曾秀引, 周冬梅, 徐 軍, 楊 彬

(廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司, 東莞 523867)

BLI技術(shù)高通量測(cè)定抗體濃度的方法學(xué)建立

曾秀引, 周冬梅, 徐 軍, 楊 彬

(廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司, 東莞 523867)

驗(yàn)證了一種采用生物膜干涉技術(shù)(Bio-layer interferometry， BLI)快速高效高通量檢測(cè)抗體濃度的分析方法。主要采用Protein A生物傳感器，在溫度為30 ℃、樣品盤震搖速度為400 r/min、結(jié)合時(shí)間為2 min的條件下檢測(cè)，可以達(dá)到最佳的測(cè)定效果，并對(duì)專屬性、重復(fù)性、線性、準(zhǔn)確度進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明：抗體濃度在0.781～400 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度(包括分析重復(fù)性、中間精密度和日間精密度)相對(duì)偏差均小于2.5%，準(zhǔn)確度范圍在94.46%～114.00%之間，檢測(cè)限為0.781 μg/mL，定量限為1 μg/mL，檢測(cè)結(jié)果表明該方法可靠。此方法檢測(cè)速度快、通量高，特別適合用于單克隆抗體細(xì)胞株篩選階段大批量樣品的檢測(cè)與評(píng)估。

生物膜干涉技術(shù);單克隆抗體; 高通量篩選

AbstractThis research focused on the high throughout method for developing of antibody concentration detection based on the Bio-layer interferometry (BLI). The method gained the optimum efficiency with a 2 minutes binding on protein A sensor at a temperature of 30℃ and a shake speed of 400 r/min. The validation includes specificity, repeatability, accuracy and durability. The results showed that it fit a good linear relationship within an antibody concentration range of 0.781-400 μg/mL; relative deviations of repeatability including precision, intermediate precision and inter-day precision were below 2.5%. The accuracy ranged from 94.46% to 114.00%, the detection limit was 0.781 μg/mL and the limit of quantification was 1 μg/mL. The results certified the reliability of the method. The method can be used for detection of samples with a large scale benefitt from its high speed and throughout.

Keywordsbio-film interferometry(BLI); monoclonal antibody; high throughput

單克隆抗體藥物因具有生物靶向性、給藥周期長(zhǎng)、頻率低、毒副作用相對(duì)低等特點(diǎn)，成了理想的治療藥物[1]。單抗藥物在疾病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病[2]，近年來(lái)成為各大制藥公司的研究熱點(diǎn)。單抗藥物進(jìn)行質(zhì)量控制是研發(fā)和生產(chǎn)環(huán)節(jié)不可忽視的部分，單抗的質(zhì)量控制項(xiàng)目主要包括一般項(xiàng)目、理化項(xiàng)目、含量、鑒別、純度、活性和安全性等幾個(gè)方面[3-4]。

藥物含量測(cè)定，是質(zhì)量控制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。對(duì)于單克隆抗體藥物而言，含量的測(cè)定方法主要有幾種：紫外吸收法、ELISA法、protein A-HPLC法等。其中，紫外吸收法檢測(cè)快速、靈敏，但需要蛋白純度較高，線性范圍窄，雜蛋白和核酸會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果[5]。目前，蛋白A親和色譜法是常用的方法，該方法是通過(guò)Protein A結(jié)合抗體Fc端，在低pH值或者高pH值條件下洗脫，從而獲得抗體濃度[6-7]。此方法可特異性檢測(cè)抗體含量，結(jié)果準(zhǔn)確，線性范圍寬，認(rèn)知度高，但檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)，對(duì)樣品基質(zhì)要求較高，較適合用于抗體純化樣品和制劑樣品的含量檢測(cè)。ELISA法定量檢測(cè)抗體時(shí)，靈敏度高，對(duì)儀器要求低，但其實(shí)驗(yàn)用時(shí)較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，方法誤差大，線性范圍窄，適合用于微量抗體樣品檢測(cè)[1]。

生物膜干涉技術(shù)(Bio-layer interaction， BLI)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種分子相互作用技術(shù)。原理是通過(guò)在光纖制成的生物傳感器底端覆蓋生物分子相容層，固定相互作用分子中的一種，形成新的具有反應(yīng)特異性的生物膜層。當(dāng)與另一種分子接觸時(shí)，生物層厚度增加，反射光干涉光譜曲線產(chǎn)生可測(cè)量的漂移[8]。通過(guò)檢測(cè)這種位移變化來(lái)反映蛋白分子的濃度。該技術(shù)通量高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確[1,7]。該技術(shù)除廣泛應(yīng)用于抗體蛋白定量[1]、蛋白與蛋白[9]、蛋白與核酸[10]等間的相互作用，還應(yīng)用于多肽[11]、脂質(zhì)體[12]、病毒[13-14]和小分子[15]等方面的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

