王慶君， 景玉宏， 陳海超， 馬學(xué)珠， 穆繼英， 高麗萍

人源α-synuclein跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)特性及對神經(jīng)細(xì)胞突起的影響

王慶君1， 景玉宏2， 陳海超1， 馬學(xué)珠2， 穆繼英2， 高麗萍1

目的確定人源α-synuclein是否能夠跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，過表達(dá)人源α-synuclein對神經(jīng)細(xì)胞突起有何影響。方法建立穩(wěn)定表達(dá)人源α-synuclein的N2a細(xì)胞株，通過接觸和非接觸兩種方法觀察人源α-synuclein的轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象，通過測量神經(jīng)突起長度，評價人源α-synuclein過表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞突起生長的影響。結(jié)果接觸和非接觸兩種方法均能夠觀察到人源α-synuclein跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，但總體轉(zhuǎn)運(yùn)率低。過表達(dá)人源α-synuclein導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞突起生長不良。結(jié)論人源α-synuclein跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象存在，轉(zhuǎn)運(yùn)可能受到多因素影響，效率較低。過表達(dá)人源α-synuclein蛋白對神經(jīng)突起有損傷作用。

人源α-synuclein； 朊蛋白樣轉(zhuǎn)移； 細(xì)胞突起

Abstract：ObjectiveTo confirm whether human derived a-synuclein have ability to transfer across cell to cell. To evaluate the effect of overexpression of human derived a-synuclein on the neurite morphology.MethodsStable N2a cell lines overexpressed human derived α-synuclein were established. Contact and non-contact culture methods were used to investigate the transfer of human derived α-synuclein in vitro. The length of neurite was measured during overexpression of human derived α-synuclein.ResultsThe transfer of α-synuclein could be observed through the contact culture and non-contact culture. However，the efficiency of α-synuclein transfer was low in vitro. Additionally，high expression of human derived α-synuclein inhibited the neurite growth.ConclusionA little of human derived α-synuclein transfers from cell to cell in vitro. Over expression of human derived α-synuclein damages the neurite.

Keywords： Human derived α-synuclein； Prion-like transfer； Neurite

蛋白錯誤折疊及在細(xì)胞或/組織內(nèi)聚集，參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。其中，α-synuclein過表達(dá)及其在腦內(nèi)聚集形成的包涵體，或路易小體是帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的關(guān)鍵病理[1，2]。α-synuclein的聚集對神經(jīng)細(xì)胞突起的生長、突觸形成、遞質(zhì)釋放及細(xì)胞代謝產(chǎn)生多方面影響[3～5]，針對α-synuclein聚集過程、分子機(jī)制及有效降解的研究形成了PD發(fā)病、預(yù)防及治療的關(guān)鍵思路[6，7]。但近年有研究發(fā)現(xiàn)α-synuclein具有Prion樣特性，能夠從最初產(chǎn)生的腦區(qū)向其他腦區(qū)轉(zhuǎn)移，并在新的腦區(qū)產(chǎn)生聚集，形成新的病理樣包涵體[8～10]。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一現(xiàn)象是否穩(wěn)定存在、α-synuclein轉(zhuǎn)移的比例及其對細(xì)胞突起的影響，我們通過構(gòu)建過表達(dá)人源α-synuclein的質(zhì)粒載體，并以EGFP作為報(bào)告基因，利用接觸和非接觸培養(yǎng)兩種模式觀察α-synuclein轉(zhuǎn)移情況，并初步定量其轉(zhuǎn)移效率，在此基礎(chǔ)上研究了α-synuclein過表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞突起的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 GV230載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小抽試劑盒(柱型)購自天根生化科技有限公司；Attractene Transfection Reagent購自QIAGEN公司；X-tremeGENE 9 Transfection Reagent購自Roche公司；MTT購自北京索萊寶科技有限公司；G418購自InvitroGen公司；Anti-α-Synuclein antibody購自Sigma公司；QtrackerR 655 Cell Labeling Kit購自Thermo Fisher公司；DMEM培養(yǎng)基(粉末)購自Sigma公司；小牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) N2a(小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2，DMEM培養(yǎng)基(添加10%小牛血清+1%Gln+1%青霉素/鏈霉素)，傳代培養(yǎng)。

1.3 載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、G418分選、蛋白表達(dá)分析

1.3.1 載體構(gòu)建 正常人SNCA基因過表達(dá)載體的構(gòu)建由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司協(xié)助完成，主要步驟：GV230載體(見圖1A)克隆位點(diǎn)雙酶切；PCR擴(kuò)增SNCA基因片段，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶；將PCR產(chǎn)物與線性化載體DNA連接后，立即加入至感受態(tài)細(xì)胞(Top10)中轉(zhuǎn)化；最后對Top10菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將鑒定出的陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種培養(yǎng)后測序，確定與目標(biāo)序列一致。GV230-SNCA-EGFP過表達(dá)質(zhì)粒的Top10甘油菌菌株，保存于-80 ℃。

