劉金霞

摘 要：研究不同濃度的Cu²⁺對(duì)鯽魚(yú)過(guò)氧化物同工酶表達(dá)的影響。用四個(gè)不同濃度梯度的硫酸銅溶液飼養(yǎng)鯽魚(yú)，處理4 d后，使用聚丙烯凝膠垂直平板電泳法，研究不同濃度的Cu²⁺對(duì)鯽魚(yú)肝臟、鰓過(guò)氧化物同工酶的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的Cu²⁺都有可能使肝臟、鰓組織過(guò)氧化物同工酶帶強(qiáng)弱發(fā)生較明顯的變化，并且對(duì)其組織過(guò)氧化物同工酶的影響顯現(xiàn)出一定的組織差異性，在一定量的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出應(yīng)激性，可以說(shuō)，低劑量的銅離子可以誘導(dǎo)酶活性的提高。

關(guān)鍵詞：銅離子；鯽魚(yú)；過(guò)氧化物同工酶

對(duì)于生物而言，毒物與毒性是兩個(gè)不同而又相關(guān)的概念，表現(xiàn)出毒性的物質(zhì)，不能統(tǒng)統(tǒng)稱為毒物，毒物也只在一定濃度、一定接觸時(shí)間后才顯出毒性，有的甚至還是生物不可缺少的微量元素，銅就是這種情況[1]。銅離子（Cu²⁺）在濃度較低時(shí)可提高抗氧化酶的活性；而在濃度較高時(shí)，會(huì)降低抗氧化酶的活性，從而使Cu²⁺變成一種抑制劑或有毒制劑[1]，因此，研究、探討Cu²⁺對(duì)水生動(dòng)物的影響十分必要。

Cu²⁺被魚(yú)體吸收后，一部分通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)各組織器官，可能影響鯽魚(yú)各組織內(nèi)的過(guò)氧化物同工酶的活性，過(guò)氧化物同工酶（POD）是細(xì)胞中的一組重要的抗氧化酶，它們存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體內(nèi)，以鐵卟啉為輔基，可催化活性氧中的過(guò)氧化氫氧化[1]。同工酶是基因表達(dá)后分子水平的表型，測(cè)定同工酶譜是了解基因存在和表達(dá)的重要工具。

本研究以鯽魚(yú)作為研究對(duì)象，通過(guò)聚丙烯凝膠垂直平板電泳法來(lái)觀察過(guò)氧化物同工酶的表型，采用生態(tài)學(xué)單因子梯度實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)鯽魚(yú)的過(guò)氧化物酶的表型進(jìn)行觀察研究。以期探討Cu²⁺對(duì)魚(yú)類的毒害機(jī)制以及與水體中的Cu²⁺濃度的相關(guān)性。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)

鯽魚(yú)：健康，體表無(wú)損傷，體型勻稱，體長(zhǎng)8～10 cm。將購(gòu)買回來(lái)的鯽魚(yú)放在之前準(zhǔn)備的、曝曬之后的自來(lái)水中預(yù)飼養(yǎng)，并投喂一定的魚(yú)食，一天后染毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及其配制

硫酸銅（分析純）：使用前先配成10 g/L的母液，使用時(shí)稀釋成所需要的濃度。

分離膠緩沖溶液（pH 8.9）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris36.8 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

濃縮膠緩沖溶液（pH 6.7）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris5.96 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

凝膠貯備液：丙烯酰胺 58 g，雙丙烯酰胺 2 g，加蒸餾水溶解，定容至200 mL。存放于4 ℃棕色瓶避光保存。

10%過(guò)硫酸銨溶液：1 g過(guò)硫酸銨溶于10 mL蒸餾水中（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

電極緩沖液pH 8.3：Tris 6 g，甘氨酸28.8 g用蒸餾水定容至1 000 mL。用時(shí)稀釋10倍。

上樣緩沖液：濃縮膠緩沖液10 mL，甘油（丙三醇）5 g，1%溴酚蘭1 mL。

7%冰乙酸：取7 mL冰乙酸加水至100 mL容量瓶中定容。

染色劑：聯(lián)苯胺0.1 g+無(wú)水乙醇15 mL（提前配好）、15 mol/L乙酸鈉10 mL、1.5 mol/L冰乙酸10 mL、蒸餾水75 mL混勻。