抗PD-1單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品和供試品(廣東東陽(yáng)藥業(yè)有限公司)；鹽酸、氫氧化鈉(成都科龍?jiān)噭┯邢薰?，分析?、甘氨酸(AMRESCO，分析純)；超純水由Millipore超純水儀制備。

Octet Qke生物分子相互作用儀、分析軟件及Protein A生物傳感器購(gòu)自PALL公司；sevenMultiS40 pH計(jì)購(gòu)自梅特勒托利多公司；單通道移液器購(gòu)自Eppendorf公司；萬(wàn)分之一分析天平購(gòu)自梅特勒托利多公司；離心機(jī)購(gòu)自SIGMA公司；96孔黑板購(gòu)自NUNC公司。

1.2 方法建立與優(yōu)化

BLI方法條件：儀器溫度設(shè)為30 ℃，震搖速度設(shè)為400 r/min，結(jié)合時(shí)間為120 s。實(shí)驗(yàn)前將傳感器置于10 mmol/L甘氨酸溶液中浸泡5 s，基質(zhì)溶液中浸泡5 s，重復(fù)3次，用于再生和平衡傳感器。在此基礎(chǔ)上對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，包括甘氨酸pH值、儀器溫度(30±2)℃、搖速(400±40)r/min和結(jié)合時(shí)間(2±1)min等方面。

1.3 方法驗(yàn)證

1.3.1 專屬性考察

抗PD-1抗體稀釋至20 μg/mL，將抗體溶液和基質(zhì)溶液分別加入96孔黑板中，按照建立的方法進(jìn)行檢測(cè)分析?？疾焐飩鞲衅鲗?duì)于基質(zhì)溶液是否存在非特異性吸附，是否對(duì)抗體含量檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

1.3.2 線性范圍

取抗PD-1抗體稀釋至400 μg/mL，依次倍比稀釋至0.781 μg/mL，加入96孔黑板中，每個(gè)濃度設(shè)定復(fù)孔，按照建立的方法進(jìn)行檢測(cè)分析。以抗PD-1抗體濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(Binding Rate)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍和最低檢測(cè)限。

1.3.3 精密度

1)分析重復(fù)性

取抗PD-1單抗稀釋至20 μg/mL，平行配制8份，加入96孔黑板中，設(shè)定復(fù)孔，按照建立的方法進(jìn)行檢測(cè)分析。根據(jù)1.3.2項(xiàng)下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品平均濃度，計(jì)算8份重復(fù)性樣品平均濃度RSD值。

2)日間精密度

同一實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間按上述1)項(xiàng)下平行配制8份精密度溶液，加入96孔黑板中，設(shè)定復(fù)孔，按照建立的方法進(jìn)行檢測(cè)分析。根據(jù)1.3.2項(xiàng)下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品平均濃度，計(jì)算8份重復(fù)性樣品平均濃度RSD值。

3)中間精密度

由另一實(shí)驗(yàn)人員操作， 按上述1)項(xiàng)下平行配制8份精密度溶液，加入96孔黑板中，設(shè)定復(fù)孔，按照建立的方法進(jìn)行檢測(cè)分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品平均濃度，計(jì)算8份精密度樣品平均濃度RSD值。

1.3.4 準(zhǔn)確度

分別取抗PD-1單抗標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，分別稀釋成低(1 μg/mL)、中(20 μg/mL)、高(400 μg/mL)3個(gè)濃度，并取對(duì)應(yīng)濃度按1∶1的體積比進(jìn)行混勻配制成準(zhǔn)確度溶液，每個(gè)濃度平行配制3份，按照建立的方法進(jìn)行檢測(cè)分析。根據(jù)1.3.2項(xiàng)下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)準(zhǔn)確度溶液濃度和回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法建立與優(yōu)化

甘氨酸的pH 1.70時(shí)，無(wú)法完全洗脫高濃度(200 μg/mL以上)抗體，導(dǎo)致檢測(cè)復(fù)孔中同一濃度抗體時(shí)結(jié)合率降低，見(jiàn)圖1。當(dāng)將甘氨酸pH值調(diào)節(jié)降低至1.20時(shí)，其對(duì)傳感器的洗脫能力明顯提高，檢測(cè)復(fù)孔同一濃度抗體的結(jié)合率高度一致，見(jiàn)圖2。因此實(shí)驗(yàn)選用pH 1.20的甘氨酸對(duì)傳感器進(jìn)行再生洗脫。

