張濤

摘 要：將草魚放入網(wǎng)箱中，在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同劑量的酵母多糖、殼聚糖和甘草酸后，進(jìn)行投喂，研究其對草魚血清中菌酶（LSZ）、過氧化氫酶（CAT）及補(bǔ)體C3活性的影響。結(jié)果表明：投喂添加中藥免疫添加劑的飼料49 d 后，與對照組比較，酵母多糖添加劑各組、殼聚糖高劑量組草魚血清LSZ活性顯著提高（P<0.05）；酵母多糖低劑量組、中劑量組和殼聚糖高劑量組草魚血清CAT含量顯著提高（P<0.05）；酵母多糖中劑量組草魚血清補(bǔ)體C3活性顯著提高（P<0.05），說明中藥免疫添加劑對增強(qiáng)草魚免疫活性具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：中藥免疫添加劑；草魚；LSZ；CAT；補(bǔ)體C3

草魚俗稱鯇魚、鯇，東北俗稱草根子，屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，草魚屬，為中國東部廣西至黑龍江等平原地區(qū)特有經(jīng)濟(jì)魚類；其生長迅速，飼料來源廣，肉質(zhì)鮮美，是中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一。近年來，隨著我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，人工養(yǎng)殖草魚受到水環(huán)境、飼料及養(yǎng)殖管理等條件變化因素影響，常常發(fā)生疾病而造成大量死亡，嚴(yán)重?fù)p害了我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，研制草魚免疫添加劑，促進(jìn)魚體的疾病抵抗能力，對人工養(yǎng)殖草魚技術(shù)的發(fā)展具有極其重要的意義。

免疫添加劑因?yàn)榫哂懈咝?、毒副作用少、無污染等特點(diǎn)，是抗生素和化學(xué)藥物的最佳替代品，因此受到水產(chǎn)工作者的親睞。近年來，由國內(nèi)外的研究報(bào)道可知，水產(chǎn)動物飼料中添加免疫添加劑可促進(jìn)水產(chǎn)動物體的非特異性免疫指標(biāo)的提高[1-5]，從而增強(qiáng)水生動物的免疫能力；曹振杰等[6]在草魚飼料中添加不同劑量的免疫多糖明顯增強(qiáng)了魚體的免疫能力，提高了SOD活力。本試驗(yàn)中，在草魚的飼料中添加3種不同的免疫添加劑飼喂草魚，并通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析草魚血清中的幾種非特異性免疫指標(biāo)，其目的是考察草魚的飼料添加劑能否有效提高草魚非特異性免疫指標(biāo)，從而增強(qiáng)草魚抵抗疾病的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法與飼料

在草魚的基礎(chǔ)飼料中分別添加相同濃度梯度的酵母多糖、殼聚糖和甘草酸，濃度梯度分別設(shè)計(jì)為0.22%、0.44%、0.66%，共9試驗(yàn)組，一個對照組，每組設(shè)3個重復(fù)。飼料配制時，飼料原料經(jīng)粉碎過40目篩后，制得3 mm顆粒，草魚基礎(chǔ)飼料配方見表1。

1.2 試驗(yàn)用魚及養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)草魚平均體重97.6±5.2 g，購自遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院試驗(yàn)場，暫養(yǎng)后挑取相同規(guī)格的健康草魚750尾，隨機(jī)分為10組，每組3個平行，即1個對照組和9個試驗(yàn)組，共計(jì)30個網(wǎng)箱，網(wǎng)箱大小為1.2 m×0.6 m×1.2 m，放在8.5 m×1.6 m×8.5 m的水泥池塘中，每個網(wǎng)箱隨機(jī)放入25尾草魚。

試驗(yàn)期間水溫26±2 ℃，每天在7∶00、12∶00、17∶00投喂飼料，投飼量為魚體重的4%，連續(xù)充氧，每日排污和換水各一次，共計(jì)49 d；其中，養(yǎng)殖水體NH+4-N<0.5 mg/L ，pH（7.4±0.3），DO≥6 mg/L。

1.3 血清免疫指標(biāo)的測定

試驗(yàn)結(jié)束后，從每個試驗(yàn)箱中取6尾草魚，尾靜脈采血，3 000～5 000 r/min 離心 8 min，取血清于5 ml離心管中備用。溶菌酶（LSZ）、過氧化氫酶（CAT）、補(bǔ)體C3活性均采用由南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的試劑盒的測定方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS14.0在a=0.05水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析后，進(jìn)行Duncans 多重比較統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 三種免疫添加劑對草魚血清溶菌酶（LSZ） 活性的影響

