王曉玲， 鄧于新， 董陽婷， 官志忠，， 齊曉嵐， 王 凡

α7神經(jīng)型尼古丁受體激動劑PNU282987對APP/PS1小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達的影響

王曉玲1，2， 鄧于新1，2， 董陽婷3， 官志忠1，2，3， 齊曉嵐1，2， 王 凡4

目的研究特異性激動APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中α7神經(jīng)型尼古丁受體(α7 nAChR)水平后對海馬組織DYN-Ⅰ蛋白的影響；探討α7 nAChR在阿爾茨海默病 (Alzheimer disease，AD) 發(fā)病機制中的神經(jīng)保護作用機制。方法實驗動物分為對照組(Control)、野生加PNU282987組(WP)、APP/PS1轉(zhuǎn)基因組(APP/PS1)和APP/PS1加PNU282987組(AP)各8只，WP和AP組給予α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987，另兩組給予生理鹽水，給藥方式為小鼠24 w齡時1 mg/kg腹腔注射PNU-282987，連續(xù)5 d。采用 Real-time PCR 法和蛋白免疫印跡 (Western Blot) 法分別測定小鼠海馬組織中發(fā)動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白表達水平的變化。結(jié)果與control組相比，APP/PS1組海馬組織中發(fā)動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白水平下降(P<0.05，P<0.01)；而特異性激動α7 nAChR水平后，與對照組相比WP組中發(fā)動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白水平升高(P<0.05，P<0.01)；與APP/PS1組相比AP組小鼠大腦海馬組織中發(fā)動蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ) mRNA 和蛋白水平明顯升高(P<0.01，P<0.01)。結(jié)論特異性激動APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中α7 nAChR水平能夠使網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞調(diào)節(jié)蛋白DYN-Ⅰ表達升高。這可能提示了α7 nAChR對突觸有一定的保護作用，進一步說明α7 nAChR在阿爾茨海默病的發(fā)病中起著重要作用。

α7 神經(jīng)型尼古丁受體； 阿爾茨海默??； APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠； DYN-Ⅰ

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of specially agonism 7 neural nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) on the expression of DYN-Ⅰ protein in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice，and to explore the neuroprotective role of 7nAChR in the pathogenesis of Alzheimer’s disease ( AD).MethodsExperimental animals were divided into four groups：Control group，Wild plus PNU282987 group (WP)，APP/PS1 group and APP / PS1 plus PNU282987 group，8 mice each group，WP group and AP group were given with α7nAChRs specific agonist PNU-282987，the other two groups were given with saline for control，All groups were injected intraperitoneally for continuous 5 days at a dose of 1 ml / kg at 24 weeks old. After this the mRNA and protein level of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) in hippocampus of mice were detected by Real-time PCR and Western Blotting respectively.ResultsCompared with the control group，the mRNA and protein levels of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) in the hippocampus of the APP/PS1 group were decreased (P<0.05P<0.01)；After specially agonism α7nAChRs with its specific agonist PNU282987，we validated the levels of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) mRNA and protein were increased compared with the control group (P<0.01P<0.01)；Compared with the APP/PS1 group，the mRNA and protein levels of dynamin Ⅰ (DYN-Ⅰ) in the hippocampus of the AP group were increased (P<0.01P<0.01).ConclusionSpecially agonism the level of α7 nAChR in hippocampus of APP/PS1 transgenic mice can increase the expression of dendritic regulatory dynamin Ⅰ protein (DYN-Ⅰ). The result indicates that α7nAChR has a protective effect on synapse，suggesting that the receptor might play an important neuroprotective role in the pathogenesis of AD.

