陳雪梅，陳茂深，徐菲菲，鐘芳*

（1.江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

啤酒廢酵母自溶制備氨基酸的研究

陳雪梅1，2，陳茂深2，徐菲菲2，鐘芳2*

（1.江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

以啤酒廢酵母為原料自溶制備氨基酸，以水解度為參考指標(biāo)確定了自溶工藝條件。首先，對氯化鈉、半胱氨酸、亞硫氨酸和風(fēng)味蛋白酶這4種促溶劑進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U／g）效果最佳；在此基礎(chǔ)上對其他工藝條件如促溶劑添加量、初始p H值、溫度和時間進(jìn)行了優(yōu)化，通過研究表明最佳自溶條件為風(fēng)味蛋白酶0.3%、初始p H值6.5、溫度45℃、自溶時間20 h，在此工藝條件下水解度為44.29%。并對氨基酸組成進(jìn)行了分析，結(jié)果表明氨基酸水解度為45.24%，且組氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸的水解度較高，高達(dá)60%以上。

啤酒廢酵母；自溶；水解度；氨基酸

啤酒廢酵母常被作為工業(yè)廢料排放，人們逐漸意識到啤酒廢酵母的價值，蛋白50%，氨基酸組成接近理想蛋白質(zhì)［1－3］。獲得氨基酸一般通過自溶，自溶是指酵母細(xì)胞中退化的酶被激活后溶解菌體，將大分子物質(zhì)水解成小分子物質(zhì)［4－6］。由于酵母細(xì)胞內(nèi)源酶活力有限，可借助物理手段、化學(xué)手段和生物手段來提高自溶率。Verduyn C等［7］將自溶與高壓均質(zhì)結(jié)合使得細(xì)胞破碎程度大大加強(qiáng)，得到的抽提物中總氮含量可高達(dá)80%以上，但物理手段能耗較大、成本高。Breddam Klaus等［8］通過添加氯化鈉使得啤酒廢酵母進(jìn)行質(zhì)壁分離后再促使自溶，自溶程度增大。在Tsang Shekkwan等［9］的研究中指出加入酶可增大自溶程度。大多數(shù)研究指出自溶提高，但并未對自溶得到的氨基酸進(jìn)行分析。

此外，Illanes A等［10］研究指出經(jīng)過干燥的酵母可以加速自溶的進(jìn)行。因此，本文以經(jīng)過噴霧干燥后的啤酒廢酵母為原料，首先研究了不同促溶劑對自溶制備氨基酸的影響，并探究了其最佳工藝條件，最后對所得的自溶液進(jìn)行氨基酸組成分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

啤酒廢酵母 宜興江山生物技術(shù)公司；風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U） 諾維信有限公司；氯化鈉、半胱氨酸、亞硫酸鈉、碳酸氫鈉、結(jié)晶乙酸鈉、醋酸、四氫呋喃、乙腈、甲醇 中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

酶反應(yīng)器 無錫市東升玻璃儀器廠；DL-5-B低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；RT10磁力攪拌器 德國IKA公司；Agilent 1100安捷倫高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；MP-501A超級恒溫槽 上海一恒科技有限公司；EL-20 p H計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脫苦

將過篩后的啤酒廢酵母加入0.5%（W／W）的NaHCO3溶液，浸泡30 min。再以4000 r／min離心10 min得到啤酒廢酵母泥，再以1∶4加入蒸餾水洗滌廢酵母泥至洗滌液p H值為6～7，所得啤酒廢酵母泥備用。

1.2.2 自溶

啤酒廢酵母泥以一定比例的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍尤氪偃軇?，調(diào)節(jié)p H值在恒定溫度下反應(yīng)一段時間。取出沸水浴20 min進(jìn)行滅酶處理，待冷卻后離心（4000 r／min，10 min）分離得到自溶液。

1.2.3 水解度（DH）測定［11］

1.2.4 工藝優(yōu)化

以促溶劑種類、促溶劑用量、初始p H值、溫度和自溶時間5個因素對啤酒酵母的自溶程度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，見表1。以水解度為指標(biāo)確定啤酒廢酵母的最佳自溶條件。單因素實(shí)驗(yàn)是固定其中4個因素，分析第4個影響因素與自溶程度的關(guān)系。

表1 自溶工藝單因素實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Single factor experimental levels of autolysis technology

