積與樹脂質(zhì)量之比（m L／mg）為6∶1，吸附流速控制在1.5 m L／min，解吸液p H 8.0的90%乙醇水溶液，解吸流速控制在1.5 m L／min，解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比（m L／mg）為10∶1。在此純化條件下，LSA-21型樹脂對麻椒總黃酮的比吸附量平均為5.248 mg／g、吸附率平均為90.79%，比解吸量平均為5.032 mg／g、解吸率平均為95.88%，干浸膏中總黃酮含量由12.12%提高到36.65%。體外抗氧化活性的研究表明：麻椒總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力較強，均呈現(xiàn)出量效關(guān)系，其清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50分別為0.1946，0.1336 mg／m L。麻椒總黃酮的抗氧化活性與其濃度呈正相關(guān)，具有質(zhì)量濃度依賴性的體外抗氧化活性，其清除自由基能力強于維生素C，表明麻椒總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。研究結(jié)果為麻椒的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

麻椒；總黃酮；大孔吸附樹脂；抗氧化

麻椒是川、貴兩省特產(chǎn)的一種花椒，成熟后為深綠色，其味道比花椒重，氣味芳香，味道麻辣，能夠去除食物的腥味，增加食欲，開胃消食，是一種川菜常用的調(diào)味品。目前關(guān)于麻椒的研究較少，本課題組對麻椒總黃酮的提取與純化工藝開展了相關(guān)實驗研究。黃酮類化合物廣泛分布于天然植物中，是眾多天然植物的活性成分之一，具有抗氧化、提高機體免疫力等多種活性作用，是發(fā)展前景非常廣闊的一類天然抗氧化劑，關(guān)于其抗氧化性能的研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展，目前在食品、制藥等方面已廣泛應(yīng)用［1－4］。大孔吸附樹脂是一種高分子材料，根據(jù)其表面性質(zhì)分為極性、中極性、非極性3種，具有大的比表面積及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對天然植物中的黃酮類活性成分具有優(yōu)良的選擇吸附性能，因此在天然植物總黃酮的純化工藝研究中廣泛應(yīng)用［5，6］。目前，國內(nèi)文獻未見對麻椒總黃酮純化工藝研究的報道。本研究對8種大孔吸附樹脂純化麻椒總黃酮的性能進行了篩選，通過靜態(tài)和動態(tài)實驗對麻椒總黃酮的純化工藝進行了研究，并探索了麻椒總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除活性，為有效開發(fā)利用麻椒總黃酮、提高麻椒的經(jīng)濟效益提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻椒：購于黑龍江北味集團有限公司；蘆丁對照品（供含量測定用）：中國食品藥品檢定研究院；大孔吸附樹脂（ADS-17，XDA-8，LSA-21，LSA-10，AB-8，LX-36，D-101，LSA-33型）：西安藍曉科技新材料股份有限公司；鄰二氮菲（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯三酚、維生素C、硝酸鋁、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等均為市售分析純；水為重蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHA-B型水浴恒溫振蕩器 金壇市科析儀器有限公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XMTD-8222型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FA2004N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及供試品的含量測定

稱取干燥至恒重的蘆丁10 mg，精密稱定，置于50 m L容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.2017 mg／m L的對照品溶液，備用。精密吸取蘆丁對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 m L，置于25 m L容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min［7］。以相應(yīng)試劑為空白，按照分光光度法，在505 nm處測定其吸光度。

精密吸取麻椒提取液、大孔樹脂吸附后的溶液和解吸液各適量，分別置于25 mL容量瓶中。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法顯色，于505 nm處測定上述溶液的吸光度，計算樹脂對麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率及比解吸量、解吸率和浸膏中總黃酮的含量［8］，計算公式如下：

式中：C0為麻椒提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg／m L；C1為大孔樹脂吸附后溶液總黃酮質(zhì)量濃度，mg／m L；C2為解吸液中麻椒總黃酮質(zhì)量濃度，mg／m L；V0為麻椒提取液體積，m L；V1為吸附后液體積，m L；V2為解吸液體積，m L；m0為樹脂的稱樣量，g；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量，mg；m2為解吸液中總黃酮的測定量，mg。