Keywords： α7 nAChR； AD； APP/PS1 transgenic mouse； DYN-Ⅰ

阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)是一種以智力緩慢性進行性喪失為特征的神經(jīng)退行性變疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶力進行性降低，精神和性格異常，社會交往和適應(yīng)能力降低。當(dāng)前，AD 已成為繼續(xù)心腦血管疾病后威脅我國老年人健康的又一重要病種。其主要神經(jīng)病理特征為細胞外β-淀粉樣蛋白 (β-Amyloid protein，Aβ)沉積所形成的老年斑、細胞內(nèi)異常磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau蛋白聚積所形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、中樞膽堿能神經(jīng)元的丟失及累及皮質(zhì)動脈和小動脈的血管淀粉樣變性等[1]。目前對 AD 確切病因、發(fā)病機制尚未真正了解。近年來，由于 AD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的成功培養(yǎng)，為研究 AD 提供了理想的工具。神經(jīng)型乙酰膽堿受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)在AD中研究較多，α7 nAChR是分布最廣的亞單位之一[2]，具有調(diào)節(jié)認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等功能[3，4]，膽堿能系統(tǒng)障礙和神經(jīng)損傷可能與α7 nAChR基因、結(jié)構(gòu)及其功能異常有一定關(guān)聯(lián)[5]。有報道指出在 AD 中最脆弱的神經(jīng)元是那些高表達神經(jīng)型尼古丁受體的神經(jīng)元，特別是含有 α7 nAChR 亞單位，且在 AD患者膽堿能系統(tǒng)損傷與α7 nAChR 水平下降和突觸損傷有關(guān)[6，7]，其在調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性方面具有獨特的作用，在神經(jīng)保護中起了重要的作用。有研究顯示，阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能下降與突觸聯(lián)系喪失程度表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，特別是與突觸囊泡回收蛋白表達異常有關(guān)[8]。突觸囊泡的循環(huán)回收過程主要是通過網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞過程完成的，需要多種蛋白協(xié)調(diào)完成，而 DYN-Ⅰ就是其中一個重要蛋白。DYN-Ⅰ是Dynamin家族中的重要一員，它參與到網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的突觸囊泡的內(nèi)吞過程，在內(nèi)吞回收突觸囊泡過程中至關(guān)重要[9]。因此，本課題通過特異性激動APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦組織α7 nAChR水平來研究在 AD 發(fā)病機制中，α7 nAChR的水平對DYN-Ⅰ蛋白表達的影響進行研究，進一步探討這些改變之間是否具有一定的相關(guān)性，為進一步闡明 AD 發(fā)病機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 AD轉(zhuǎn)基因動物模型鑒定 雄性阿爾茨海默病APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠(B6.Cg-Tg)及同背景雌性野生型小鼠，體重20～30 g，均購自上海南方模式生物公司[動物許可證號：SCXK(滬)2014-0002]。野生型小鼠和APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠可配期為3～10 m，母鼠的妊娠期為 20 d左右，繁殖采用1只雄鼠與3只雌鼠同居的方式進行。成功繁殖后，當(dāng)新生的小鼠年齡達到 2～3 w時剪鼠尾提取小鼠DNA，進行小鼠基因型鑒定。19～20 d后子鼠雌雄分籠飼養(yǎng)。實驗動物遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，采用獨立通風(fēng)柜飼養(yǎng)，動物房房常年溫度控制在(24±2)℃，濕度40%～60%，光照時間8：00～21：30。所有動物均飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心 SPF 級環(huán)境。所有實驗操作均獲得貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的許可。

1.2 試劑 α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987購于sigma公司(美國)；兔抗α7 nAChR(H-302)多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體sc-81178、辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的抗鼠二抗sc-2005均購于Santa Cruz 公司(美國)；兔抗dynamin1單克隆抗體 (GTX61459)、高分子量蛋白 Marker (12-170kD)購于GeneTex公司(美國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的抗兔二抗7074購于CST 公司(美國)；5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、抗體稀釋液、封閉液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、聚乙烯二氟 (PVDF) 膜購于Amersham公司(美國)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于 Thermo 公司；Firststart Universal SYBR Green Master (Rox)購于 Roche 公司(德國)；Trizol試劑購于Invitrogen 公司；2×Taq PCR MasterMix購于北京TIANGEN公司；DL2000 DNA Marker 購于日本TaKaRa公司；β-actin、DYN-Ⅰ定量PCR的引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。

1.3 動物分組及藥物處理 本實驗將APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠和同背景的野生小鼠分為4組各8只，雌雄各半。分別為A組：24 w野生型小鼠生理鹽水對照組(Control)；B組(WP組)：24 w野生型小鼠1 mg/kg α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987處理組；C組(APP/PS1組)：24 w APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠生理鹽水對照組；D組(AP組)：24 w APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠α7 nAChRs 特異性激動劑PNU-282987處理組。

各組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 m后，B、D組在24 w齡大小時開始每日給予小鼠腹腔注射1 mg/kg α7nAChRs 特異性激動劑PNU-282987處理，A、C組只經(jīng)小鼠腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)注射5 d。然后腹腔注射4%水合氯醛(0.2 ml/10 g)麻醉，開胸暴露小鼠心臟，穿刺針經(jīng)左心室穿刺至升主動脈，用0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)液40 ml灌注沖洗血管床約5 min，取出小鼠大腦組織，在冰上收集小鼠海馬組織，于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定 當(dāng)新生的小鼠年齡達到2～3 w時剪取鼠尾：(1)DNA提取：剪取鼠尾0.5 cm，放入標(biāo)記好的 EPP管中，每管加入500 μl鼠尾裂解液和50 μl的蛋白酶K(TaKaRa)，56 ℃水浴鍋過夜，酚/氯仿法提取和純化基因組 DNA；(2)PCR反應(yīng)：APP基因上游引物5’GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG3’，APP基因下游引物5’CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG3’，PS1基因上游引物5’AATAGAGAACGGCAGGAGC-

