張 韞， 高蘇亞， 扈本荃

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021)

巖白菜素(Bergenin，BER)屬于異香豆素類化合物，因最早從巖白菜屬植物中提取而得名，又名巖白菜內(nèi)酯、巖白菜寧、矮茶素和矮地茶素等[1]。其生理活性顯著，具有良好的止咳、祛痰、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等作用[2]，臨床上廣泛用于支氣管哮喘、慢性胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍的治療[3]。已報(bào)道的巖白菜素測定方法有：紫外-可見分光光度法(UV-Vis)[4]、熒光光譜法(FS)[5]、電致化學(xué)發(fā)光法(ECL)[6]、電化學(xué)分析法(EA)[7]、毛細(xì)管電泳法(CE)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]、薄層色譜法(TLC)[10]和液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[11]等。

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、儀器裝置簡單、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測、食品分析等領(lǐng)域具有重要實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)對(duì)魯米諾的化學(xué)發(fā)光信號(hào)具有增敏作用，依此構(gòu)建了魯米諾-牛血清白蛋白化學(xué)發(fā)光體系[12]。該體系與傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光體系相比，檢測靈敏度更高，并可用于藥物分子與模型蛋白相互作用的研究。本文基于巖白菜素對(duì)魯米諾-牛血清白蛋白體系發(fā)光信號(hào)顯著的抑制作用，建立了巖白菜素的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析法，并應(yīng)用于藥物制劑和生物流體中巖白菜素的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

IFIS-C型流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)，主要由蠕動(dòng)泵、六通閥、聚四氟乙烯管(1.0 mm i.d.)、樣品池和光電倍增管組成。UV762紫外-可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)。

巖白菜素對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)：477907，上海士鋒生物科技有限公司)，儲(chǔ)備液濃度為2.0×10-4g/mL；魯米諾(純度≥97%，Sigma-Aldrich)儲(chǔ)備液濃度為2.5×10-2mol/L；牛血清白蛋白(純度≥98%，Sigma-Aldrich)儲(chǔ)備液濃度為2.5×10-5mol/L。以上儲(chǔ)備液均于4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)所用溶液由上述儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋配制。其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)艾柯KLZ-UV超純水機(jī)(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)純化(電阻率18.3 MΩ·cm)。

復(fù)方巖白菜素片(滇虹藥業(yè)集團(tuán)玉溪生物制藥有限公司，批號(hào)20141001，規(guī)格：125 mg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the FI-CL system

流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測定巖白菜素的裝置示意圖如圖1所示。實(shí)驗(yàn)裝置由四條管路組成：魯米諾(NaOH)、牛血清白蛋白、載液(超純水)、樣品溶液；蠕動(dòng)泵流速為2.0 mL/min。基線穩(wěn)定后由六通閥定量注入的100L魯米諾與牛血清白蛋白和巖白菜素的混合液再混合后流入流通池，產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)由光電倍增管(HV:700 V)檢測再經(jīng)IFIS-C數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)記錄處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

分別對(duì)9～19 cm混合管長度和0.5～5.0 mL/min溶液流速進(jìn)行了優(yōu)化，綜合混合效果及發(fā)光強(qiáng)度等因素，選定10 cm混合管長度和2.0 mL/min流速作為實(shí)驗(yàn)條件。

考察了魯米諾濃度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響，如圖2所示。當(dāng)魯米諾濃度為2.5×10-5mol/L時(shí)，發(fā)光信號(hào)強(qiáng)而穩(wěn)定，因此選用該濃度為魯米諾的實(shí)驗(yàn)濃度。魯米諾濃度為2.5×10-5mol/L時(shí)，對(duì)1.0×10-3～0.1 mol/L NaOH溶液濃度進(jìn)行了優(yōu)化，如圖3所示。發(fā)現(xiàn)NaOH溶液濃度為2.5×10-2mol/L時(shí)，魯米諾化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)，因此選用2.5×10-2mol/L NaOH。

牛血清白蛋白對(duì)魯米諾化學(xué)發(fā)光具有增敏作用?？疾炝?.5×10-10～2.5×10-7mol/L牛血清白蛋白溶液對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。隨著牛血清白蛋白溶液濃度的增加，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增大，當(dāng)牛血清白蛋白濃度為5.0×10-9mol/L時(shí)發(fā)光信號(hào)最大，選用5.0×10-9mol/L為牛血清白蛋白的最佳濃度。

圖2 魯米諾濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of luminol concentration on CL intensity

圖3 氫氧化鈉濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on CL intensity

圖4 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-時(shí)間曲線Fig.4 Relative CL intensity-time profile Curve 1：luminol；Curve 2：luminol-BSA-BER；Curve 3：luminol-BSA；Concentration：luminol 2.5×10-5 mol/L，BSA 5.0×10-9 mol/L，BER 3.0×10-10 g/mL.

