蘇雪林，張梓涵，劉婭

?

黑曲霉C2J6對(duì)環(huán)己酮的細(xì)胞耐受性機(jī)制

蘇雪林1，張梓涵2，劉婭1

(1石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；2新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊 830011)

鑒于黑曲霉C2J6在有機(jī)溶劑中的菌體生長和酶活性與其細(xì)胞耐受性有關(guān)，為揭示菌體對(duì)有機(jī)溶劑的耐受規(guī)律和耐受性機(jī)制，考察了菌體對(duì)15種有機(jī)溶劑的耐受性，并從細(xì)胞水平上探究了菌體在疏水性較低的環(huán)己酮中的耐受性機(jī)制。結(jié)果表明：黑曲霉C2J6可以在多種有機(jī)溶劑中生長產(chǎn)酶，lg為-0.24～3.0的有機(jī)溶劑對(duì)菌體生長及產(chǎn)酶有不同程度的抑制作用，而lg>3.0的有機(jī)溶劑則起到相應(yīng)的促進(jìn)作用。環(huán)己酮脅迫下，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)破損，胞內(nèi)細(xì)胞器有皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞表面疏水性下降，胞外核苷酸濃度上升，細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量降低，飽和脂肪酸含量增加。說明菌體對(duì)環(huán)己酮的耐受性涉及多個(gè)方面，多種耐受機(jī)制同時(shí)存在，使環(huán)己酮對(duì)細(xì)胞的毒害大大降低，從而提高了微生物的耐受能力。

黑曲霉；脂肪酶；有機(jī)溶劑；環(huán)己酮；細(xì)胞耐受性機(jī)制

引 言

耐有機(jī)溶劑微生物是一類新穎的極端微生物。這類微生物為了能在極端環(huán)境中生存，漸漸形成了自身獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理特征，其中一些微生物還能產(chǎn)生耐受極端環(huán)境的酶類等代謝產(chǎn)物，如耐有機(jī)溶劑脂肪酶、蛋白酶等，給非水相酶催化領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展帶來了新的突破口。因此，耐有機(jī)溶劑酶類已經(jīng)成為生物催化領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。其中，研究有機(jī)溶劑對(duì)微生物的毒害及微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性機(jī)理成為關(guān)鍵。已有研究表明，有機(jī)溶劑對(duì)微生物的毒害存在菌體特異性[1]，毒害的大小與有機(jī)溶劑的lg值有關(guān)[2-7]。lg表示有機(jī)溶劑在辛醇和水中的分配系數(shù)，lg值越低，表示該溶劑的疏水性越強(qiáng)。此外，還與有機(jī)溶劑的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[8]，如在含有辛烯的培養(yǎng)基中不能存活，但在同等lg值的甲基環(huán)六烷存在下，卻可以生存。通常微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)理包括細(xì)胞形態(tài)變化[9]、囊泡外排[10-11]、改變細(xì)胞膜磷脂的結(jié)構(gòu)和組成[12-15]等。微生物體內(nèi)存在多種耐受機(jī)制，這些機(jī)制一般不是單獨(dú)存在，而是多種機(jī)制共同發(fā)揮作用來應(yīng)對(duì)復(fù)雜的生存環(huán)境。

目前，我國對(duì)耐有機(jī)溶劑微生物及其耐受性機(jī)制的研究尚處于起步階段，關(guān)于微生物對(duì)有機(jī)溶劑的單一耐受性機(jī)制報(bào)道較多，但對(duì)具體微生物綜合耐受機(jī)制的研究相對(duì)較少。本文以有機(jī)溶劑耐受菌黑曲霉C2J6為受試菌株，選取多種不同lg值的有機(jī)溶劑作為菌體培養(yǎng)基的碳源，了解菌體對(duì)不同有機(jī)溶劑的耐受規(guī)律，然后從中選取lg值較低、耐受性較好的環(huán)己酮培養(yǎng)菌體，從細(xì)胞水平上探討其多種耐受性機(jī)制，以期為后續(xù)從代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)角度的深入研究提供參考。此外，掌握微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性機(jī)制，有利于靶向提高微生物細(xì)胞的耐受性，對(duì)于開發(fā)極端微生物資源、充分利用微生物特殊生理功能，開發(fā)全細(xì)胞催化劑[16]和環(huán)境修復(fù)菌株、促進(jìn)綠色化工、環(huán)境污染修復(fù)、酶制劑的開發(fā)等具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株