A3’PS1基因下游引物5’GCCATGAGGGCACTAATCAT3’，反應(yīng)體系：上游、下游引物各0.5 μl，DNA 模板2 μl，2×Taq PCR MasterMix12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。預(yù)變性 94 ℃ 3 min變性：94 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 3 s；延伸：72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。最后延伸：72 ℃ 5 min，4 ℃保存，1.5%瓊脂糖電泳觀察PCR結(jié)果；(3) PCR產(chǎn)物的鑒定：PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行光密度掃描，用Syngene G：BOX EF2凝膠成像儀進行觀察分析，觀察瓊脂糖凝膠上的PCR條帶，同時有400 bp和600 bp出現(xiàn)條帶者即為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.4.2 實時熒光定量PCR 檢測DYN-Ⅰ、β-actin mRNA 表達水平 采用Trizol一步法提取組織總 RNA，取3 μgRNA樣品用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進行實時熒光定量 PCR。其中DYN-Ⅰ、β-actin的引物序列見表1。用ABI Step One Plus型實時熒光定量PCR儀，采集DYN-Ⅰ、內(nèi)參β-actin基因擴增各循環(huán)的熒光信號，以SDS2.1軟件收集熒光信息和分析數(shù)據(jù)。分析結(jié)果時以β-actin為內(nèi)參對照，計算DYN-Ⅰ基因在實驗組與對照組的相對水平(RQ=2-△△Ct)。實驗獨立重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

1.4.3 Western印記檢測實驗小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達 取各組小鼠海馬組織按RIPA∶PMSF=100∶1配制加入裂解液， 用冷凍離心機

12000 r/min、4 ℃、20 min離心，吸取上清液即為蛋白質(zhì)。蛋白濃度采用BCA定量法測定；運用Western blotting法檢測DYN-1蛋白表達水平及其內(nèi)參的蛋白表達情況。用ImageJ軟件進行圖片像素灰度值分析結(jié)果，計算DYN-1蛋白條帶與內(nèi)參β-actin像素灰度的比值作為目的蛋白表達的相對水平。每組蛋白重復(fù)3次獨立試驗，每次3個復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1 APPswe/PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型鑒定結(jié)果 見圖1。以基因組 DNA 為模板擴增，當(dāng)基因組DNA同時擴增出約400 bp及600 bp大小的條帶即為APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠。

2.2 各組中 DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白表達水平 結(jié)果顯示，用 Real-time PCR 和 Western blot 方法檢測到與對照組相比，APP/PS1組小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白水平下降(P<0.05，P<0.01)；而經(jīng)特異性激動劑PNU-282987小鼠腹腔注射后，與對照組相比WP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白表達水平升高(P<0.05，P<0.01)；與APP/PS1組相比AP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA 及蛋白表達水平明顯升高(P<0.01，P<0.01)(圖2A、2B)。

M為DL2000 DNA，Marker 1、3、4 是 APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠APP基因片段為400 bp，PS1基因片段為600 bp

圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P<0.05；與對照組相比差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義**P<0.01；與APP/PS1模型組相比差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義##P<0.01

圖2 各組小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ mRNA (A)及蛋白表達水平(B)

3 討 論

隨著老年人口數(shù)量的逐年上升，老年性癡呆的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢，加快對該病的探索及有效的防治研究已迫在眉睫[10]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可表達突變的人類早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉樣前蛋白(APPswe)融合體。已發(fā)現(xiàn)第21號染色體上有引起AD的基因，即突變的β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid procursor protein，APP)基因；第14號染色體上有導(dǎo)致AD 早期發(fā)作的早老素1 (Presenilin 1) 基因和第1號染色體上早老素2 (Presinilin 2) 基因等[11]。APP是一種跨膜糖蛋白，APP的突變使得其與Aβ形成過程中的β-分泌酶的結(jié)合位點發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致β-分泌酶的活性升高，從而Aβ的總量增加[12]。PS1是由467個氨基酸組成的蛋白，它與PS2，Aph-l和PEN-2共同構(gòu)成使γ分泌酶激活的復(fù)合體，突變PS1的產(chǎn)物可引起γ分泌酶的活性改變，選擇性地引起Aβ42的產(chǎn)生增加[13]。這說明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠APP和PSl基因的突變可以導(dǎo)致Aβ水平的升高，模擬AD的神經(jīng)病理過程。