2.2 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-時(shí)間關(guān)系曲線

在流動(dòng)注射系統(tǒng)中對(duì)魯米諾-牛血清白蛋白-巖白菜素的發(fā)光行為進(jìn)行了考察，如圖4所示。由圖4可知，魯米諾體系(曲線1)最大發(fā)光強(qiáng)度(Imax)為110，對(duì)應(yīng)時(shí)間(tmax)為4.4 s，且發(fā)光信號(hào)在15 s內(nèi)消失；魯米諾-牛血清白蛋白(曲線3)體系的Imax從110增加至316，相應(yīng)tmax從4.4 s縮短至4.0 s；3.0×10-10g/mL巖白菜素存在時(shí)，Imax從316降至165，tmax保持不變(曲線2)。在溶液的流速為2.0 mL/min條件下，完成一次分析過程(包括進(jìn)樣和沖洗管路)只需30 s，采樣頻率120/h。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在3.0×10-11g/mL 巖白菜素存在下，將100 μL堿性魯米諾溶液注入流動(dòng)注射分析系統(tǒng)，通過記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，測試魯米諾、魯米諾-牛血清白蛋白和魯米諾-牛血清白蛋白-巖白菜素體系的穩(wěn)定性。該實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 d，系統(tǒng)每天運(yùn)行8 h，每個(gè)結(jié)果為7次進(jìn)樣測定的平均值。結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.5%，表明化學(xué)發(fā)光體系穩(wěn)定性良好。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和檢出限

在最佳條件下，化學(xué)發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度△I與巖白菜素質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值在3.0～5.0×105pg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為:△I=22.92lnc+15.15(c：pg/mL)，相關(guān)系數(shù)r=0.9948，檢出限(3σ)為1.0 pg/mL。巖白菜素質(zhì)量濃度為0.1、0.5和1.0 ng/mL時(shí)，平行測定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.2%、1.8%和1.5%。不同方法測定巖白菜素線性范圍和檢出限的比較如表1所示。由表1可知，與其它方法相比，本法具有靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。

表1 不同方法測定巖白菜素的比較

2.5 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理探討

采用紫外-可見分光光度法和流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法探討魯米諾-牛血清白蛋白-巖白菜素反應(yīng)可能的發(fā)光機(jī)理，紫外-可見吸收光譜如圖5所示。由圖5(a)可以看出，當(dāng)魯米諾存在時(shí)，牛血清白蛋白在其最大吸收波長280 nm附近的紫外吸收明顯增強(qiáng)，并有一定紅移(～4 nm)；在化學(xué)發(fā)光體系中(圖4)，當(dāng)牛血清白蛋白存在時(shí)，魯米諾的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，tmax由4.4 s 縮短至4.0 s。說明魯米諾與牛血清白蛋白之間存在相互作用，可能是由于魯米諾與牛血清白蛋白分子表面親水性Trp134活性基團(tuán)[13]結(jié)合，加速魯米諾激發(fā)態(tài)電子轉(zhuǎn)移速率并增敏其化學(xué)發(fā)光[12]。由圖5(b)可知，加入巖白菜素后，魯米諾在其最大吸收波長350 nm處吸光度無明顯改變，說明魯米諾與巖白菜素可能沒有相互作用。由圖5(c)可知，當(dāng)巖白菜素存在時(shí)，牛血清白蛋白的吸收光譜在280 nm附近藍(lán)移(～5 nm)，且混合后溶液吸光度較單組分吸光度之和降低約14%。綜上，魯米諾-牛血清白蛋白體系化學(xué)發(fā)光的猝滅可能是由于巖白菜素與牛血清白蛋白發(fā)生相互作用所致。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，巖白菜素可能與牛血清白蛋白疏水空腔中位于Trp212附近的活性位點(diǎn)結(jié)合形成復(fù)合物[5]，導(dǎo)致牛血清白蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變和魯米諾-牛血清白蛋白體系化學(xué)發(fā)光的猝滅。

根據(jù)牛血清白蛋白與藥物分子相互作用的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法模型[12]計(jì)算得牛血清白蛋白與藥物分子的結(jié)合常數(shù)Kd為5.3×104，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.72，結(jié)果表明牛血清白蛋白與巖白菜素可能生成了1∶1 的復(fù)合物，結(jié)合常數(shù)在104～105數(shù)量級(jí)。該結(jié)果與文獻(xiàn)采用經(jīng)典熒光猝滅法所得結(jié)果相符[5]。

圖5 不同反應(yīng)類型的紫外(UV)吸收光譜圖Fig.5 UV absorption spectra profile of different reaction types Concenteration：luminol 5.0×10-5 mol/L，BSA 2.0×10-6 mol/L，BER 1.0×10-6 g/mL.

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

2.7 樣品分析

取復(fù)方巖白菜素劑10片精確稱重，研細(xì)混勻。稱取相當(dāng)于一片的均勻粉末，溶解，過濾后，定容于100 mL棕色容量瓶。原溶液逐級(jí)稀釋至線性范圍，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定，結(jié)果見表2。將本法與《中國藥典》(2015年版)收載的紫外-可見分光光度法[14]測得數(shù)據(jù)比較，具有較好的一致性。

表2 片劑中巖白菜素的測定結(jié)果(n=7)

人血清來源于西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，尿樣由健康志愿者提供。在尿液和血清樣品中加入適量巖白菜素溶液制成模擬樣，混勻后稀釋到線性范圍，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定巖白菜素的含量，結(jié)果見表3和表4，回收率為98.2%～102.7%，RSD小于2.0%(n=7)。

表3 尿液中巖白菜素的測定結(jié)果(n=7)

表4 血清中巖白菜素的測定結(jié)果(n=7)

3 結(jié)論

基于巖白菜素對(duì)魯米諾-牛血清白蛋白體系化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯著的抑制作用,建立了快速、簡便、靈敏測定巖白菜素的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光分析法。本法適用于藥物制劑和生物流體中巖白菜素的含量測定,為藥物的質(zhì)量控制和臨床監(jiān)測提供了實(shí)驗(yàn)參考。