有機(jī)溶劑耐受菌黑曲霉C2J6，源自葡萄，由本實(shí)驗(yàn)室自行分離。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯：分析純，Sigma；亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯：色譜純，Sigma；正庚烷：色譜純，F(xiàn)isher Scientific；石油醚、丙醇、甲苯、正己烷、乙醇、乙酸乙酯：分析純，西隴化工廠有限公司；吡啶、丙酮、乙酸、環(huán)己酮、苯酚、四氯化碳、苯、二氯甲烷、異丙醇：分析純，北京化工廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

OLYMPUS-CX41生物顯微鏡，北京卓信偉業(yè)科技有限公司；UH5300雙光束分光光度計(jì)，日本日立（HITACHI）公司；JEM-1400透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；Vortex-genie 2通用旋渦混勻器，北京卓信偉業(yè)科技有限公司；GC-450氣相色譜儀，布魯克(Bruker)公司；MS-320氣相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜系統(tǒng)，布魯克(Bruker)公司。

1.4 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯粉6 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，NH4Cl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CaCl20.1 g·L-1，KCl 0.1 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，橄欖油乳化劑(4%聚乙烯醇:橄欖油=3:1)10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

1.5 菌體干重測(cè)定

將不同lg值的15種有機(jī)溶劑按1%添加到黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的液體在恒重的濾紙上真空抽濾，得到菌絲體后用蒸餾水沖洗3次，于烘箱中70℃干燥至恒重，冷卻后稱量，計(jì)算菌絲體干重。

1.6 脂肪酶活性測(cè)定

以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，在分光光度計(jì)405 nm波長下測(cè)定脂肪酶活性[17]。

1.7 菌體細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞切片的制備：將黑曲霉細(xì)胞放入盛有戊二醛固定液的離心管中固定24～48 h，用磷酸緩沖液沖洗菌體后加入鋨酸再固定90 min，清洗，酒精脫水。再用等比例的樹脂和酒精浸泡菌體，期間更換樹脂。60℃包埋48 h使樹脂聚合，切成70 nm的切片備用。

切片染色：切片用醋酸鈾染色5 min，再用0.02 mol·L-1NaOH染色2 min，重蒸水洗去多余的染色液，干燥后用透射電鏡觀察。

1.8 細(xì)胞表面疏水性檢測(cè)

細(xì)胞的表面疏水性采用微生物碳?xì)湮侥芰Ψǎ∕ATH）[18-19]，測(cè)定3次，求平均值。計(jì)算公式如下

1.9 菌體胞外核苷酸測(cè)定

調(diào)整黑曲霉發(fā)酵液光密度在0.1～1.0范圍內(nèi)，在波長260 nm下測(cè)定吸光值。260 nm下1 mg·ml-1DNA吸光值為0.02，1 mg·ml-1RNA吸光值為0.022，核苷酸的濃度計(jì)算公式如下

(3)