在AD病變研究中神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿能受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)研究頗多，具有調(diào)節(jié)大腦記憶學(xué)習(xí)、智力發(fā)展、識別能力等功能和顯著的神經(jīng)保護作用，對指導(dǎo)AD治療有一定幫助[14]。目前發(fā)現(xiàn)有12種nAChR 為配體門控的離子通道受體，包括α2～α10、β2～β4。α7nAChR 是腦內(nèi)主要尼古丁受體，主要分布在海馬和皮質(zhì)，與老年斑的常見沉積部位一致。尸檢AD患者腦中高親和力的尼古丁受體數(shù)目明顯降低，與大腦顳葉皮質(zhì)老年斑的增多程度呈負相關(guān)[15]。報道指出在 AD 患者中觀察到膽堿能損傷與 α7nAChR 表達水平下降和突觸損傷有關(guān)，且最近有研究表明在老化過程中 α7nAChR對海馬突觸可塑性的重要性[16]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)AD患者早期即可出現(xiàn)突觸數(shù)量的減少，其認(rèn)知障礙程度與突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)。對AD患者的尸檢標(biāo)本檢測顯示了患者腦內(nèi)多種突觸蛋白表達含量下降，提示突觸功能也發(fā)生了改變，突觸功能低下或丟失可造成皮質(zhì)-皮質(zhì)之間的連接性受到影響或破壞，最終引起認(rèn)知功能降低[17]。本課題組前期研究結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默SH-SY5Y細胞α7nAChR，能使細胞突觸相關(guān)蛋白的表達減少，表明α7nAChR在SH-SY5Y細胞中的表達量的沉默將會影響突觸相關(guān)蛋白的表達[18]。研究表明，α7nAChR 對改善阿爾茨海默癥和精神分裂癥患者的認(rèn)知障礙有顯著作用。因此，α7nAChR 已被確認(rèn)為一種很有前途的治療目標(biāo)在治療認(rèn)知障礙與精神分裂癥和 AD[19]。激活的 α7 nAChR 可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放、改變突觸可塑性，對維持記憶及認(rèn)知功能的十分重要[20]。PNU是α7nAChR激動劑中特異性較高的合成物，與其他nAchR亞單位結(jié)合微乎其微，與α7nAChR結(jié)合，提高和改善AD 動物模型的認(rèn)知和記憶功能[21]。DYN-Ⅰ是Dynamin家族中的重要一員，是一種相對分子質(zhì)量為95kDa的三磷酸鳥苷酶( guanosinetriphosphatase，GTPase )，主要存在于突觸前囊泡膜上。現(xiàn)已證實 DYN-Ⅰ在細胞內(nèi)吞和突觸囊泡循環(huán)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)突觸囊泡膜上網(wǎng)格蛋白包被后，DYN-Ⅰ對其進行機械擠壓并剪切，使突觸囊泡從突觸前膜解離，為再次神經(jīng)遞質(zhì)的釋放做準(zhǔn)備，而GTPase的水解可促進剪切的進行[22]。

盡管AD的主要病理學(xué)改變是Aβ沉積形成的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，但近年的研究結(jié)果表明突觸丟失是認(rèn)知功能低下的主要危險因素之一。突觸丟失致使突觸聯(lián)系障礙，神經(jīng)元與神經(jīng)元之間信息傳遞中斷，學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知能力下降。本實驗主要研究特異性激動APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中α7nAChR水平后對海馬組織DYN-Ⅰ蛋白的影響，從而探討α7nAChR在阿爾茨海默病 (Alzheimer disease，AD) 發(fā)病機制中的神經(jīng)保護作用機制。本研究選用24 w齡的 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠，實驗結(jié)果顯示APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達下降，這與Yao等[23]的研究結(jié)果一致，表明在AD早期即已出現(xiàn)突觸蛋白表達含量下降。此外，本結(jié)果還顯示特異性激動α7 nAChR水平后，與對照組相比WP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ 蛋白表達水平升高；與APP/PS1組相比AP組小鼠大腦海馬組織中DYN-Ⅰ蛋白表達水平明顯升高。因此，我們推測可能原因是α7nAChR對突觸有一定的神經(jīng)保護作用，α7 nAChR與突觸密切相關(guān)。因而，進一步研究α7nAChR對突觸活動的調(diào)控有重要的研究意義，為AD的早期診治提供一定的幫助。

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Theeffectsexpressionofα7neuronalnicotinereceptoragonistPNU282987onDYN-ⅠProteininhippocampusofAPP/PS1Mice

WANGXiaoling，DENGYuxin，DONGYangting，etal.

[KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases(GuizhouMedicalUniversity)，Guiyang550004，China]

1003-2754(2017)09-0777-05

2017-07-20；

2017-08-30

國家自然科學(xué)基金(81360178)；貴州省重大專項計劃 {黔科合重大專項字[2014]6008號}；貴州省創(chuàng)新計劃項目{黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心[2014]06}；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊[黔科通(2016)161號]；貴州省科技廳項目{黔科合LH字[2014]7153}

[1.地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室(貴州醫(yī)科大學(xué))，貴州 貴陽 550004；2.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室(貴州醫(yī)科大學(xué))，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 貴陽 550004]

王 凡，E-mail：1034309115@qq.com

R749.01

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