1.2.5 氨基酸分析

根據(jù)文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

由于啤酒廢酵母中還殘留有較多的酒花和吸附在其表面的一些代謝產(chǎn)物使其具有苦味，Shotipruk Artiwan等通過微濾的方法對啤酒廢酵母進(jìn)行了脫苦處理，不僅使得苦味物質(zhì)大大減少并且提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量。而另外一種較為常用的方法，則是在啤酒廢酵母中加入酒精、食用小蘇打（碳酸氫鈉）等進(jìn)行脫苦處理。對于碳酸氫鈉的添加量，一般濃度為0.5%［13］，本文選擇0.5%食用小蘇打進(jìn)行脫苦處理。

水解度是指蛋白質(zhì)分子中通過生物的或化學(xué)的方法水解而斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例，是衡量蛋白質(zhì)水解程度的一個重要指標(biāo)。因此，本文主要以水解度為指標(biāo)進(jìn)行自溶工藝條件優(yōu)化。

2.1 促溶劑的影響

增加自溶率的化學(xué)試劑和酶制劑都叫作促溶劑，本文主要選擇了研究較多的4種促溶劑：氯化鈉（3%）、半胱氨酸（0.3%）、亞硫酸鈉（0.3%）和風(fēng)味蛋白酶（0.3%），不同促溶劑的添加量根據(jù)文獻(xiàn)確定［14－16］。工藝條件為：水添加量為酵母泥的3倍，調(diào)節(jié)p H值至6.0，于45℃自溶24 h，于沸水浴中加熱20 min滅酶后，測定其水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 促溶劑對自溶程度的影響Fig.1 Effect of promoters on degree of autolysis

由圖1可知，在4種促溶劑中，風(fēng)味蛋白酶的效果最好，其水解度達(dá)到35%以上，而其余3種促溶劑對啤酒廢酵母的自溶程度影響相比于空白樣品并沒有明顯提升效果。然而添加的風(fēng)味蛋白酶，是一種復(fù)合蛋白酶，當(dāng)作用于啤酒廢酵母時，一方面可以分解細(xì)胞壁表面的蛋白質(zhì)而使酵母細(xì)胞壁出現(xiàn)孔洞，使得酵母細(xì)胞自身的蛋白酶溶出而繼續(xù)對啤酒廢酵母起作用，酶解蛋白質(zhì)，溶出氨基酸。另一方面，風(fēng)味蛋白酶也作為一種外添加的酶制劑作用于啤酒廢酵母中的蛋白。綜合這兩個方面的原因，使得風(fēng)味蛋白酶作為促溶劑大大增強(qiáng)了自溶程度，故選擇風(fēng)味蛋白酶作為促溶劑。

2.2 促溶劑添加量的影響

自溶工藝條件為：分別加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（W／W）風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U／g），調(diào)節(jié)p H值至6.0，45℃自溶24 h，沸水浴中加熱20 min滅酶，測定其水解度，結(jié)果見圖2。

圖2 促溶劑添加量對自溶程度的影響Fig.2 Effect of promoters＇amount on degree of autolysis

由圖2可知，隨著風(fēng)味蛋白酶的含量逐漸增加，水解度逐漸升高，且升高速率由急變緩。當(dāng)風(fēng)味蛋白酶添加量達(dá)到0.3%時，其水解度高達(dá)40%，綜合考慮酶的成本及隨酶添加量所增加的效果，選擇風(fēng)味蛋白酶添加量為0.3%。

2.3 初始p H值的影響

加入0.3%（W／W）風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U／g），分別調(diào)節(jié)p H值至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，45℃自溶24 h，沸水浴中加熱20 min滅酶，測定其水解度，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，體系初始的p H值對自溶程度的影響較明顯，當(dāng)p H值從5.0上升至8.5時，水解度先上升再下降，當(dāng)p H值處于6.5左右時，其水解度最高，為38.89%。由于整個體系含有多種蛋白酶，而隨著自溶作用的進(jìn)行，其體系的p H值也會發(fā)生改變，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在初始p H值為6.5時，這幾種蛋白酶對啤酒廢酵母自溶的綜合作用效果最好。Champagne Claude P等研究了p H值對自溶效果的影響，結(jié)果顯示p H值在5～7之間，肽酶能較好作用。由此確定自溶的起始p H值為6.5。

2.4 溫度對自溶的影響

加入0.3%（W／W）風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U／g），調(diào)節(jié)p H值至6.5，分別于35，40，45，50，55℃自溶24 h，沸水浴中加熱20 min滅酶，測定其水解度，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對自溶程度的影響Fig.4 Effect of temperature on degree of autolysis

由圖4可知，溫度的變化對自溶的影響較大，隨著溫度的升高，水解度逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到45℃時，水解度最高，為39.53%，而隨著溫度的繼續(xù)升高，水解度則逐漸減少。溫度對自溶的影響與體系的p H值類似，都是通過影響自身酶活性從而影響自溶效果。結(jié)果表明：當(dāng)溫度為45℃時，體系中各種酶能處于一個較好的協(xié)同狀態(tài)，所以自溶的溫度選擇45℃。