1.3.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

稱取ADS-17，XDA-8，LSA-21，LSA-10，AB-8，LX-36，D-101，LSA-33型大孔吸附樹脂各40 g，根據(jù)參考文獻［9］所述方法進行預(yù)處理，密封備用。

1.3.3 麻椒提取液的制備

稱取干燥的麻椒10 g，加入70%乙醇水溶液500 mL水浴回流提取2次，每次2 h，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.18～1.25（60℃）的稠膏，加蒸餾水定容至250 m L容量瓶中，備用。

1.3.4 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.4.1 靜態(tài)吸附與解吸實驗

稱取8種已預(yù)處理好的濕樹脂各2 g，分別置于具塞錐形瓶中，隨后分別加入麻椒提取液30 m L。在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩2 h，靜置24 h，過濾，然后將過濾后的不同樹脂分別置于具塞錐形瓶中，各加入80%乙醇水溶液50 mL，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩2 h，靜置24 h。分別吸取各樹脂吸附后的溶液、解吸液各適量，加入25 mL容量瓶中，按1.3.1節(jié)方法顯色，于505 nm處測定上述各溶液的吸光度，計算各樹脂對麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率［10］。

1.3.4.2 靜態(tài)平衡吸附特征實驗

稱取1.3.4.1節(jié)實驗中篩選出的對麻椒總黃酮比吸附量、比解吸量較好的3種樹脂（LSA-21，XDA-8，LSA-33）各4 g于100 m L錐形瓶中，加入50 m L總黃酮質(zhì)量濃度為1.8601 mg／m L的麻椒提取液，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩，分別在10，30，60，90，120，180，240，300，360，420，480 min取樣測定上清液的總黃酮質(zhì)量濃度，計算樹脂的比吸附量。然后向吸附480 min后的樹脂中各加入50 m L的80%乙醇水溶液，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩0.5，1，2，3，4，6，8 h，分別吸取解吸液適量，測定解吸液的總黃酮質(zhì)量濃度，計算樹脂的比解吸量［11］。

1.3.5 樹脂的吸附實驗

1.3.5.1 LSA-21型大孔吸附樹脂的吸附等溫線

稱取11份LSA-21型大孔吸附樹脂各4 g，分別置于100 m L錐形瓶中，加入50 m L總黃酮質(zhì)量濃度不同的麻椒提取液，在水浴恒溫振蕩器中室溫振蕩24 h，吸取上清液適量，測定其總黃酮質(zhì)量濃度，計算樹脂的比吸附量。

1.3.5.2 LSA-21型大孔吸附樹脂的泄漏曲線

稱取LSA-21型大孔吸附樹脂15 g，濕法裝柱，加入320 m L總黃酮質(zhì)量濃度為0.96 mg／m L的麻椒提取液，以0.5～1.0 m L／min的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液，每15 m L為1個流份，共21個，測定每個流份的總黃酮質(zhì)量濃度。以流份體積為橫坐標(biāo)，總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線［12］。

1.3.5.3 上樣吸附流速對吸附的影響

吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9634 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 m L／min的流速進行吸附，分別收集流出液，記錄體積，計算比吸附量、吸附率。

1.3.6 樹脂的解吸實驗

1.3.6.1 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸的影響

吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9588 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，控制吸附流速為1.5 m L／min進行吸附，分別收集流出液，記錄體積，計算比吸附量、吸附率。然后分別用0，10%，30%，50%，70%，90%乙醇水溶液50 mL進行解吸，計算比解吸量、解吸率。

1.3.6.2 解吸液解吸流速對解吸的影響

吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9625 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，分別加入到6根15 g的樹脂柱中，按1.3.6.1節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用90%乙醇水溶液分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 m L／min的流速進行解吸，計算比解吸量、解吸率。

1.3.6.3 解吸液p H值對解吸的影響

吸取8份總黃酮質(zhì)量濃度為0.9633 mg／m L的麻椒提取液各90 m L，按1.3.6.1節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用p H值分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的90%乙醇水溶液以1.5 m L／min的流速進行解吸，計算比解吸量、解吸率。