由表2和圖1可知，草魚血清溶菌酶（LSZ）活性由高到低依次為酵母多糖中劑量組、酵母多糖低劑量組、殼聚糖高劑量組、酵母多糖高劑量組、殼聚糖中劑量組、殼聚糖低劑量組與甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組、甘草酸低劑量組；其中，酵母多糖添加劑各組、殼聚糖高劑量組與對照組比較，草魚血清LSZ活性均顯著提高（P<0.05）；其他各組與對照組比較差異不顯著（P>0.05），只有甘草酸低劑量組草魚血清LSZ活性略低于對照組。

2.2 三種免疫添加劑對草魚血清CAT活性的影響

由表2和圖2可知，酵母多糖低劑量組、中劑量組和殼聚糖高劑量組草魚血清CAT含量顯著高于對照組（P<0.05），其余各組與對照組比較差異不顯著（P>0.05），只有甘草酸低劑量組與高劑量組草魚血清CAT略低于對照組。

2.3 三種免疫添加劑對草魚血清補(bǔ)體C3活性的影響

由表2和圖3可知，酵母多糖中劑量組草魚血清補(bǔ)體C3活性顯著高于對照組（P<0.05），其余各試驗(yàn)組與對照組比較呈不顯著差異（P>0.05），只有甘草酸低劑量組草魚血清補(bǔ)體C3活性略低于對照組。

3 討論

魚類作為低等脊椎動物，其非特異性免疫功能具有抵抗外來病原入侵的主要作用[7-9]。

溶菌酶（LSZ）是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶（LSZ）作用機(jī)理主要是通過對菌體細(xì)胞壁進(jìn)行破壞而使不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致菌體細(xì)胞壁破裂，胞壁里內(nèi)容物質(zhì)逸出而使菌體溶解[10]。另外，溶菌酶可與病毒蛋白結(jié)合，并與RNA、DNA、脫輔基蛋白形成復(fù)合鹽，致使病毒失去活性。近些年研究發(fā)現(xiàn)，中草藥的免疫添加劑對水產(chǎn)動物L(fēng)SZ具有增強(qiáng)作用。胡宗云[11]等研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加硬葡聚糖在增強(qiáng)草魚血清溶菌酶（LSZ）活性方面效果更好；許國煥[12]等研究發(fā)現(xiàn)肽多糖能提高彭澤鯽血清溶菌酶活性；王樹芹[13]等在異育銀鯽飼料中添加0.5%或1.0%的殼聚糖能夠顯著提高溶菌酶活性（P<0.01），這與本研究添加0.66%殼聚糖的飼料能顯著提高草魚血清溶菌酶（LSZ）活性（P<0.05）相近；同時，本研究在飼料中添加了0.22%、0.44%、0.66%的酵母多糖后，草魚血清溶菌酶（LSZ）活性均顯著提高（P<0.05），這與李桂峰[14]等研究發(fā)現(xiàn)添加了0.5%和0.8%酵母多糖的飼料能顯著提高赤眼鱒溶菌酶活性（P<0.05）相近。endprint

過氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，可清除機(jī)體氧自由基，是生物防御體系的重要抗氧化物關(guān)鍵酶；當(dāng)魚類體內(nèi)過氧化氫酶（CAT）活性降低時，魚體內(nèi)自由基過多會使其代謝混亂、內(nèi)分泌失調(diào)、機(jī)體免疫能力下降等，從而使魚體易受到病原微生物入侵，最終導(dǎo)致魚體發(fā)病[15-16]。王洪斌[17]等研究發(fā)現(xiàn)日本蟳在注射海洋紅酵母多糖48 h后，其血清中的過氧化氫酶（CAT）提高35%；這與本試驗(yàn)中飼料在分別添加了0.22%、0.44%的酵母多糖后，草魚血清過氧化氫酶（CAT）活性顯著提高（P<0.05）相近。目前，關(guān)于魚類飼料中添加殼聚糖能夠使魚類血清CAT活性增高未見報(bào)道；但本試驗(yàn)中飼料在添加了0.66%的殼聚糖后，草魚血清過氧化氫酶（CAT）活性顯著提高（P<0.05）。補(bǔ)體C3是機(jī)體抵抗微生物入侵的重要組成部分，是一個具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)，并由多種具有酶活性的球蛋白構(gòu)成，其主要存在機(jī)體的血清、組織液中；當(dāng)該系統(tǒng)通過一定途徑被激活時，可發(fā)揮調(diào)理吞噬、裂解細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)等功能，這在魚類早期抗感染過程中發(fā)揮著重要作用[11]。李桂峰[14]等研究發(fā)現(xiàn)添加了0.5%和0.8%酵母多糖的飼料能顯著提高赤眼鱒補(bǔ)體C3水平（P<0.05）；這與本試驗(yàn)中飼料在添加了0.44%的酵母多糖后，草魚血清補(bǔ)體C3活性顯著提高（P<0.05）相近。于翔[18]等研究發(fā)現(xiàn)添加一定量殼聚糖的飼料能顯著提高草魚血清補(bǔ)體C3水平（P<0.05），這與本試驗(yàn)飼料添加了0.22%、0.44%、0.66%的殼聚糖后，草魚血清補(bǔ)體C3活性提高相近；但本試驗(yàn)提高補(bǔ)體C3水平不顯著（P>0.05）。

