開賽爾·買買提明特肯

(和田師范專科學(xué)校生地學(xué)院，新疆 和田 848000)

新疆“三種藥用甘草”根中多糖的提取分離及其含量測定

開賽爾·買買提明特肯

(和田師范專科學(xué)校生地學(xué)院，新疆 和田 848000)

建立甘草多糖含量定量的測定方法，為評(píng)估甘草藥材的質(zhì)量提供方法。甘草樣品經(jīng)95%乙醇除去小極性的雜質(zhì)后，采用水提醇沉的方法，再通過多步驟除去雜質(zhì)得精制多糖。采用苯酚一硫酸法測定甘草多糖與葡萄糖的換算因子，并以此測定不同品種甘草藥材中多糖的含量。 三個(gè)不同品種間甘草生藥中甘草多糖的含量為脹果>烏拉爾>光果。 此方法簡便可行，甘草多糖供試液在4h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重復(fù)性較好，平均加樣回收率高，可作為甘草多糖的含量測定方法。

新疆；甘草提取；多糖測定

1前論

屬于豆科植物甘草屬的主要成員(種類)為光果甘草(Glycyrrhiza glabra L．)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflate Bat．)、烏拉爾甘草(又稱紅黃皮甘草)(Glycyrrhiza uralensis Fisch．)。被干燥的甘草根子及根莖具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效。1965年Tookey和Quentin報(bào)道從烏拉爾甘草種子中提取分離得到了一種黏性強(qiáng)的種子膠，并證明它是一種中性多糖。國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者向甘草多糖進(jìn)行了深入研究，研究表明，它具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等的活性[1]。

提取甘草根中多糖的方法主要有傳統(tǒng)水煮法、微波法、酶法、超聲法等，但是其中微波法和超聲法技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于中草藥有效成分的提取中，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能顯著提高提取率、縮短提取工藝時(shí)間、節(jié)省溶劑，污染率低，并且用超聲破碎過程是一個(gè)物理過程。運(yùn)用這個(gè)方法不僅僅是被浸提取的甘草多糖在一定時(shí)間內(nèi)能保持不變，還有減少多糖提取實(shí)驗(yàn)帶來損失的傾向[2]。

本實(shí)驗(yàn)用硫酸法測定方法測定了新疆3個(gè)不同品種的甘草根的多糖含量。即，以苯酚——硫酸為顯色劑用比色法測定甘草根體內(nèi)多糖的含量，主要依據(jù)多糖類成分在硫酸作用下，首先水解成單糖，單糖也在酸性環(huán)境中迅速脫水生成糠醛衍生物，然后與苯酚縮合而成有色的化合物，該化合物在490nm波長處的吸收光度(值)與糖濃度呈線性關(guān)系。本法用的顯色不易褪色，靈敏度高，重現(xiàn)性也好[3]。

實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料來自南疆野生的，根主干部分(3～5年生)。經(jīng)新疆大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分類實(shí)驗(yàn)室買買提明·蘇萊曼教授鑒定，葡萄糖對(duì)照樣品(中國生物制品檢定所制造的)，無水乙醇(中國杭州化學(xué)試劑有限公司制造的)，濃硫酸(衢州巨化試劑有限公司制造的)，苯酚(國家藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司制造的)。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

HB10 digital型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；50g高速手提式中藥粉碎機(jī)，DFT-50型大德藥碎機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Büchi Rotavapor，R-220型，德國產(chǎn))；Allegra 64 Centrifuge型BECKMAN COULTER冷凍離心機(jī)；BT25S型SARTORIUS分析天平；DGG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司制造的)；Ultrospec 3300pro型Amersham Biosctences紫外可見光光度計(jì)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

