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(河南工業(yè)大學(xué),糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)

大豆主要過敏原β-伴大豆球蛋白β亞基的抗原表位分析及分段克隆

皮江一,席俊*,賀夢(mèng)雪,李爽

(河南工業(yè)大學(xué),糧油食品學(xué)院,河南鄭州450001)

利用生物信息學(xué)軟件SWISS-MODEL對(duì)大豆主要過敏原β-伴大豆球蛋白β亞基建立出三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,并根據(jù)DiscoTope 2.0服務(wù)器預(yù)測(cè)出該模型的構(gòu)象表位相關(guān)區(qū)段,采用分段克隆方式擴(kuò)增目的基因的3個(gè)片段區(qū)域,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因全長及3個(gè)互相重疊的片段(A、B、C)將其連接至pMD18-T載體,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)JM109。經(jīng)藍(lán)白斑篩選,以及對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證,測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的基因序列一致,成功得到了目的基因片段的陽性克隆子,為β-伴大豆球蛋白β亞基分段表達(dá)及抗原區(qū)域位置的篩選與鑒定提供參考。

β-伴大豆球蛋白,β亞基,生物信息學(xué),抗原位點(diǎn),克隆

Abstract:The model of tertiary ofβ-conglycinin beta-subunit was constructed by the bioinformation tool SWISS-MODEL,and the conformational epitopes were predicted by DiscoTope 2.0 server. The overlapping fragments ofβ-conglycinin beta-subunit genes were amplified by PCR and inserted into pMD-18T vector,then preserved into competent cell ofEscherichiacoliJM109. The recombinant plasmids were evaluated by blue-white selection,PCR and double enzyme digestion,and DNA sequence analysis showed that the cloned sequence was the very fragment designed. The successful cloning of the genes can provide a reference for the study of the expresstion ofβ-conglycinin beta-subunit and screening of antigenic epitopes.

Keywords:β-conglycinin;beta-subunit;bioinformation;antigenic epitopes;clone

大豆素有“田中之肉”、“綠色牛乳”之稱,是優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源。但同時(shí)也是八大食物過敏原之一[1-2],調(diào)查顯示世界上約有4%的人口對(duì)食物過敏,其中就有25%的人口對(duì)大豆過敏[3]。β-伴大豆球蛋白是7S球蛋白的主要成分,約占7S組分的85%,是重要的大豆貯藏蛋白,占大豆總球蛋白含量的30%以上[4]。且β-伴大豆球蛋白比大豆球蛋白表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗原性[5]。β-伴大豆球蛋白分子質(zhì)量約180 kDa,是由α′(72 kDa)、α(68 kDa)和β(52 kDa)三種亞基組成三聚體復(fù)合物,其含量分別為45%、35%和20%[6]。其中β亞基由416個(gè)氨基酸組成[7],不含人體必需氨基酸,且經(jīng)研究表明β亞基同樣具有免疫學(xué)活性[8],是大豆蛋白的主要過敏原之一。

導(dǎo)致食物過敏的是能引起免疫反應(yīng)的食物抗原分子。按照抗原蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同可將其分為線型和構(gòu)象型表位。目前,對(duì)抗原表位的研究多為B細(xì)胞構(gòu)象型表位,由于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,所以預(yù)測(cè)存在一定的局限。許多學(xué)者對(duì)此采取了多種研究方法進(jìn)行探討,包括酶解產(chǎn)生多肽片段進(jìn)行篩選方法、根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)重疊多肽并用單克隆抗體進(jìn)行篩選的方法、噬菌體展示庫肽技術(shù)以及利用NMR分析和X射線等手段對(duì)抗原位點(diǎn)進(jìn)行分析與研究等等[9-10]。但是這些方法工作量大,存在操作繁瑣及效率低等弊端。β-伴大豆球蛋白β亞基作為重要的大豆過敏原,目前國內(nèi)研究主要集中在β-伴大豆球蛋白檢測(cè)分析、致敏性鑒定及脫敏技術(shù)研究等方面。Maruyama等[11]研究分析了重組大豆和天然大豆β-伴大豆球蛋白β亞基的晶體結(jié)構(gòu),衛(wèi)會(huì)君等[12]通過篩選289份具有多樣種子外觀性狀的大豆種質(zhì),發(fā)掘出具有β亞基缺失性狀的大豆。對(duì)于大豆過敏原表位的定位研究主要采用的是重疊多肽技術(shù)。而噬菌體展示技術(shù)具有操作簡單、成本低等優(yōu)勢(shì)。楊廷亞等[13]應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選出血癥病毒抗原模擬表位。但是應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)對(duì)大豆過敏原表位定位的研究還未見報(bào)道。生物信息學(xué)與噬菌體展示技術(shù)作為一種新的過敏原表位預(yù)測(cè)和定位技術(shù),具有操作簡單、成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì)。在分析食物過敏抗原表位方面具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。