劉麗萍[19]等報(bào)道甘草酸是有效的免疫添加劑，其免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子、補(bǔ)體等多方面。而本研究在飼料中添加了 0.22%、0.44%和0.66%的甘草酸后，草魚血清溶菌酶（LSZ）、過氧化氫酶（CAT）、補(bǔ)體C3活性與對照組差異都不顯著（P>0.05），低劑量組的溶菌酶（LSZ）、過氧化氫酶（CAT）、補(bǔ)體C3活性甚至低于對照組，筆者認(rèn)為這是甘草酸并不能有效激活草魚血清中的溶菌酶（LSZ）、過氧化氫酶（CAT）、補(bǔ)體C3活性所致。

參考文獻(xiàn)：

[1]

Chen S C，Yoshida T，Adams A，et al.Non-specific immune response of Nile tilapia， Oreochromis nilotiea， to the extracellular products of Mycobacterium spp. and to various adjuvants[J].J Fish Dis，1998，21（1）：39-46.

[2] Dalmo R A，Seljelid R.The immunomodu1atory effect of LPS， laminaran and sulphated laminaran [β（1，3）-D-glucan] on Atlantic salmon， Salmo salar L.，macrophages in vitro[J].J Fish Dis，1995，18（2）：175-185.

[3] 胡兵，劉軍，侯永清，等.黃芪多糖對異育銀鯽非特異性免疫力的影響[J].水利漁業(yè)，2008，28（3）：108-111.

[4] 史會來， 樓寶， 胡則輝.中草藥飼料添加劑對真鯛（Pagrosomus major）幼魚生長和非特異性免疫的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，7（4）：548-551，556.

[5] 劉華忠，劉定忠，趙學(xué)明.復(fù)方中草藥對彭澤鯽非特異性免疫功能的影響[J].淡水漁業(yè)，2004，34（3）：31-32.

[6] 曹振杰，曲世科，叢日祥，等.免疫多糖對草魚免疫功能的影響[J].齊魯漁業(yè)，1999，16（3）：43-44.

[7] Marta Alonso，Jo- Ann Leong.Suppressive subtraction libraries to identify interferon- inducible genes in fish[J].Marine Biotechnology，2002，4：74-80.

[8] Fletcher T C.Modulation of nonspecific host defense in fish[J].Vet Immunol I mmunopthol，1986，12（1-4）：59-67.

[9] 韓璐，王彥波，王瓊萍，等.細(xì)菌多糖對羅非魚血清免疫功能影響的研究[J].飼料工業(yè)，2009，30（10）：22-24.

[10] 汪成竹，姚鵑，吳凡，等.免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）對中華鱉非特異性免疫功能的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，8（6）：421-425.

[11] 胡宗云，宋文華，富麗靜，等.金絲桃素、綠原酸和硬葡聚糖對草魚非特異性免疫功能的影響[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2014，27（1）：41-45.

[12] 許國煥，吳月嫦，陶家發(fā).兩種多聚糖對彭澤鯽生長影響及免疫促進(jìn)作用的初步研究[J].水利漁業(yè)，2002，22（4）：49-51.

[13] 王樹芹，周洪琪.殼聚糖對異育銀鯽溶菌酶和白細(xì)胞吞噬活性的影響[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，13（2）：121-125.

[14] 李桂峰，康裕財(cái)，孫際佳，等.酵母多糖對赤眼鱒非特異性免疫機(jī)能的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003（4）：55-58.

[15] 李嬋，徐奇友，許紅，等.幾種飼料添加劑對虹鱒（Oncrhynchus mykiss Walbaum）免疫活性和抗氧化能力的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35（3）：456-461.

[16] 周進(jìn)， 黃倢， 宋曉玲.免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].海洋水產(chǎn)研究，2003，24（4）：70-79.

[17] 王洪斌，李士虎，閻斌倫.海洋紅酵母多糖提取及其對日本蟳血清中部分免疫活性因子的影響[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011， 38（2）：176-180.

[18] 于翔，李赫，宋文華，等.三種免疫添加劑對草魚非特異性免疫功能的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2011， 32（7）：38-43.

[19] 劉麗萍，任翠愛，趙宏艷.甘草酸的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010， 16（6）：272-276.endprint