圖1 甘氨酸溶液pH 1.70時(shí)對(duì)傳感器的洗脫效果

圖2 甘氨酸溶液pH 1.20時(shí)對(duì)傳感器的洗脫效果

表1結(jié)果顯示，通過(guò)改變結(jié)合時(shí)間(2±1)min，所得3份平均濃度RSD為1.94%，結(jié)合時(shí)間對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，但為了保證不同濃度抗體與傳感器充分結(jié)合，實(shí)驗(yàn)選擇2 min為宜。通過(guò)改變儀器檢測(cè)溫度(30±2)℃，所得3份平均濃度RSD為17.57%，儀器溫度小于30℃時(shí)，樣品與傳感器生物膜層protein A結(jié)合率降低，所得濃度偏低，為了保持樣品的活性，實(shí)驗(yàn)選擇30℃作為檢測(cè)溫度；通過(guò)考察樣品盤震搖速度：(400±40)r/min，所得3份平均濃度RSD為9.18%，儀器搖速設(shè)置低于400 r/min時(shí)，樣品與傳感器無(wú)法充分接觸，使得檢測(cè)結(jié)果偏低，但為避免搖速過(guò)高會(huì)使孔中樣品外溢，因此實(shí)驗(yàn)選擇震搖速度為400 r/min。

表1其他條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 專屬性考察

單抗溶液產(chǎn)生結(jié)合信號(hào)，基質(zhì)溶液無(wú)結(jié)合信號(hào)，見(jiàn)圖3所示。表明基質(zhì)溶液與生物傳感器不存在非特異性吸附，因此對(duì)樣品檢測(cè)無(wú)干擾。

圖3 專屬性測(cè)定結(jié)果

2.3 線性范圍

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗體濃度在0.781～400 μg/mL范圍內(nèi)其結(jié)合信號(hào)與濃度(concentration，μg/mL)顯示出良好的線性擬合，擬合R2大于0.99，見(jiàn)圖4，檢測(cè)限為0.781 μg/mL。

圖4 Protein A傳感器與抗體結(jié)合的線性范圍

2.4 精密度

如表2所示，樣品分析重復(fù)性考察所得RSD為2.12%，中間精密度RSD為2.01%，日間精密度RSD為1.89%，表明此方法重復(fù)效果好。

表2 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確度

如表3所示，3個(gè)濃度點(diǎn)的平均回收率分別為114.00%、98.51%和94.46%，9份回收率RSD為8.90%，該方法加標(biāo)回收率好，準(zhǔn)確度較高，定量限為1 μg/mL。

表3 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

3 討論

運(yùn)用此法檢測(cè)單克隆抗體濃度，結(jié)果可靠，重復(fù)效果好(CV<2.5%)，準(zhǔn)確度高。在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合時(shí)間和pH值的微小改變不影響檢測(cè)結(jié)果；而儀器溫度和樣品盤震蕩速度的微小改變可能影響抗體活性及抗體蛋白分子與傳感器的充分接觸。因此利用此技術(shù)時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際條件選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)，以保護(hù)抗體活性，保證樣品與傳感器充分結(jié)合，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

本實(shí)驗(yàn)利用生物膜干涉技術(shù)，對(duì)抗體濃度進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量。儀器一次性可檢測(cè)8個(gè)樣品，用時(shí)僅3 min，檢測(cè)1000個(gè)樣品僅需7～8 h，檢測(cè)效率高，結(jié)果可靠，特別適用于樣品高通量篩選。從樣品處理方式對(duì)比，BLI技術(shù)對(duì)樣品基質(zhì)要求極低，相較于HPLC法和ELISA法更加簡(jiǎn)便，無(wú)干擾[1]。另外，protein A傳感器經(jīng)適當(dāng)?shù)脑偕捅４妫梢远啻沃貜?fù)使用，實(shí)驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)可至少重復(fù)使用120次，平均計(jì)算檢測(cè)一個(gè)樣品所需成本低于0.5元，從源頭上大大降低了實(shí)驗(yàn)成本?？傮w比較，該方法給抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)帶來(lái)了更多的選擇和便利。

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Assessment of a high throughout detection method of antibody concentration by bio-layer interference technique

ZENG Xiu-yin, ZHOU Dong-mei, XU Jun, YANG Bin

(Sunshine Lake Pharma Co.,Ltd， Dongguan 523867， China)

R319

B

2095-1736(2017)05-105-03

2016-11-08；

2016-11-07

廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(201101Y0104990178)

曾秀引，研究方向?yàn)樯镏扑帲珽-mail: zengxiuyin@hecpharm.com

楊 彬，碩士，研究方向?yàn)樯镏扑?，E-mail: YangBin@hecpharm.com

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.105