1.3.6.4 解吸液用量的考察

吸取總黃酮質(zhì)量濃度為0.9588 mg／mL的麻椒提取液90 m L，加入到15 g的樹脂柱中，按1.3.6.1節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用p H值為8.0的90%乙醇水溶液以1.5 m L／min的流速進行解吸，每15 mL為1個流份，共收集12個流份，測定每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度，以解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，解吸液體積為橫坐標(biāo)作圖，確定解吸終點。

1.3.7 工藝穩(wěn)定性驗證實驗

稱取3份已預(yù)處理的LSA-21型樹脂各30 g，濕法裝柱，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.9635 mg／m L的麻椒提取液180 mL，按1.3.6.1節(jié)方法進行吸附，計算比吸附量、吸附率。然后用300 mL的90%乙醇水溶液（p H 8.0）以1.5 m L／min的流速進行解吸，計算比解吸量、解吸率。分別吸取麻椒提取液、解吸液各適量，制備純化前及純化后的麻椒干浸膏。稱取干燥至恒重的麻椒干浸膏0.16 g，精密稱定，加60%乙醇40 mL，超聲使其溶解，過濾，濾液置于50 m L容量瓶中，加60%乙醇定容，作為供試品溶液，備用。吸取供試品溶液適量于25 m L容量瓶中，按1.3.1節(jié)測定吸光度，分別計算純化前及純化后的麻椒干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

1.3.8 脫脂及脫脂方法的對比實驗

1.3.8.1 麻椒脫脂

稱取干燥的麻椒適量，加入到圓底燒瓶中，按料液比（g／m L）1∶5加入石油醚（60～90℃），水浴加熱回流2次，每次1 h，過濾，將脫脂后的麻椒放于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于60℃烘干。稱取脫脂后的干燥麻椒，按1.3.3節(jié)方法制備麻椒提取液，然后按1.3.5節(jié)方法實驗，分別計算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率，按1.3.7節(jié)方法測定麻椒干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

1.3.8.2 麻椒提取液脫脂

稱取干燥的麻椒適量，按1.3.3節(jié)方法制備麻椒提取液，然后按提取液與石油醚1∶1配比（m L／m L）加入石油醚脫脂萃取，留取水層備用。吸取經(jīng)石油醚脫脂萃取后的麻椒提取液，按1.3.5節(jié)方法實驗，分別計算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率，按1.3.7節(jié)方法測定麻椒干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

1.3.9 體外抗氧化活性實驗

1.3.9.1 對羥基自由基的清除

分別稱取干燥的麻椒總黃酮干浸膏、維生素C適量，以50%乙醇為溶劑，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg／m L的供試品溶液。分別吸取不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各1.0 m L，分別置于10 m L比色管中，按參考文獻［13］所述方法進行操作，在536 nm處測其吸光度As，Ap，Ab。按照下式計算麻椒總黃酮、維生素C對羥基自由基的清除率：

式中：As為各供試品溶液與（鄰二氮菲＋FeSO4＋H2O2）反應(yīng)后的吸光度值；Ap為蒸餾水代替供試品溶液與（鄰二氮菲＋FeSO4＋H2O2）反應(yīng)后的吸光度值；Ab為蒸餾水代替供試品溶液與（鄰二氮菲＋FeSO4）反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.9.2 對超氧陰離子自由基的清除

分別加入1.3.9.1節(jié)中不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各0.5 mL，分別置于10 mL比色管中，按參考文獻［14］所述方法進行操作，于320 nm波長處測其吸光度A1，A2，A3，按照下式計算麻椒總黃酮、維生素C對超氧陰離子自由基的清除率。

式中：A1為各供試品溶液與鄰苯三酚溶液反應(yīng)后的吸光度值；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚溶液與各供試品溶液反應(yīng)后的吸光度值；A3為鄰苯三酚溶液代替供試品溶液反應(yīng)后的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗中的實驗數(shù)據(jù)采用Origin 6.0軟件進行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 線性關(guān)系考察

以蘆丁對照品溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg／m L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：A＝8.9377C－0.00365，R2＝0.9996。結(jié)果表明蘆丁進樣質(zhì)量濃度在0.004034～0.04841 mg／m L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