PBS緩沖液pH 7.0： 取母液①32 mL和母液②68 mL混合即可。

母液的配制：① 0.2M Na2HPO4：稱取 71.6 g Na2HPO4-12H2O，溶于 1 000 mL 水

② 0.2M NaH2PO4：稱取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于1000 mL 水

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材

臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電子天平、HHS-2S型電熱恒溫水浴鍋、DYCZ-24D 雙垂直電泳儀、FD201 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳、電子稱、分析天平、托盤(pán)天平、移液槍（5 mL、1 mL、200 μL）、增氧泵、微量加樣器

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鯽魚(yú)的染毒實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)4 d后，挑選體格鍵壯，規(guī)格一致的鯽魚(yú)進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在塑料水族箱中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用水為曝氣24 h以上的自來(lái)水，每個(gè)水族箱中加入 40 L 含有 不同濃度Cu²⁺的溶液。實(shí)驗(yàn)分 4 個(gè)濃度處理組，Cu²⁺濃度分別為0.000 mg/L、0.008 mg/L、0.016 mg/L、0.032 mg/L，并配有平行組。每一水族箱中放實(shí)驗(yàn)魚(yú)20尾，實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫保持在15～20 ℃，實(shí)驗(yàn)期間停止喂食，并用充氣泵連續(xù)不斷的充氣。

2.2 粗酶液的制備

Cu²⁺處理3 d后，從每個(gè)處理組中隨機(jī)抽取健康鯽魚(yú) 3尾，在冰盤(pán)內(nèi)迅速解剖，分別取鰓和肝胰臟，用吸水紙吸去組織液后稱重，并按 1∶1（W/V）比例加入預(yù)冷的提取液（0.1 mol/L pH 7.0 PBS），分別于冰浴中研磨成勻漿。勻漿后經(jīng) 12 000 r/min，4 ℃條件下離心 20 min 制成粗酶液，于-20 ℃條件下保存。

2.3 電泳待測(cè)酶液的制備

電泳前，將已制備好的各組粗酶液與電泳上樣緩沖液按 1∶1（V/V）混勻，后直接進(jìn)行電泳。

2.4 過(guò)氧化物同工酶電泳實(shí)驗(yàn)

2.4.1 電泳方法 POD同工酶電泳采用不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）垂直平板電泳，7%分離膠（pH 8.9） 和 3%濃縮膠（pH 6.7），電極緩沖液為Tris- Gly（pH 8.3）。用50μL的微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣量，點(diǎn)樣量 20 μL/孔。電泳開(kāi)始時(shí)電流恒定在每塊板10 mA，當(dāng)溴酚蘭指示劑完全進(jìn)入分離膠時(shí)，電流改為每塊板20 mA，當(dāng)溴酚蘭指示劑電泳至凝膠底端大約0.5 cm時(shí)，停止電泳，小心地將凝膠片分離，以備染色。電泳過(guò)程約5 h。電泳水環(huán)境溫度為 4 ℃。endprint

2.4.2 染色并固定 將制好的凝膠片做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，用蒸餾水沖洗數(shù)次，然后加過(guò)氧化氫溶液5～6滴，再加染色液染色，輕輕振搖 ，觀察顏色變化。然后把染色液倒掉，放在7%的乙酸中固定。

2.4.3 結(jié)果記錄及酶譜分析 染色結(jié)束后對(duì)凝膠片進(jìn)行拍照留存。隨后，按照酶帶的遷移距離及染色深淺，參考拍攝的照片，繪制出酶譜示意圖。把向距離陰極最近的酶帶進(jìn)行編號(hào)為1，且按照從陰極至陽(yáng)極的順序依次編號(hào)，并計(jì)算其相對(duì)遷移率（Rf值）。

相對(duì)遷移率的計(jì)算方法如下：

相對(duì)遷移率（Rf）=電泳條帶移動(dòng)距離（cm）/ 染料移動(dòng)距離（cm）

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 電泳圖片及Rf計(jì)算

不同濃度的Cu²⁺處理3 d后鯽魚(yú)肝胰臟及鰓組織POD同工酶電泳圖譜如圖1。圖1左側(cè)為鯽魚(yú)肝胰臟及鰓的POD同工酶電泳酶譜，右側(cè)為模式圖。 酶譜中各酶帶從負(fù)極到正極按POD1、POD2、POD3、POD4和POD5命名。酶譜中各酶帶Rf見(jiàn)表1。