式中，為核苷酸濃度，mg·ml-1；為樣品吸光值。

1.10 細(xì)胞膜脂肪酸組成分析

細(xì)胞膜脂肪酸首先進(jìn)行甲酯化[20]，再用氣相色譜儀測(cè)定其中脂肪酸含量。脂肪酸甲酯化步驟：將待測(cè)細(xì)胞置于圓底燒瓶中，加入8 ml 2% NaOH溶液，燒瓶放入沸水浴中加熱回流，直到燒瓶中油滴消失。再加入7 ml 5% BF3溶液，繼續(xù)沸水浴2 min，停止加熱，迅速冷卻至室溫。然后加入約20 ml正庚烷溶液，振搖2 min，待分層后，吸取上清液5 ml于試管中，加入3～5 g無水Na2SO4，振搖1 min，靜置5 min，得到上層液體待測(cè)。GC分析檢測(cè)條件：采用DB-23毛細(xì)管柱（美國 Agilent公司產(chǎn)品，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，內(nèi)膜厚度0.25 μm）。起始溫度140℃，以4℃·min-1升至240℃，保持8 min，流速1 ml·min-1，采用氫火焰離子檢測(cè)器溫度200℃，進(jìn)樣量2 μl，樣品自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體對(duì)有機(jī)溶劑的耐受規(guī)律

為了考察有機(jī)溶劑對(duì)黑曲霉C2J6的影響，選取了15種不同lg值的有機(jī)溶劑，包括醇類、醚類、醛類、酮類等。有機(jī)溶劑對(duì)應(yīng)的lg值[21-22]見表1。將有機(jī)溶劑按1%加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，再分別接入2%的黑曲霉C2J6種子液，28℃、150 r·min-1下?lián)u床振蕩培養(yǎng)72 h。以沒有加入有機(jī)溶劑的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照。測(cè)定菌體干重及脂肪酶活力，結(jié)果如圖1所示。

表1 有機(jī)溶劑的lgP值

由圖1可知，C2J6在15種不同有機(jī)溶劑中均有生長和脂肪酶活，但在不同有機(jī)溶劑中的表現(xiàn)有所差異。與對(duì)照相比，添加乙醇的培養(yǎng)基中，菌體的生長和產(chǎn)酶情況最差，干重較對(duì)照低71.67%，脂肪酶活力比對(duì)照低94.94%；而在添加四氯化碳、正己烷和石油醚的情況下，菌體生長和產(chǎn)酶能力較好，菌體干重分別增加了26.67%、51.11%和63.33%，脂肪酶活力分別增加了2.43%、7.57%和15.90%。根據(jù)溶劑lg發(fā)現(xiàn)其值在-0.24～3.0之間時(shí)，有機(jī)溶劑對(duì)菌體生長及產(chǎn)酶有不同程度的抑制；而lg>3.0時(shí)，則呈現(xiàn)出促進(jìn)作用。圖1中，黑曲霉C2J6菌體干重及脂肪酶活性與lg值并沒有嚴(yán)格的相關(guān)性，說明菌體生長和產(chǎn)酶能力與不同有機(jī)溶劑的特性有關(guān)[23]，還與菌體自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。圖2將有機(jī)溶劑對(duì)黑曲霉的毒性與有機(jī)溶劑的疏水性參數(shù)lg進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以脂肪酶活性作為有機(jī)溶劑抑制黑曲霉細(xì)胞活性的響應(yīng)。由圖2可知，有機(jī)溶劑的lg與有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶活性的抑制作用存在一定的關(guān)聯(lián)性，其相關(guān)系數(shù)2=0.944。隨著lg值的增大，有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶的抑制作用逐漸減小，這可以作為選擇有機(jī)溶劑進(jìn)行非水相酶催化的依據(jù)。