2.2.1 靜態(tài)吸附與解吸實驗

通過8種不同型號的大孔樹脂對麻椒總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸情況進行實驗，實驗結(jié)果見表1。

表1 大孔樹脂的選擇實驗結(jié)果Table 1 Experimental results of selection of macroporous resins

由表1可知，在相同實驗條件下，8種大孔樹脂經(jīng)過靜態(tài)吸附與解吸附實驗，比吸附量大于26 mg／g及比解吸量大于22 mg／g的大孔樹脂有3種，分別為LSA-33，LSA-21，XDA-8，通過對各種樹脂吸附和解吸的綜合考慮，選擇LSA-33，LSA-21，XDA-8型大孔樹脂進行吸附動力學(xué)實驗，進一步選擇更加合適的樹脂。

2.2.2 靜態(tài)平衡吸附特征實驗

分別以3種樹脂（LSA-21，XDA-8，LSA-33）的比吸附量、比解吸量為縱坐標(biāo)，以吸附時間、解吸時間為橫坐標(biāo)繪制各樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 總黃酮在3種樹脂上的吸附平衡曲線Fig.1 Time-dependent adsorption rate curves of total flavonoids on three resins

由圖1可知，0～6 h內(nèi)，LSA-21與XDA-8型樹脂對麻椒總黃酮的比吸附量隨著吸附時間的延長而逐漸增加，6 h后比吸附量基本不再增加，達到吸附平衡，LSA-21型樹脂在吸附6 h后的比吸附量為18.365 mg／g，其吸附率為78.81%；XDA-8型樹脂在吸附6 h后的比吸附量為19.155 mg／g，其吸附率為82.38%；LSA-33型樹脂對麻椒總黃酮的比吸附量在0～8 h內(nèi)隨著吸附時間的延長而逐漸增加，其中在0～5 h內(nèi)隨著吸附時間的延長比吸附量增加明顯，在5～7 h內(nèi)隨著吸附時間的延長比吸附量增加緩慢，其比吸附量最大為19.621 mg／g，最高吸附率為84.39%。3種樹脂對麻椒提取液吸附8 h后進行解吸，結(jié)果見圖2。

①見了寶玉，都順墻垂手立住，獨那為首的小廝打千兒，請了一個安，寶玉不識名姓，只微笑點了點頭兒。(第五十二回)

圖2 總黃酮在3種樹脂上的解吸曲線Fig.2 The dynamic desorption curves of total flavonoids on three resins

由圖2可知，3種樹脂對麻椒總黃酮的比解吸量在0～8 h內(nèi)均隨著解吸時間的延長而增加。其中，LSA-21樹脂在解吸4 h后比解吸量增加趨勢緩慢，其8 h的比解吸量最大為16.958 mg／g，解吸率為92.09%；LSA-33與XDA-8型樹脂在0～6 h內(nèi)均隨著解吸時間的延長而提高，解吸6 h后比解吸量增加趨勢不明顯，其8 h的比解吸量分別為15.536，15.871 mg／g，解吸率分別為79.18%，82.10%。綜合考慮3種樹脂對麻椒總黃酮的吸附與解吸，選擇LSA-21型樹脂作為純化麻椒總黃酮的大孔樹脂。

2.3 樹脂的吸附實驗

2.3.1 吸附等溫線

以LSA-21型大孔樹脂的比吸附量為縱坐標(biāo)，麻椒總黃酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制吸附等溫線，結(jié)果見圖3。

圖3 LSA-21樹脂的吸附等溫線Fig.3 The adsorption isotherms of LSA-21

由圖3可知，在麻椒總黃酮的質(zhì)量濃度為0.1～0.96 mg／m L范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加，比吸附量及吸附率均逐漸增加，當(dāng)麻椒總黃酮的質(zhì)量濃度大于0.96 mg／m L時，隨著質(zhì)量濃度的增加比吸附量雖然持續(xù)增加，但吸附率卻開始逐漸下降。因此將0.96 mg／m L作為LSA-21樹脂吸附麻椒總黃酮的有效上樣質(zhì)量濃度。

2.3.2 泄漏曲線

以流份的體積為橫坐標(biāo)，流份中的總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 LSA-21樹脂的吸附泄露曲線Fig.4 The adsorption leakage curve of LSA-21