(1)制配葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確調(diào)度到105℃干燥的，至到配置恒重的葡萄糖對(duì)照品稱取0.0251g，然后置于250ml的容量瓶中，加人蒸餾水溶解葡萄糖，并稀釋至到刻度搖勻，濃度配制成為100.4μg.mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用；(2)5%苯酚試劑的配制：先稱取苯酚精確5g，然后加100ml水溶解，置于棕色瓶中待用；(3)苯酚溶液的配制：先配制80%的苯酚溶液，然后稱取80.0g苯酚加入20.0g水使之溶解，置于冰箱中避光長期保存。取80%苯酚37.5mL定容到500mL配制成6%的苯酚溶液避光保存?zhèn)溆??；蛉”椒?00g，加鋁片0.2g和NaHCO30.1g,蒸餾收集182℃時(shí)的餾分，稱取此餾分10g，加水150ml, 置于200ml棕色容量瓶中、用蒸餾水定容至刻度,放冰箱中各用；(4)配制80%乙醇500ml、濃硫酸5ml、無水乙醇、95%乙醇、氯仿：正丁醇=4:1或5:1、1ml 50g/L苯酚溶液，30%HCl、0.1%間苯二酚(用95%乙醇配制)、2mol/L NaOH、蒽酮試劑(150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸(或76ml濃硫酸加30ml水中))、80%乙醇、石油醚500ml等。

2.實(shí)驗(yàn)方法步驟(甘草根多糖的提取過程)

甘草晾干的甘草根的粉末稱取l00g → 置于500mL的燒瓶中在110℃用15min消毒 → 在40℃烘干5min → 用粉碎機(jī)打成磨粉 → 60目篩子篩取纖維 → 量在3倍大的石油醚在4℃減壓回流脫脂8次并濃縮其樣品 → 用體積2倍的80%乙醇回流提取兩次再次脫脂 → 甘草殘?jiān)盟』虺暯醿纱?→ 合并兩次提取液 → 加1倍95%的乙醇放置過夜 → 3000rpm離心10min沉淀，收集上清液，加入0.l%的活性炭脫色，過濾→ 用sevage法，即氯仿：正丁醇 = 4:1試劑脫出蛋白質(zhì) → 用水溶解脫掉殘余的蛋白質(zhì) →無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌三次 → 使用真空干燥 → 終會(huì)可得溶性甘草粗多糖干燥產(chǎn)品。

3.結(jié)果

關(guān)于新疆甘草多糖數(shù)據(jù)或性質(zhì)相關(guān)分析的報(bào)道并不多，尤其是關(guān)于其生物活性的研究更少。所以對(duì)甘草多糖的進(jìn)一步深入的研究有深遠(yuǎn)的意義，將為其藥理活性的研究能開辟道路。

表 不同三種甘草根多糖的含量結(jié)果Tab．Content result of the polysaccharides in Radix Glycyrrhiza different varieties

本實(shí)驗(yàn)采用了苯酚一硫酸比色法。該方法操作簡單、快速、無需多糖純品等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)水溶性和非水溶性樣品均可測定。

換算因素的測定：多糖含量% = (C·D·f/W)×100。(其中：f為換算因素，f = 1.47；W為甘草粉末的質(zhì)量(μg)；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所折算的數(shù)值(μg/ml)；D為稀釋倍數(shù)；f = W/CD)。

4.結(jié)論

(1)甘草多糖的提取最佳工藝條件為：提取溫度90℃，料液比30倍，時(shí)間0.5h，提取次數(shù)2次。甘草多糖的提取以水為提取溶劑，在80℃的條件下，提取3個(gè)小時(shí)，反復(fù)三次，每次水的用量為30ml/1g原料。甘草多糖的純度為40.00%，收率為5.40% 。

(2)使用超聲法提取甘草根中的多糖類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)提取最佳的次數(shù)為3次，提取最佳的用時(shí)為20min，提取最佳的溫度為45℃，提取時(shí)最佳的料液比值為1∶20。采用水-提醇沉淀法，從新疆三種藥用甘草根中提取出的多糖類物質(zhì)純度高達(dá)88.03%。采用水-提醇沉法、用三氯乙酸和Sevag除蛋白法，從脹果甘草中提取多糖類物質(zhì)中的粗多糖，提取率為2.28%，濃度為52.66%[4、5、9]。