2.2 環(huán)己酮對(duì)細(xì)胞形態(tài)、菌體生長及酶活力的影響

從15種有機(jī)溶劑中選取lg值較低、有機(jī)溶劑耐受性相對(duì)較好的環(huán)己酮，將其分別以1%和5%的比例添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中，觀察細(xì)胞形態(tài)，測(cè)定菌體干重及脂肪酶活力。由圖3及圖4可知，透射電鏡下正常黑曲霉C2J6的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞膜分明，表面飽滿光滑，結(jié)構(gòu)致密，緊貼細(xì)胞膜的外圍黏附著一圈大小均一的小顆粒狀代謝產(chǎn)物，沒有褶皺，菌體生長良好，產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。添加1%環(huán)己酮后整個(gè)細(xì)胞仍然清晰可見，但細(xì)胞切面呈現(xiàn)不規(guī)則的橢圓形，細(xì)胞膜內(nèi)外邊緣都出現(xiàn)了暈圈，細(xì)胞膜邊界模糊不清，外層細(xì)胞膜多處有破損，內(nèi)層細(xì)胞膜基本保持完整，菌體干重減小了13.37%，脂肪酶活力下降了32.84%。而5% 培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞雖然較完整，但胞內(nèi)細(xì)胞器有皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞器只約占整個(gè)細(xì)胞的1/3，其外部被一層不規(guī)則薄膜包裹，菌體干重和酶活力僅為對(duì)照組的49.42%及41.67%。實(shí)驗(yàn)表明黑曲霉在環(huán)己酮的存在下，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，且環(huán)己酮濃度越高對(duì)細(xì)胞的破壞越嚴(yán)重，菌體生長變差，產(chǎn)酶能力減弱。這可能是因?yàn)榧?xì)胞通過改變自身形態(tài)及細(xì)胞比表面積來抵御有機(jī)溶劑的毒害，使得菌體能夠生長，同時(shí)也保持了部分脂肪酶活性。這與Zhang等[24]的研究結(jié)果相似。

2.3 環(huán)己酮對(duì)細(xì)胞表面疏水性的影響

細(xì)胞表面疏水性能夠影響細(xì)胞吸收及降解疏水性物質(zhì)，并影響細(xì)胞在界面的黏附性。有機(jī)溶劑對(duì)多數(shù)微生物細(xì)胞有破壞作用，迫使細(xì)胞表面疏水性下降。環(huán)己酮濃度對(duì)菌體細(xì)胞表面疏水性的結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌體細(xì)胞的表面疏水性隨環(huán)己酮濃度和發(fā)酵時(shí)間出現(xiàn)較大差異。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，細(xì)胞表面疏水性總體呈下降趨勢(shì)。其中1%的環(huán)己酮中細(xì)胞表面疏水性下降得最為明顯。當(dāng)環(huán)己酮濃度逐漸增大，發(fā)酵24 h的表面疏水性已由60%降至32%，發(fā)酵至120 h時(shí)，5% 環(huán)己酮中細(xì)胞的表面疏水性已降至15%?？梢?，環(huán)己酮對(duì)細(xì)胞表面疏水性隨濃度增加及發(fā)酵時(shí)間延長，毒害作用明顯增大。環(huán)己酮脅迫下，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[25]，導(dǎo)致細(xì)胞膜疏水性下降，細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，這樣就能減少有機(jī)溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而減弱有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞帶來的影響，增強(qiáng)細(xì)胞的有機(jī)溶劑耐受性。

2.4 環(huán)己酮對(duì)胞外核苷酸濃度的影響

脫氧核糖核酸（DNA）是微生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)之一，一般只存在于微生物細(xì)胞內(nèi)部，但在受到各種脅迫下，胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)會(huì)釋放到胞外。環(huán)己酮濃度對(duì)黑曲霉C2J6胞外核苷酸的影響見圖6，當(dāng)環(huán)己酮濃度為1%時(shí)，菌體胞外核苷酸濃度已經(jīng)達(dá)到了70 μg·ml-1左右，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長其濃度變化不大。在2%～3%環(huán)己酮中，胞外核苷酸的濃度隨時(shí)間的變化先增加后減小。當(dāng)環(huán)己酮濃度為4%時(shí)，發(fā)酵24 h后胞外核苷酸的含量已經(jīng)達(dá)到了165 μg·ml-1左右。在5%環(huán)己酮中，胞外核苷酸濃度先增加后減小，發(fā)酵72 h后，核苷酸濃度呈下降趨勢(shì)，但含量還是遠(yuǎn)大于發(fā)酵48 h的?？傮w而言，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長和環(huán)己酮濃度的增加，黑曲霉C2J6胞外核苷酸濃度呈上升趨勢(shì)。說明，環(huán)己酮影響了黑曲霉C2J6細(xì)胞膜，使得胞內(nèi)的核苷酸泄漏，從而使胞外核苷酸濃度增加。