由圖4可知，隨著麻椒提取液上樣體積的增加，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度也逐漸增加，當(dāng)上樣體積為90 mL時，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度達到0.0963 mg／mL，超過了上樣濃度的10%，結(jié)果表明此時已達到泄漏點，因此確定麻椒提取液的上樣體積與樹脂質(zhì)量之比（m L／mg）為6∶1。

2.3.3 上樣吸附流速對吸附的影響

實驗結(jié)果見表2。

表2 上樣吸附流速的實驗數(shù)據(jù)Table 2 Experimental data of sample adsorption velocity

由表2可知，上樣液的吸附流速越慢，比吸附量、吸附率越高，在吸附速率小于1.5 m L／min范圍內(nèi)，吸附率均大于90%，因為吸附流速越慢，上樣周期就越長，所以綜合考慮，將上樣液吸附流速確定為1.5 mL／min，既保證了上樣時間，又能使麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率較高。

2.4 樹脂的解吸實驗

2.4.1 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸的影響

實驗結(jié)果見表3。

表3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的實驗數(shù)據(jù)Table 3 Experimental data of ethanol volume fraction

由表3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，總黃酮的比解吸量、解吸率不斷升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達到90%時，比解吸量、解吸率分別達到3.137 mg／g，59.79%。所以，選用90%乙醇水溶液作為麻椒總黃酮的解吸液。

2.4.2 解吸液解吸流速對解吸的影響

實驗結(jié)果見表4。

表4 解吸流速的實驗數(shù)據(jù)Table 4 Experimental data of desorption velocity

由表4可知，解吸流速越慢，比解吸量及解吸率越高，解吸性能越好。但如果解吸流速過慢，解吸時間就越長，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。實驗結(jié)果表明解吸流速在0.5～1.5 mL／min范圍內(nèi)時總黃酮的比解吸量、解吸率相對較高。從生產(chǎn)周期及生產(chǎn)成本考慮，將解吸液解吸流速確定為1.5 mL／min。

2.4.3 解吸液p H值對解吸的影響

實驗結(jié)果見表5。

表5 解吸液p H值的實驗數(shù)據(jù)Table 5 Experimental data of p H values of desorption solvent

由表5可知，隨著解吸液p H值的升高，樹脂的比解吸量及解吸率逐漸增大，當(dāng)p H值大于8之后，隨著p H值的繼續(xù)升高，樹脂的比解吸量及解吸率變化較小。所以，將解吸液調(diào)至p H值為8即可。

2.4.4 解吸液用量的考察

以解吸液體積為橫坐標(biāo)，以每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制趨勢圖，結(jié)果見圖5。

圖5 解吸終點Fig.5 Desorption end point

由圖5可知，隨著解吸液用量的增加，解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度不斷降低，當(dāng)解吸液用量為150 mL時，解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度較低，而且變化較小，故用150 mL 90%乙醇水溶液可以將麻椒總黃酮基本解吸完全。因此，解吸液用量為解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比（m L／mg）為10∶1。

2.5 工藝穩(wěn)定性驗證實驗

實驗結(jié)果見表6。

表6 工藝驗證實驗結(jié)果Table 6 Verification test results

由表6可知，經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹脂處理麻椒提取液后，麻椒總黃酮的比吸附量平均為5.248 mg／g、吸附率平均為90.79%，比解吸量平均為5.032 mg／g、解吸率平均為95.88%。干浸膏中總黃酮含量由12.12%提高到31.29%。

2.6 脫脂及脫脂方法的對比實驗

無論是將麻椒先用石油醚脫脂還是制成提取液后脫脂，均可以提高麻椒總黃酮的比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率、干浸膏中總黃酮含量。其中干浸膏中總黃酮含量提高明顯。可能是因為應(yīng)用石油醚處理后，可以除去部分脂溶性物質(zhì)，從而使干浸膏中總黃酮含量有所提高。