(2)本實(shí)驗(yàn)提取全過程無須加熱，為了避免甘草多糖的分解。超聲提取浸提過程中無出現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)，被浸提的生物活性物質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)保持不變，生物活性也不減。該法對(duì)于某些熱敏成分的提取無疑是最合適的一種方法。因此，采用超聲法提取植物多糖，可避免因結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論，也可避免造成研究工作的復(fù)雜化。微波提取和減壓回流濃縮合并的這種試驗(yàn)方法大程度可加快反應(yīng)速度，有效地能提高甘草多糖的收率。

[1]劉婭、韓新年、陳玲. 新疆甘草的開發(fā)利用，食品研究與開發(fā)[J]，2012 (1)：209. [2]汲晨鋒、姜薇、王曉晶. 甘草多糖的化學(xué)與藥理研究[J], 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004(5)：515-517. [3]王航宇、劉金榮、江發(fā)壽等. 新疆甘草多糖的超聲提取及含量測定[J], 基層中藥雜志2002 (1)：7-8. [4]韓榮生，李鵬. 甘草多糖提取工藝條件的研究[J], 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，6(3)：234～237. [5]叢媛媛、熱娜·卡斯木、帕麗達(dá)·阿不力孜等. 新疆脹果甘草多糖的提取及其體外抗氧化活性[J],中藥材，2009，32(9)：1435～1438. [6]李薇、宋新波、孫成榮等. 三個(gè)不同品種甘草多糖的含量測定[J], 天津中醫(yī)藥，2013(1)：47-49. [7] 張耀光、王謝、梁瑞玲. 甘草多糖提取純化工藝研究[J]，科技論壇，2011(16)：53. [8]曾曲梅. 對(duì)甘草有效成分提取純化方法的研究[J],當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2014(2)：296-297. [9]劉建利. 寧夏烏拉爾甘草多糖的提取及其體外抗氧化活性的測定[J]，食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(7)：210～213. [10]馬穩(wěn)、謝銀軍、張婉思. 甘草多糖活性炭脫色工藝[J], 光譜實(shí)驗(yàn)室，2013(4)：2966～2967. [11]張澤生、史砷、白鑫等. 新疆產(chǎn)甘草品質(zhì)評(píng)價(jià)及甘草多糖提取工藝研究[J]， 現(xiàn)代食品科技，2008(2)：144. [12] 劉霞，謝建新，李艷等. 甘草多糖的超聲提取及含量分析[J]， 西北藥學(xué)雜志，2004(2)：60-61. [13]李春英. 甘草多糖提取純化工藝研究[D]，東北林業(yè)大學(xué)碩士論文，2002(12)：36. [14]吳漢夔、趙蕓、牟新利等. 新疆甘草化學(xué)成分研究[J]，天然產(chǎn)品研究與開發(fā)，2006(18):415-417. [15] 張靜，劉平，蔡利. 中藥甘草水溶性多糖的提取與測定[J]，陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005(2): 66-67頁. [16] 王亞紅，曲小姝，祝波. 甘草多糖提取工藝研究[J]，吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2011(5): 38.

2017-07-20

資金項(xiàng)目本文系中央財(cái)政部、教育部轉(zhuǎn)西南大學(xué)2013年級(jí)向新疆和田師范專科學(xué)校對(duì)口支援課題“新疆主要甘草種質(zhì)資源搜集與分析研究”，編號(hào)：XDJK2014C034 的初步成果之一。

開賽爾·買買提明·特肯(1973-)，男，和田墨玉縣人，碩士，和田師范?？茖W(xué)校副教授。研究方向：民族藥用植物資源、傳統(tǒng)生物技術(shù)、生態(tài)學(xué)。