不同濃度的Cu²⁺處理后POD同工酶在鯽魚(yú)肝胰臟和鰓兩種組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表2。從表2可以看出，POD同工酶的表達(dá)具有明顯的組織特異性，鯽魚(yú) POD 同工酶電泳酶譜共檢測(cè)出五條酶帶，兩種不同組織中的 POD 酶帶數(shù)量及顏色的深淺都表現(xiàn)出差別。鰓組織中檢測(cè)出POD-1、POD-2 、POD-4和POD-5四條酶帶，而在肝組織中只檢測(cè)出POD-1、POD-2 和POD-3三條酶帶。其中POD-2顏色最深，其與POD-1在兩種組織中都有表達(dá)。

（從左至右編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8，其對(duì)應(yīng)濃度分別為1號(hào)和5號(hào)：0.032 mg/L，2號(hào)和6號(hào)：0.016 mg/L，3號(hào)和7號(hào)0.008 mg/L，4號(hào)和8號(hào)為對(duì)照組即0.000 mg/L。其中1-4號(hào)為肝胰腺組織，5-8號(hào)為鰓組織）

3.2 數(shù)據(jù)分析與討論

過(guò)氧化物同工酶是一種活性較高的適應(yīng)性酶，在大部分動(dòng)植物體內(nèi)的各個(gè)組織內(nèi)都有所發(fā)現(xiàn)，由于該酶在逆境中適應(yīng)能力特別強(qiáng)，反應(yīng)十分敏感，因此該酶可以及早地反映出生物生長(zhǎng)發(fā)育的特性、體內(nèi)新陳代謝的狀態(tài)和對(duì)外界水環(huán)境不斷改變的適應(yīng)性。

通過(guò)酶帶數(shù)目和顏色的深淺進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)：POD-1和POD-2在肝胰腺和鰓組織同時(shí)都有表達(dá)，而POD-4和POD-5只有在鰓組織內(nèi)有表達(dá)。說(shuō)明不同組織間的過(guò)氧化物同工酶具有差異性。

相同組織間觀察，1-4號(hào)，隨著Cu²⁺的濃度升高到一定濃度，其過(guò)氧化物同工酶具有超強(qiáng)表達(dá)，濃度過(guò)高時(shí)反而具有抑制作用。

4 結(jié)論

正常情況下鯽魚(yú)不同組織間過(guò)氧化物同工酶具有明顯的差異性；肝組織過(guò)氧化物同工酶活性要大于鰓組織過(guò)氧化物同工酶活性；

同一組織中的過(guò)氧化物同工酶在不同濃度的Cu²⁺溶液中表現(xiàn)的活性是不一樣的，肝組織中的過(guò)氧化物同工酶隨著Cu²⁺濃度的升高，當(dāng)達(dá)到低濃度時(shí)活性會(huì)增強(qiáng)，達(dá)到中濃度甚至高濃度時(shí)，其酶的活性會(huì)受到抑制，甚至表達(dá)很微弱。

而鰓組織中的過(guò)氧化物同工酶隨著Cu²⁺濃度的升高時(shí)，在達(dá)到中濃度之前，其活性一直是增強(qiáng)的，濃度在升高時(shí)，酶的活性會(huì)變?nèi)酢?/p>

這種現(xiàn)象所反映的可能是鯽魚(yú)機(jī)體對(duì)重金屬離子毒害的一種抵抗力，或者稱之為適應(yīng)性。當(dāng)重金屬離子進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，動(dòng)物通過(guò)同工酶的改變?nèi)サ挚乖摱拘曰蛘呷ミm應(yīng)該逆境，使得動(dòng)物體得以生存。由此可見(jiàn)，Cu²⁺染毒引起鯽魚(yú)鰓部和肝臟的損害，而這種損害又與鯽魚(yú)體組織內(nèi)的過(guò)氧化物同工酶的改變有一定的聯(lián)系。其中過(guò)氧化物同工酶的變化在鯽魚(yú)Cu²⁺中毒過(guò)程中起著重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 湛江水產(chǎn)專科學(xué)校.淡水養(yǎng)殖水化學(xué)[M].北京 ：農(nóng)業(yè)出版社，1979.endprint