1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按1.5×105個/ml的密度將N2a接種于24孔板，接種24 h后，分別用Attractene 轉(zhuǎn)染試劑和X-tremeGENE 9 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染48 h后觀察，發(fā)現(xiàn)Attractene 轉(zhuǎn)染后的N2a細(xì)胞變圓，并且部分漂浮，X-tremeGENE 9 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞狀態(tài)良好，最后選用X-tremeGENE 9，并確定X-tremeGENE 9(μl)與DNA(μg)按照4.5∶1的比例作用于N2a時轉(zhuǎn)染效率最高，且對細(xì)胞損傷較小。

1.3.3 G418篩選 利用載體的新霉素抗性，采用G418篩選陽性細(xì)胞克隆。按1×104個/ml細(xì)胞密度將N2a接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，更換為含不同濃度G418的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中G418終濃度設(shè)置：0 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml、500 μg/ml、600 μg/ml、700 μg/ml、800 μg/ml、900 μg/ml、1000 μg/ml)，之后2 d更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)加壓培養(yǎng)14 d后，MTT法(設(shè)置3重復(fù))檢測細(xì)胞存活率。最終確定G418的篩選濃度為500 μg/ml。按1.5×105個 /ml細(xì)胞密度將N2a接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，采用X-tremeGENE 9轉(zhuǎn)染試劑將空載體和目的載體(含SNCA-EGFP基因)分別轉(zhuǎn)入N2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后更換為含500 μg/ml G418的完全培養(yǎng)基，加壓篩選14 h，可得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞。之后用含250 μg/ml G418的完全培養(yǎng)基將其擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 人源α-synuclein表達(dá)水平鑒定 采用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染了空載體的N2a細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了含SNCA-EGFP基因載體的N2a細(xì)胞中α-synuclein-EGFP融合蛋白的表達(dá)情況，確定α-synuclein穩(wěn)定表達(dá)。

1.4 基于Millicell小室的非接觸培養(yǎng)模式評價α-synuclein轉(zhuǎn)移 將普通N2a細(xì)胞作為受體細(xì)胞，接種于24孔板；篩選的穩(wěn)定表達(dá)人源α-synuclein的N2a細(xì)胞作為供體細(xì)胞，接種于Millicell小室中(見圖2A)。Millicell培養(yǎng)小室購自Millipore公司。選擇能與24孔板相匹配、孔徑為0.4 μm的Millicell培養(yǎng)小室，可保證在共培養(yǎng)過程中，細(xì)胞不會通過室膜。共培養(yǎng)24 h后觀察。10倍物鏡下隨機(jī)選取9個視野，計(jì)數(shù)100個受體細(xì)胞中出現(xiàn)α-synuclein-EGFP的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 基于Qtracker? 655 Cell Labeling的接觸培養(yǎng)模式評價α-synuclein轉(zhuǎn)移 將Qtracker? 655 Cell Labeling Kit標(biāo)記后的N2a細(xì)胞作為受體細(xì)胞，篩選的穩(wěn)定表達(dá)人源α-synuclein的N2a細(xì)胞作為供體細(xì)胞，兩種細(xì)胞按照1∶1的比例共同接種于24孔板中(見圖3A)。共培養(yǎng)24 h后觀察。10倍物鏡下隨機(jī)選取9個視野，計(jì)數(shù)100個受體細(xì)胞中出現(xiàn)α-synuclein-EGFP的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 α-synuclein高表達(dá)對N2a細(xì)胞突起的影響及評價 穩(wěn)定表達(dá)人源α-synuclein的N2a細(xì)胞以及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞，24孔板培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下拍照，每個孔在20倍物鏡下隨機(jī)選取9個視野，每個視野下測定3個細(xì)胞的突起長度，每組各測量了27個細(xì)胞的突起長度。

2 結(jié) 果

2.1 α-synuclein質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)水平分析 質(zhì)粒DNA抽提，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果可見對照質(zhì)粒和攜帶目標(biāo)基因的質(zhì)粒DNA大小符合預(yù)期(見圖1A和圖1B)。經(jīng)G418篩選后的N2a細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，穩(wěn)定表達(dá)EGFP(見圖1C-1D)。收集細(xì)胞，經(jīng)Western Blot鑒定，目標(biāo)質(zhì)粒表達(dá)人源性α-synuclein水平較高，對照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無人源性α-synuclein表達(dá)(見圖1G)。

