劉同帥，李興月，邱德亮，邱智東，翁麗麗

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117 )

林蛙皮的酶解工藝及抗氧化作用

劉同帥，李興月，邱德亮，邱智東，翁麗麗*

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117 )

目的 優(yōu)選林蛙皮酶解制備工藝，并研究其抗氧化作用。方法 采用酶解法，通過單因素考察試驗和L9(34)正交實驗，以水解度作為考察指標，對酶解工藝進行篩選；通過林蛙皮酶解液對羥基自由基，超氧陰離子及DPPH自由基的清除作用，研究其抗氧化能力。結果 林蛙皮的最佳酶解工藝為：料液比1：15，pH 6.5，中性蛋白酶加入量為3 000 U/g，45 ℃下水浴2 h， 90 ℃滅酶10 min，離心，得林蛙皮酶解液，此酶解液對羥基、超氧陰離子及DPPH自由基的清除率在一定范圍內隨濃度的升高而加強。結論 通過正交實驗，得到中性蛋白酶酶解林蛙皮的最佳生產工藝，工藝合理可行，其酶解液具有良好的抗氧化活性，為林蛙皮進一步的化學及藥理研究奠定了基礎。

林蛙皮；酶解工藝；多肽；抗氧化

Abstract:?Objective To optimize the enzymatic preparation process of Rana skin and study its anti-oxidize effect.Methods Take enzymatic method, use single factor experiment and L9(34) orthogonal experiment.Evaluating indicator is the degree of hydrolysis to screen enzymatic hydrolysis process; the scavenging activities of hydroxyl radical, superoxide anion and DPPH radical were studied by enzymatic hydrolyzate of Rana chensinensis.Results The optimal conditions of enzymatic hydrolysis process of rana skin were as follows： solid-liquid ratio 1：15, Ph6.5,neutral protease dosage of 3000U /g, at 45 ℃ water bath for 2 hours, 90 ℃ enzyme inactivation 10min, centrifugation and Rana skin hydrolyzate can be produced.The clearance of hydrolysis is enhanced with the the concentration of hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals in a certain range.Conclusion The optimum production process of neutral protease hydrolysis of Rana chensinensis was obtained through the orthogonal experiment.The process was reasonable and feasible.The hydrolyzate has good antioxidant activity and lays the foundation for further chemical and pharmacological studies.

Keywords:?Rana skin; enzymatic hydrolysis; polypeptides; oxidation resistance

林蛙皮的主要成分是生物胺和生物活性肽，生物活性肽是當前醫(yī)學、藥學以及食品營養(yǎng)學界研究的熱點之一，多肽不僅是蛋白質水解的中間產物，易于人體吸收，而且具有多種生物活性[1]。蛋白酶酶解法[2]制取多肽是一種較為普遍的方法，簡便易行，產物分子量小，易被人體吸收，進入機體后沒有有害物殘留，安全性高。而多肽具有抗氧化、抗衰老作用，大多用于醫(yī)學界和美容界，具有很好的臨床效果。

1 材料

1.1 樣品 林蛙皮。

1.2 試劑 木瓜蛋白酶（北京欣華綠源科技有限公司），中性蛋白酶（北京欣華綠源科技有限公司），胰蛋白酶（北京欣華綠源科技有限公司），甲醛溶液（西隴化工股份有限公司），氫氧化鈉（片）（天津新通精細化工有限公司），七水合硫酸亞鐵（西隴化工股份有限公司），雙氧水（天津市光復科技發(fā)展有限公司），水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、抗壞血酸（光復精細化工研究所），1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司），無水乙醇（北京化工廠），鹽酸(北京化工廠），DPPH（美國Sigma公司）。1.3 儀器 雷磁pHB-4便攜式pH計 (上海儀電科學儀器股份有限公司）， KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S2（上海越眾儀器設備有限公司），TU-1810PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 樣品前預處理 林蛙皮置真空干燥箱內，烘干，粉碎。

2.2 酶解工藝研究

2.2.1 酶種類的優(yōu)選 1）酶解液的制備 ： 精密稱取5 g林蛙皮粉，加入適量蒸餾水，密封，超聲20 min，調溫，調pH值，加入一定量的酶，漩渦混勻 ，酶解過程保持pH值恒定，達到預定時間后，酶解結束，水浴滅酶，再將酶解液離心15 min，取上清液置于儲液瓶中（4 ℃），待測定。用相同方法做空白對照。2） 蛋白質水解度測定方法：吸取15 mL水解液于250 mL燒杯中，加入去CO2蒸餾水60 mL，打開磁力攪拌器，采用0.05 mol/ L NaOH標準溶液調節(jié)pH值至8.20，停止攪拌，再加入10 mL新配制的20%中性甲醛溶液，搖勻，靜置3 min，用0.05 mol/ L NaOH溶液滴定，直至溶液pH值至9.2，記錄加入甲醛后消耗的NaOH溶液消耗量（mL）；同時做空白實驗。 水解度計算公式參照文獻[3-5]。記錄試驗過程中消耗的堿體積，可通過公式計算蛋白質的水解度。3）酶優(yōu)選結果：分別取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，按照“2.2.1”項下方法對林蛙皮進行酶解并測定水解度，結果表明，3種酶水解度大小順序為中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶，確定選用中性蛋白酶作為最佳水解酶。