2.7 體外抗氧化性實驗

2.7.1 對羥基自由基的清除

實驗結(jié)果見圖6。

圖6 供試品對羥基自由基的清除能力Fig.6 The clearance ratio of test samples to·OH

由圖6可知，隨著麻椒總黃酮及維生素C質(zhì)量濃度的增加，其對羥基自由基的清除率均呈逐漸上升趨勢，其抗氧化能力均逐漸增強，其對羥自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。半數(shù)清除濃度（IC50值）常被用作評價抗氧化劑能力強弱的指標(biāo)，IC50值越小說明供試品的抗氧化能力越強，麻椒總黃酮對羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.2794＋1.1337X，R＝0.9887，IC50值為0.1946 mg／m L；維生素C對羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.1448＋0.4724X，R＝0.9976，IC50值為0.7591 mg／m L。實驗結(jié)果表明：麻椒總黃酮對羥基自由基的清除能力強于陽性對照維生素C，但麻椒總黃酮對羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸性弱于陽性對照維生素C。

2.7.2 對超氧陰離子自由基的清除

實驗結(jié)果見圖7。

圖7 供試品對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.7 The clearance ratio of test samples to·O2－

由圖7可知，麻椒總黃酮及維生素C對超氧陰離子自由基的清除能力較強，均呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，麻椒總黃酮對超氧陰離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.3641＋1.0171X，R＝0.9731，IC50值為0.1336 mg／m L；維生素C對超氧陰離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝0.1464＋1.5554X，R＝0.9598，IC50值為0.2273 mg／mL。實驗結(jié)果表明：麻椒總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力及清除率與質(zhì)量濃度的線性回歸性均強于陽性對照維生素C。

3 結(jié)論

本研究以總黃酮的比吸附量、吸附率和比解吸量、解吸率為指標(biāo)，考察了ADS-17，XDA-8，LSA-21，LSA-10，AB-8，LX-36，D-101，LSA-33共8種大孔樹脂對麻椒總黃酮的純化效果，結(jié)果表明LSA-21型大孔吸附樹脂能夠較好地吸附和解吸麻椒總黃酮，其對麻椒總黃酮的比吸附量平均為5.248 mg／g、吸附率平均為90.79%，比解吸量平均為5.032 mg／g、解吸率平均為95.88%，為上述8種大孔樹脂中純化麻椒總黃酮的最佳樹脂類型。通過靜態(tài)、動態(tài)吸附和解吸實驗，考察了麻椒總黃酮在LSA-21樹脂上的吸附特性，確定LSA-21樹脂純化麻椒總黃酮的生產(chǎn)工藝條件為：控制麻椒提取液總黃酮質(zhì)量濃度為0.96 mg／m L左右，然后用石油醚脫脂，脫脂后麻椒提取液的上樣體積與樹脂質(zhì)量之比（m L／mg）為6∶1，吸附流速控制為1.5 m L／min，解吸液為p H 8.0的90%乙醇水溶液，解吸流速控制為1.5 mL／min，解吸液體積與樹脂質(zhì)量之比（mL／mg）為10∶1。在此純化條件下，麻椒提取液經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹脂純化后，麻椒干浸膏中總黃酮含量由12.12%提高到36.65%，總黃酮含量提高了3倍。體外抗氧化活性的實驗結(jié)果表明：麻椒總黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基均具有較強的清除能力，而且清除能力均強于陽性對照維生素C，其清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50分別為0.1946，0.1336 mg／mL，清除能力均隨著麻椒總黃酮質(zhì)量濃度的增加而升高，均呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明：麻椒總黃酮具有較強的體外抗氧化活性。上述實驗結(jié)果為麻椒總黃酮在食品、藥品行業(yè)的綜合利用提供了前期實驗基礎(chǔ)。

［1］曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展［J］.西北植物學(xué)報，2003，23（12）：2241-2247.

［2］鄭瑞生，封輝，戴聰杰，等.植物中抗氧化活性成分研究進展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（9）：85-90.

［3］Yao Xincheng，Zhu Ling，Chen Yuxin，et al.In vivo and in vitro antioxidant activity andα-glucosidase，α-amylase inhibitory effects of flavonoids fromCichorium glandulosumseeds［J］.Food Chemistry，2013，139（1）：59-66.

［4］Saint T，Thitima L，Nuanchawee W，et al.Eriosema chinense：a rich source of antimicrobial and antioxidant flavonoids［J］.Phytochemistry，2013，96：353-359.