表1 β-伴大豆球蛋白β亞基基因分段引物Table 1 Primer for β-conglycinin beta-subunit gene segments

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析方法,運(yùn)用SWISS-MODEL服務(wù)器及DiscoTope 2.0服務(wù)器構(gòu)建β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)以及對(duì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增β亞基基因片段,構(gòu)建克隆載體,為研究利用噬菌體展示β-伴大豆球蛋白β亞基的分段表達(dá)及抗原表位的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-伴大豆球蛋白β亞基基因(1320 bp) 由上海生工生物工程股份有限公司合成并保存于PUC57載體質(zhì)粒中;大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T克隆質(zhì)粒及限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ 大連寶生物公司;質(zhì)粒小提試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 康為世紀(jì)生物公司;X-Gal、IPTG及Ex-Taq DNA酶、基因分段引物 上海生工生物工程股份有限公司。

PCR儀 Eppendorf公司;瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1β-伴大豆球蛋白β亞基氨基酸序列 通過NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫檢索到β-伴大豆球蛋白β亞基(LOC547465)的氨基酸序列:

1.2.2β-伴大豆球蛋白β亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建 登錄PDB(Protein Data Bank，蛋白質(zhì)資料庫)數(shù)據(jù)庫檢索β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白質(zhì),作為三級(jí)結(jié)構(gòu)模板。登錄SWISS-MODEL服務(wù)器,選擇Alignment Mode模式,分別上傳β-伴大豆球蛋白β亞基的氨基酸序列,對(duì)β-伴大豆球蛋白β亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建。

1.2.3β-伴大豆球蛋白β亞基的B細(xì)胞構(gòu)象表位預(yù)測(cè) 根據(jù)β-伴大豆球蛋白β亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,在DiscoTope 2.0服務(wù)器中預(yù)測(cè)其構(gòu)象表位,并找出預(yù)測(cè)抗原區(qū)域主要位置。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞構(gòu)象表位預(yù)測(cè)區(qū)段位置,本實(shí)驗(yàn)將β-伴大豆球蛋白β亞基基因分為3段:A(73～600 bp),B(478～930 bp),C(808～1317 bp)。相鄰片段之間設(shè)置約120 bp重疊區(qū)域。引物設(shè)計(jì)利用primer 5.0軟件,依據(jù)結(jié)構(gòu):5′-保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+引物配對(duì)區(qū)-3′,上游酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)為EcoRⅠ,下游為HindⅢ,且引物溶解溫度設(shè)計(jì)為58 ℃左右。具體見表1。

1.2.5β-伴大豆球蛋白β亞基基因的克隆及載體構(gòu)建

1.2.5.1β-伴大豆球蛋白β亞基全長及片段A,B,C的擴(kuò)增 使用PCR儀擴(kuò)增目的基因片段,反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 Reaction system for PCR

反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖電泳檢查,將擴(kuò)增片段分別命名為β亞基、A、B、C。

1.2.5.2 克隆載體的構(gòu)建 DNA回收試劑盒將β-伴大豆球蛋白β亞基全長及片段A、B、C基因回收,具體參照試劑盒操作手冊(cè)。將片段與pMD18-T載體相連,16 ℃水浴過夜,反應(yīng)體系為:pMD18-T vector 2.0 μL;DNA 3.0 μL;ligation 5.0 μL。用預(yù)冷槍頭吸取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至50 μL感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕搖勻,置于冰上30 min,然后42 ℃水浴60～90 s,隨后在冰中冷卻5 min,最后加入900 μL 37 ℃預(yù)熱LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。此時(shí)將50 μL x-gal(20 mg/mL)和13 μL IPTG(50 mg/mL)涂布含50 μg/mL氨芐青霉素(Amp+)的LB瓊脂平板上,37 ℃預(yù)熱0.5 h。吸取100 μL培養(yǎng)液吹打在預(yù)熱平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h。挑選白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng),用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別命名為pTβ、pTA、pTB、pTC。

1.2.5.3 重組質(zhì)粒的鑒定 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,酶切體系為:重組質(zhì)粒1.0 μL,10×M Buffer 5.0 mol/L,EcoRⅠ 1.0 μL,HindⅢ 1.0 μL,無菌超純水39.0 μL,總體系50.0 μL,混勻后37 ℃水浴4 h。PCR反應(yīng)體系參照表2?；厥债a(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠分析初步鑒定后,送至TaKaRa測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建