2.2.2 中性蛋白酶酶解條件的優(yōu)選[6]1）料液比對水解度的影響：在pH值6.5、溫度為45 ℃、加酶量為2 000 U/g的條件下，水解2 h，料液比分別為1：10、1：15、1：20。按酶解液制備方法制備，依測定法測定，計算水解度。結果表明，中性蛋白酶最佳酶解料液比為1：15。2）加酶量對水解度的影響：在pH 6.5、溫度為45 ℃、料液比為1：15的條件下水解2 h，加酶量分別2 000、3 000、4 000 U/g，按酶解液制備方法制備，依測定法測定，計算水解度。結果表明，加酶量為3 000 U/g時水解度最高。3）時間、溫度、pH值對水解度的影響：根據文獻檢索及預實驗的結果，選擇pH值、溫度、時間3個影響因素，每個因素選3個水平，以水解度為考察指標，選用L9（34）正交表進行實驗，見表1。

表1 因素水平表

表1分析結果表明，各因素對試驗結果影響的重要性依次為B＞C＞A，溫度B、時間C有統(tǒng)計學意義，是主要影響因素；pH值A沒有顯著性，對試驗結果影響最小，因為A沒有顯著性，綜合選A1；結合生產實際，節(jié)約生產時間，綜合評定確定各因素的最佳水平依次為： A因素的第1水平，B因素的第1水平，C因素的第2水平，即A1B1C2。即加15倍量的水，pH值6.5，溫度45 ℃，加酶量3 000 U/g，酶解2 h。

2.3 抗氧化試驗研究

2.3.1 樣品溶液的制備 樣品1：取林蛙皮60 g，加入中性蛋白酶，按照“2.2.1”項下方法制備。樣品2：取林蛙皮60 g，除不加入中性蛋白酶外，其他按照“2.2.1”項下方法制備。

2.3.2 方法 1）林蛙皮酶解液對羥基自由基（- OH）的清除作用：根據Fenton反應[7]，在試管依次加入9 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL, 9 mmol/L FeSO41 mL,加入不同濃度的待測樣品溶液2 mL,再以8.8 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃下反應0.5 h，以水作參比，在504 nm下測定加入樣品后的吸光度，計算- OH清除率。2）林蛙皮酶解液對超氧陰離子（O2-）的清除作用：采用鄰苯三酚自氧化法[8-9]，編號6只具塞試管，分別向10.0 mL具塞試管中加入Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，去離子水4.2 mL，混合均勻，25 ℃保溫20 min，取出后加入鄰苯三酚0.3 mL，分別加入不同濃度0.5、0.75 、1、1.5 、2.5 mg/mL的樣品1 mL，混合均勻，水浴2 min， 320 nm處測定吸光度，每35 s記錄1次。計算獲得加不同濃度樣品時鄰苯三酚的自氧化速率。3）林蛙皮酶解液對DPPH自由基的清除作用[10]：精密量取樣品溶液2 mL，置于具塞試管中，加入DPPH試液2 mL，混合均勻，置于暗處放置30 min，以蒸餾水為空白對照，于516 nm處測定吸光度值，平行測定3次。計算清除率。

2.3.3 結果 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗。

2.3.3.1 對羥基自由基（-OH）的清除作用 見表2。

表2 樣品1及樣品2對-OH清除率比較

2.3.3.2 林蛙皮酶解液對超氧陰離子（O2-）的清除作用 見表3。

表 3 樣品1與樣品2對O2-清除率的比較

2.3.3.3 林蛙皮酶解液對DPPH自由基的清除作用[11-13]見表4。

表4 樣品對DPPH自由基的清除作用比較

3 小結

通過林蛙皮酶解工藝的研究，確定了林蛙皮的最佳酶解工藝條件為：原料經粉碎后，在pH值 6.5、料液比為1：15，溫度為45 ℃條件下加入中性蛋白酶3 000 U/g，酶解2 h后， 90 ℃滅酶，離心，得酶解液。所得林蛙皮酶解液為林蛙皮的進一步的抗氧化研究奠定了基礎。羥基自由基和超氧自由基是體內最主要的自由基和活性氧。其中，羥基自由基的化學性質活潑，同時也是毒性最大的自由基，可以與細胞內的各類有機物發(fā)生反應，造成脂質過氧化，蛋白質解聚與聚合，核酸斷裂，多糖解聚的重要活性氧，是反應物質抗氧化作用的重要指標。由本文可知，林蛙皮在酶解前后均具有一定的自由基清除能力，并且在一定范圍內隨著濃度的增大清除率逐漸增強。但林蛙皮酶解后的清除率大于酶解前的林蛙皮清除率，說明林蛙皮經酶解后在體外抗氧化活性增強，本實驗結果為林蛙皮的后期實驗研究奠定了良好的基礎，使林蛙皮這一資源得到充分有效利用，變廢為寶。

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Study on enzymatic hydrolysis process of Rana skin and antioxidant activity

LIU Tongshuai, LI Xingyue, QIU Deliang, QIU Zhidong, WENG Lili*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

R283.6

A

2095-6258(2017)05-0717-03

2017-01-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.010

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20150309009YY）。

劉同帥（1991 -），女，碩士研究生，主要從事中藥學方向研究。

*通信作者：翁麗麗，電話-13039218920，電子信箱- 735110462@qq.com