2.2 基于Millicell小室的非接觸培養(yǎng)條件下α-synuclein細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的定性與定量 表達(dá)人源α-synuclein的N2a細(xì)胞株作為供體細(xì)胞，培養(yǎng)于小室內(nèi)，未經(jīng)處理的普通N2a細(xì)胞作為受體細(xì)胞，培養(yǎng)于小室下層，共培養(yǎng)24 h。受體細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)出現(xiàn)EGFP標(biāo)記的細(xì)胞，可見受體細(xì)胞中部分細(xì)胞被EGFP熒光標(biāo)記(見圖2B和圖2C)，定量分析9個視野下，100個細(xì)胞，出現(xiàn)α-synuclein轉(zhuǎn)移的細(xì)胞比例為5%(見圖2D)。

2.3 接觸培養(yǎng)條件下a-synuclein細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的定性與定量 表達(dá)人源α-synuclein的N2a細(xì)胞株作為供體細(xì)胞，Qtracker? 655 染色的普通N2a細(xì)胞作為受體細(xì)胞，首先觀察Qtracker? 655 染色的細(xì)胞形態(tài)，加入Qtracker? 655 培養(yǎng)24 h后，明場下可見細(xì)胞形態(tài)正常(見圖3B)，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒(見圖3C)，類似囊泡形態(tài)特征。兩株細(xì)胞1∶1比例混合培養(yǎng)24 h，于熒光顯微鏡下觀察Qtracker? 655 和EGFP共標(biāo)記細(xì)胞，結(jié)果可見部分細(xì)胞內(nèi)Qtracker? 655 紅色熒光和EGFP的綠色熒光共定位(見圖3D和圖3E)。對9個視野下，100個細(xì)胞觀察定量，出現(xiàn)α-synuclein轉(zhuǎn)移比例為7%(見圖3F)。

2.4 α-synuclein高表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞突起的影響 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的N2a細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，可見細(xì)胞突起生長良好(見圖4A)，表達(dá)人源性α-synuclein的N2a細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，可見細(xì)胞突起生長緩慢，變短(見圖4B)，每組通過測量27個細(xì)胞的突起，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖4C，P<0.05)。

A：質(zhì)粒圖譜及SNCA基因插入位點(diǎn)；B：空質(zhì)粒及攜帶SNCA基因的質(zhì)粒DNA鑒定；C、D：G418篩選的空質(zhì)粒對照組N2a細(xì)胞培養(yǎng)24 h后明場下細(xì)胞形態(tài)(C)及同一視野下熒光顯微鏡顯示的細(xì)胞形態(tài)(D)；E、F：G418篩選的穩(wěn)定表達(dá)α-synuclein的N2a細(xì)胞培養(yǎng)24 h后明場下細(xì)胞形態(tài)(E)及同一視野下熒光顯微鏡顯示的細(xì)胞形態(tài)(F)，10倍物鏡下拍照；G：WB技術(shù)檢測α-synuclein表達(dá)水平，對照組無α-synuclein表達(dá)，目標(biāo)基因組α-synuclein呈高表達(dá)

圖1 α-synuclein質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)水平分析

A：基于Millicell小室的非接觸培養(yǎng)模式圖；B、C：培養(yǎng)24 h后，觀察受體細(xì)胞內(nèi)EGFP標(biāo)記的細(xì)胞，B為明場下的細(xì)胞形態(tài)，C為同一視野下熒光顯微鏡顯示的細(xì)胞形態(tài)，黑色箭頭示意EGFP標(biāo)記的細(xì)胞，20倍物鏡下拍照；D：統(tǒng)計(jì)顯示α-synuclein轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的比例(n=3)

圖2 非接觸培養(yǎng)下α-synuclein轉(zhuǎn)移分析

A：接觸性培養(yǎng)模式圖；B、C：Qtracker? 655 細(xì)胞染色形態(tài)，B為明場下細(xì)胞形態(tài)，C為同一視野下熒光顯微鏡顯示的細(xì)胞形態(tài)，20倍物鏡下拍照；D、E：接觸培養(yǎng)后24 h代表性圖片，D為紅色熒光下可見Qtracker? 655 染色，E為共標(biāo)記的細(xì)胞，白色箭頭示Qtracker? 655 染色細(xì)胞，藍(lán)色箭頭示EGFP標(biāo)記細(xì)胞，紅色箭頭示共標(biāo)記細(xì)胞，20倍物鏡下拍照；G：統(tǒng)計(jì)顯示α-synuclein轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的比例n=3