通過PDB數(shù)據(jù)庫搜索到蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(登錄號(hào):1ipk.1.A),氨基酸序列相似度達(dá)到99.52%,模型即為蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)。從得到的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖(圖1)可以看出,有部分α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)外側(cè),絕大部分β-折疊在蛋白質(zhì)中心區(qū)域。構(gòu)象表位一般位于蛋白質(zhì)表面的無規(guī)則卷曲等優(yōu)勢(shì)區(qū)域,一般認(rèn)為α-螺旋、β-折疊常位于蛋白質(zhì)內(nèi)部化學(xué)鍵能較高處,其形態(tài)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定且受外界物理化學(xué)等因素影響較小。而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多位于蛋白質(zhì)表面,容易與抗體嵌合,因而成為抗原表位的可能性大[15]。

圖1 β-伴大豆球蛋白β亞基蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Model of tertiary structure of β-conglycinin beta-subunit

2.2 β-伴大豆球蛋白β亞基B細(xì)胞構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)

DiscoTope 2.0服務(wù)器根據(jù)建立的β-伴大豆球蛋白β亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)出了91個(gè)B細(xì)胞構(gòu)象表位的氨基酸殘基。這91個(gè)氨基酸位于30個(gè)區(qū)段,分別為31、33、39～40、48～50、58、60～68、70、81～82、111～112、117、137～141、154～157、167、190、200～204、207、212、214～220、222～227、229～238、245～246、261～263、265、268～269、312～324、326、366～367、398、402、408。如圖2所示,預(yù)測(cè)的抗原表位絕大部分位于蛋白質(zhì)模型的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲處。

圖2 β-伴大豆球蛋白β亞基部分抗原表位示意圖Fig.2 Sketch map of epitopes of β-conglycinin beta-subunit注:以上四組圖片為β亞基模型的不同視角。

2.3 基因的分段克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建

2.3.1 目的基因片段的克隆 將載體質(zhì)粒PUC57中的目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增,得到全片段β亞基及分段片段A、B、C。擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖電泳顯示,可觀察到條帶大小與實(shí)驗(yàn)預(yù)先設(shè)計(jì)的片段A、B、C長度相符,表明已正確擴(kuò)增出目的片段,見圖3。

圖3 β亞基全片段及A,B,C基因擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Amplified electrophoresis of β-subunit and A,B,C bypass PCR注:M:DL1500Marker;1～4分別為β亞基全片段及片段A、B、C。

2.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及PCR、雙酶切鑒定 PCR擴(kuò)增目的基因片段經(jīng)切膠回收與pMD18-T載體相連,并轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞,挑取3個(gè)白色菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,如圖4、圖5的1、2、3、4泳道分別出現(xiàn)與β亞基全片段及片段A、B、C長度大小相符的條帶,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功[16]。

圖4 重組質(zhì)粒pTβ、pTA、pTB、pTC的PCR電泳圖Fig.4 Amplified electrophoresis of pTβ,pTA,pTB,PTC by PCR注：M:DL1500Marker;1～4分別為重組質(zhì)粒pTβ、pTA、pTB、pTC。

圖5 重組質(zhì)粒pTβ、pTA、pTB、pTC雙酶切電泳圖Fig.5 Electrophoresis of pTβ,pTA,pTB,pTC by double enzyme digestion注:M:DL1500Marker;1～4分別為重組質(zhì)粒pTβ、pTA、pTB、pTC。

3 討論與結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法,對(duì)β-伴大豆球蛋白β亞基進(jìn)行分段,克隆出β-伴大豆球蛋白β亞基基因及分段基因,并成功構(gòu)建克隆載體。下一步,將利用T7噬菌體展示系統(tǒng)分別表達(dá)β亞基及片段,結(jié)合分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物信息學(xué)對(duì)β-伴大豆球蛋白β亞基過敏表位進(jìn)行定位研究。對(duì)探明β-伴大豆球蛋白β亞基致敏性的分子機(jī)制、開展無過敏和低過敏的食品研究、防止食物過敏疾病的發(fā)生以及過敏性疾病的診斷提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。

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Analysisofantigenicepitopesandcloningofsoybeanmajorallergenβ-conglycininbeta-subunit

PIJiang-yi,XIJun*,HEMeng-xue,LIShuang

(College of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

TS201.6

A

1002-0306(2017)18-0090-04

2017-02-23

皮江一(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：食品免疫學(xué)，E-mail:577129671@qq.com。

*通訊作者:席俊(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品免疫學(xué)，E-mail:Xijunhnu@163.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31671778；31301409)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A550001)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.018