2.5 時間對自溶的影響

加入0.3%（W／W）風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U／g），調(diào)節(jié)p H值至6.5，于45℃分別自溶4，6，8，10，12，16，20，24，28，32 h，于沸水浴中加熱20 min滅酶后，測定其水解度，結(jié)果見圖5。

圖5 時間對自溶程度的影響Fig.5 Effect of time on degree of autolysis

由圖5可知，從總體趨勢上看，隨著自溶時間延長水解度逐漸升高。同時，自溶時間從4 h增加至20 h時，其水解度增加幅度較大；而當(dāng)自溶時間從20 h延長至32 h時，水解度增幅很小。自溶32 h的水解度為48.57%，而當(dāng)自溶時間為20 h時，其水解度已經(jīng)達(dá)到44.29%。郭廣超等［17］的研究指出在外加酶促的條件下，隨著自溶時間的延長，酵母抽提液的產(chǎn)品得率不斷增加，在28 h時產(chǎn)品得率趨于穩(wěn)定。所以綜合考慮選擇自溶時間為20 h。

2.6 自溶前后游離氨基酸分布情況

甲醛滴定法可知氨基酸總量，但不清楚氨基酸分布情況，故在確定啤酒廢酵母的自溶工藝條件后對啤酒廢酵母的氨基酸組成進(jìn)行分析測定，氨基酸組成見表2。

表2 自溶前后氨基酸分布Table 2 Amino acid distribution before and after autolysis

續(xù) 表

由表2可知，經(jīng)過自溶作用，總的游離氨基酸含量為45.24%，與甲醛滴定法所得結(jié)果具有較好的一致性。其中，經(jīng)過自溶后，半胱氨酸和甲硫氨酸幾乎都被水解，以游離的形式存在于自溶液中。半胱氨酸和甲硫氨酸都是含硫氨基酸，是產(chǎn)生風(fēng)味的重要氨基酸。另外，組氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸的水解比例同樣較高，都在60%以上，其中亮氨酸經(jīng)過美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生干酪的焦香［18］。從氨基酸的含量上來看，天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸的含量均在1 g／100 g以上，其中丙氨酸通過美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生焦糖味。由此可知，啤酒廢酵母自溶制備的氨基酸可用于制備風(fēng)味物質(zhì)，這為風(fēng)味物質(zhì)的制備提供了思路。

3 結(jié)論

首先本文通過研究4種促溶劑對啤酒廢酵母自溶的影響，風(fēng)味蛋白酶效果最佳。說明對啤酒廢酵母的細(xì)胞壁破碎而言，生物酶制劑的效果優(yōu)于通過質(zhì)壁分離的氯化鈉、亞硫酸鈉等。其次，本文通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了啤酒廢酵母制備氨基酸的工藝條件：風(fēng)味蛋白酶（2.2×104U／g）添加量為0.3%（W／W），初始p H為6.5，溫度為45℃，自溶時間為20 h，水解度為44.29%。最后，本文對啤酒廢酵母自溶后的氨基酸組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸含量豐富，是用于制備風(fēng)味物質(zhì)的良好原料。

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Research on Preparing Amino Acids with Waste Beer Yeast

CHEN Xue-mei1，2，CHEN Mao-shen2，XU Fei-fei2，ZHONG Fang2*
（1.National Engineering Research Center for Functional Food，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Use the beer yeast residual as raw material for preparing amino acids and the degree of hydrolysis is as the index to confirm the conditions of autolysis.Firstly，study the influence of four promoters such as sodium chloridethe，cysteine，methionine and flavorzyme，it turns out that flavorzyme（2.2×104U／g）has the best effect.On this basis，study the influence of other conditions such as additive amount of promoters，initial p H，temperature and time，it turns out that the optimization conditions of autolysis are flavorzyme of 0.3%，initial p H value of 6.5，autolysis temperature of 45℃，autolysis time of 20 h.The degree of hydrolysis（DH）reaches up to 44.29%under such conditions.And then analyze the composition of amino acids，the result shows that DH reaches up to 45.24%，and the DH of histidine，threonine，valine，phenylalanine，isoleucine，leucine and lysine is higher，which can reach up to 60%.

waste beer yeast；autolysis；degree of hydrolysis；amino acid

TS201.57

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.007

1000-9973（2017）10-0029-04

2017－06－15 *通訊作者

陳雪梅（1990－），女，四川內(nèi)江人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：功能食品；鐘芳（1972－），女，河南新鄉(xiāng)人，教授，博士，研究方向：食品科學(xué)。