圖3 接觸培養(yǎng)下α-synuclein轉(zhuǎn)移分析

A：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞突起形態(tài)代表圖；B：SNCA高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞形態(tài)圖，20倍物鏡下拍照；C：兩組細(xì)胞突起長度測量結(jié)果*P<0.05，n=27

圖4 α-synuclein高表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞突起的影響

3 討 論

α-synuclein蛋白是一個天然非折疊蛋白，它的N-末端易形成α螺旋結(jié)構(gòu)從而和磷脂結(jié)合，表現(xiàn)出膜結(jié)合特性。此外，a-synuclein易形成寡聚體，進(jìn)一步聚集，從而出現(xiàn)β片層和纖維化構(gòu)象[11]。α-synuclein可以由神經(jīng)元及其他細(xì)胞分泌，在血液及腦脊液中也發(fā)現(xiàn)了α-synuclein的單體和寡聚體結(jié)構(gòu)[12，13]。神經(jīng)元內(nèi)的α-synuclein主要分布于軸突末端，似乎和遞質(zhì)囊泡的循環(huán)有關(guān)[14，15]，但更多有關(guān)α-synuclein的生理作用目前尚不清楚。

首次發(fā)現(xiàn)α-synuclein在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的證據(jù)來自于PD患者去世后的腦結(jié)構(gòu)分析，這些患者在去世的11～22年前曾做過胎兒中腦神經(jīng)元移植手術(shù)，目的希望能夠補(bǔ)償患者中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的丟失。在患者移植的神經(jīng)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了路易小體，而在其非移植區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了路易小體的存在，這意味著移植神經(jīng)元內(nèi)的路易小體可能來自于患者自身的神經(jīng)元[16～19]。該發(fā)現(xiàn)提出了一個極為重要的問題，α-synuclein及其構(gòu)成的路易小體是否可以從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞?？赡艿募僬f是，由宿主細(xì)胞分泌的α-synuclein出現(xiàn)錯誤折疊，從而形成寡聚體、并聚集形成纖維化結(jié)構(gòu)，從而向其他神經(jīng)元擴(kuò)散，在其他神經(jīng)元內(nèi)形成路易小體的病理特征，該假說經(jīng)過Braak及其同事的工作，再次得到部分驗(yàn)證，他們的研究發(fā)現(xiàn)家族遺傳性PD患者中，α-synuclein可以從周圍神經(jīng)、胃腸道神經(jīng)及嗅球向腦的特定部位轉(zhuǎn)移[20，21]。但依然無法證明α-synuclein從一個神經(jīng)元向另一個神經(jīng)元轉(zhuǎn)移的動態(tài)過程及轉(zhuǎn)移機(jī)制。

α-synuclein轉(zhuǎn)移的先決條件是什么？是否一定伴隨構(gòu)象的改變，出現(xiàn)何種構(gòu)象。在轉(zhuǎn)移過程中需要哪些分子參與，目前這些問題尚沒有答案。因此我們試圖建立人源α-synuclein轉(zhuǎn)移的細(xì)胞模型，希望在此模型上研究α-synuclein轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，及其在PD病理中的作用。

從我們目前的結(jié)果看，接觸培養(yǎng)和非接觸培養(yǎng)均能觀察到α-synuclein轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但轉(zhuǎn)移比例比較低，尚無法判斷轉(zhuǎn)移比例低的原因是否因?yàn)橐吧挺?synuclein不易形寡聚體。同時因?yàn)樵诩?xì)胞系上開展的實(shí)驗(yàn)，可能細(xì)胞的耐受程度要大于原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞。其次，我們無法確定轉(zhuǎn)移的α-synuclein是否就是寡聚體或是纖維化形式。盡管α-synuclein在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移效率比較低，但依然可見過表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞突起縮短，表現(xiàn)出失營養(yǎng)性改變。這可能意味著α-synuclein過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，代謝異常，損傷后的細(xì)胞無法降解α-synuclein，通過胞吐釋放到細(xì)胞外，這也可能是α-synuclein轉(zhuǎn)移的途徑。進(jìn)一步工作準(zhǔn)備在培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞上，觀察野生型和突變型α-synuclein轉(zhuǎn)移的差別，建立更為可靠的細(xì)胞模型，開展此研究。

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Transferofhumanderivedα-synucleinacrosscelltocellandeffectsonneurite

WANGQingjun，JINGYuhong，CHENHaichao，etal.

(InstituteofBiochemistryandMolecularBiology，SchoolofBasicMedicalSciences，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China)

1003-2754(2017)09-0772-05

2017-07-10；

2017-09-01

國家自然科學(xué)基金(No. 81570725)；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題(GZK-2014-81)

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000)

高麗萍，E-mail：gaolp@lzu.edu.cn

R742.5

A