2.5 環(huán)己酮對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸的影響

2.5.1 環(huán)己酮濃度對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸的影響 將C2J6分別在濃度為1%和5%的環(huán)己酮下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，細(xì)胞膜脂肪酸變化情況見表2。與不添加環(huán)己酮的黑曲霉C2J6細(xì)胞膜脂肪酸相比，多不飽和脂肪酸含量隨著環(huán)己酮的濃度增加而減少，其中當(dāng)添加1%環(huán)己酮時(shí)，亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了4.19%、1.43%和15.71%。當(dāng)添加5%的環(huán)己酮時(shí)，亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了6.28%、2.82%和24.22%，其中，油酸含量降低得最多。同時(shí)，飽和脂肪酸含量均有不同程度的增加。當(dāng)添加1%、5%的環(huán)己酮時(shí)，反式油酸的含量分別增加了15.66%、28.63%。與對(duì)照相比，細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度降低，5%比1%環(huán)己酮下的不飽和度更低。

表2 添加不同濃度環(huán)己酮的C2J6脂肪酸的組成

Note: degree of unsaturation/D·mol-1=[1×(monoene%)+2×(diene%)+ 3×(triene%)+4×(tetraene%)]/100.

有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞膜脂質(zhì)成分影響細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)性和流動(dòng)性，而細(xì)胞膜流動(dòng)性主要取決于固醇與磷脂的比例及飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的大小[26-27]。由此推斷，黑曲霉C2J6細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量減少，飽和脂肪酸增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性發(fā)生變化，可能是細(xì)胞為了抵御有機(jī)溶劑的毒害而產(chǎn)生的有利調(diào)節(jié)。

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響 將C2J6在濃度為1%環(huán)己酮下發(fā)酵培養(yǎng)48 h和72 h，以不添加有機(jī)溶劑的發(fā)酵培養(yǎng)為對(duì)照。由表3可知，黑曲霉在環(huán)己酮中培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)，不飽和脂肪酸的含量均有不同程度的降低。培養(yǎng)48 h，細(xì)胞膜中亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了3.79%、1.22%和13.91%。但培養(yǎng)72 h，細(xì)胞膜中亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了4.19%、1.43%和15.71%。結(jié)合表2，環(huán)己酮對(duì)黑曲霉C2J6細(xì)胞膜的影響，一方面受到環(huán)己酮濃度的影響，另一方面也受到發(fā)酵時(shí)間的影響。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長及環(huán)己酮濃度增大，細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的含量下降較多，脂肪酸飽和度增大。這符合有機(jī)溶劑耐受機(jī)制的一種HA機(jī)制(homeoviscous adaptation)[28-30]，黑曲霉C2J6在增大脂肪酸飽和度的同時(shí)，可以抵消有機(jī)溶劑造成的流動(dòng)性，減小對(duì)細(xì)胞的影響。

表3 在1%環(huán)己酮中不同發(fā)酵時(shí)間下C2J6脂肪酸組成的變化

Note: degree of unsaturation/D·mol-1=[1×(monoene%)+2×(diene%)+ 3×(triene%)+4×(tetraene%)]/100.

3 結(jié) 論

（1）黑曲霉C2J6可以在多種有機(jī)溶劑中生長產(chǎn)酶，具有廣泛的有機(jī)溶劑耐受性。但在不同有機(jī)溶劑中生長情況和酶活性有差異。這說明有機(jī)溶劑對(duì)黑曲霉的毒害不僅與lg值有關(guān)，還可能與不同有機(jī)溶劑的性質(zhì)有關(guān)。

（2）環(huán)己酮使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，疏水性降低，胞外核苷酸濃度增加。黑曲霉C2J6通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成等改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞膜上脂肪酸成分的調(diào)節(jié)在有機(jī)溶劑耐受菌中發(fā)揮了重要的作用。