［5］汪璇，張建新，孫長江，等.大孔吸附樹脂分離黃粉蟲黃酮及其抗氧化活性研究［J］.中國食品學(xué)報，2014，14（1）：87-93.

［6］周蘇果，李大方，沈忱，等.中極性大孔吸附樹脂分離純化菊米總黃酮［J］.高?；瘜W(xué)工程學(xué)報，2014，28（3）：680-684.

［7］崔蕊靜，申淑琦，郭朔.復(fù)合酶協(xié)同微波處理提取紫背天葵葉片總黃酮工藝［J］.中國食品學(xué)報，2014，14（2）：72-77.

［8］鐘方麗，王曉林，王志敏，等.大孔吸附樹脂法純化玉竹總黃酮工藝研究［J］.食品與機械，2013，29（1）：131-134.

［9］王曉林，薛健飛，陳帥，等.大孔樹脂法純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝［J］.食品科學(xué)，2014，35（14）：58-61.

［10］甘芝霖，倪元穎，郭悅，等.大孔樹脂分離純化玫瑰果多酚及其抗氧化性［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2015，31（24）：298-304.

［11］鄭紅巖，于華忠，劉建蘭，等.大孔吸附樹脂對藍莓花色苷的分離工藝［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2014，34（4）：599-644.

［12］易海燕，何桂霞，歐陽文，等.大孔吸附樹脂分離純化藤茶總黃酮的研究［J］.中草藥，2011，42（1）：74-77.

［13］楊潤亞，明永飛，王慧.無花果葉中總黃酮的提取及其抗氧化活性測定［J］.食品科學(xué)，2010，31（16）：78-82.

［14］鐘方麗，王文姣，王曉林，等.刺玫果總黃酮的雙水相萃取工藝及其抗氧化能力［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2016，36（4）：64-72.

Study on Purification Technology and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Pepper

WANG Xiao-lin1，JIN Long-zhe2，ZHONG Fang-li1*，QIN Jie1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.Yanbian Korean Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Yanji 133001，China）

The process for purifying total flavonoids from pepper and the antioxidant activity of total flavonoids are studied.The purification process of TFs is optimized by single factor and orthogonal tests using adsorption capacity，adsorption ratio，desorption capacity，desorption ratio as indexes for investigation.The scavenging activity of total flavonoids from pepper on hydroxyl radical and superoxide anion free radical is studied by spectrophotometry.The results show that the optimum purification conditions of TFsin pepper are as follows：keep the total flavonoids concentration at about 0.96 mg／mL，and then degrease with petroleum ether，the ratio of sample volume of defatted pepper extract with resin mass（mL／mg）is 6∶1，the adsorption velocity is 1.5 mL／min，the eluate is 90%（volume fraction）ethanol solution（p H 8.0），the desorption velocity is 1.5 mL／min，the ratio of the desorption volume with resin mass（mL／mg）is 10∶1.Under the conditions of purification，the average adsorption capacity of LSA-21 resin to total flavonoids is 5.248 mg／g，the average adsorption ratio is 90.79%，the average desorption capacity of LSA-21 resin to total flavonoids is 5.032 mg／g，the average desorption rate is 95.88%，the purity of TFs in pepper extract could be changed from 12.12%to 36.65%.The scavenging ability of total flavonoids from pepper to hydroxyl radical and superoxide anion radical is stronger，both shows dose-response relationship，scavenging hydroxyl radical，superoxide anion radical IC50values are 0.1946，0.1336 mg／mL.The antioxidant activity of total flavonoids is positively correlated with its concentration，in vitro antioxidant activity with mass concentration dependent，its ability to scavenge free radicals is stronger than vitamin C.The results show that the total flavonoids have strong antioxidant activity in vitro.The results have provided basis for further development and utilization of pepper.

pepper；total flavonoids；macroporous resin；antioxidant

TS201.1

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.008

1000-9973（2017）10-0033-08

2017－04－10 *通訊作者

王曉林（1969－），男，山東五蓮人，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取純化及藥物的研發(fā)；鐘方麗（1970－），女，山東安丘人，教授，博士，主要從事食品及天然藥物的研發(fā)。