實(shí)驗(yàn)中的不足在于只從細(xì)胞水平上研究了環(huán)己酮對(duì)黑曲霉C2J6的毒害及細(xì)胞耐受性機(jī)制，未研究細(xì)胞對(duì)其他有機(jī)溶劑的耐受性。今后實(shí)驗(yàn)應(yīng)對(duì)其他有機(jī)溶劑的毒害及細(xì)胞耐受性機(jī)理進(jìn)行研究，還應(yīng)該探討細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化和耐受性間的關(guān)系，加強(qiáng)分子水平、基因水平上菌株耐受性機(jī)理的研究，以更加全面地詮釋該菌屬對(duì)有機(jī)溶劑的耐受特性，使此類研究更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

References

[1] Mariano A P, Qureshi N, Ezeji T C. Bioproduction of butanol in bioreactors: new insights from simultaneousbutanol recovery to eliminate product toxicity[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108(8): 1757-1765.

[2] Stancu M M. Physiological cellular responses and adaptations ofIBB Po1 to toxic organic solvents[J]. Journal of Environmental Sciences, 2014, 26(10): 2065-2075.

[3] Baharum S N, Rahman R N Z R A, BASRI M,. Chaperone-dependent gene expression of organic solvent-tolerant lipase fromstrain S5[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(3): 346-354.

[4] Sanders A, Collier R, Trethewy A,. AAP1 regulates import of amino acids into developing[J]. The Plant Journal, 2009, 59(4): 540-552.

[5] Lima V M G, Krieger N, Mitchell D A,. Activity and stability of a crude lipase fromin aqueous media and organic solvents[J]. Biochemical Engineering Journal, 2004, 18(1): 65-71.

[6] Siirola E, Grischek B, Clay D,. Tolerance of β-diketone hydrolases as representatives of the crotonase superfamily towards organic solvents[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108(12): 2815-2822.

[7] Kabelitz N, Santos P M, Heipieper H J. Effect of aliphatic alcohols on growth and degree of saturation of membrane lipids in[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 220(2): 223-227.

[8] Gaur R, Khare S K. Solvent tolerantas a source of novel lipases for applications in non-aqueous systems[J]. Biocatalysis and Biotransformation, 2011, 29(5): 161-171.

[9] Dunlop M J. Engineering microbes for tolerance to next-generation biofuels[J]. Biotechnology for Biofuels, 2011, 4(1): 2-9.

[10] Takatsuka Y, Chen C, Nikaido H. Mechanism of recognition of compounds of diverse structures by the multidrug efflux pump AcrB of[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(15): 6559-6565.

[11] 江歡, 舒正玉, 吳繼光, 等. 耐有機(jī)溶劑極端微生物的耐受機(jī)制及應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36(11): 1744-1749.Jiang H, Shu Z Y, Wu J G ,. Mechanisms for solvent tolerance and application of extremophile with organic solvent tolerance[J]. Microbiology China, 2009, 36(11): 1744-1749.

[12] Shimizu K, Hayashi S, Kako T,. Discovery of glpC, an organic solvent tolerance-related gene in, using gene expression profiles from DNA microarrays[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(2): 1093-1096.

[13] Heipieper H J, Neumann G, Cornelissen S,. Solvent-tolerant bacteria for biotransformations in two-phase fermentation systems[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(5): 961-973.

[14] Oh H Y, Lee J O, Kim O B. Increase of organic solvent tolerance ofby the deletion of two regulator genes, fadR and marR[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(6): 1619-1627.

[15] Heipieper H J, Meinhardt F, Segura A. The-isomerase of unsaturated fatty acids inand: biochemistry, molecular biology and physiological function of a unique stress adaptive mechanism[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 229(1): 1-7.

[16] 唐嘯宇, 孫洪林, 何冰芳. 耐有機(jī)溶劑微生物及酶類在生物催化中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2009, 21(12): 2726-2733.Tang X Y, SUn H L, He B F. Organic solvent tolerant bacteria and enzymes for application in biocatalysis[J]. Progress in Chemistry, 2009, 21(12): 2726-2733.

[17] Liu G, Hu S, Li L,. Purification and characterization of a lipase with high thermostability and polar organic solvent-tolerance fromAN0512[J]. Lipids, 2015, 50(11): 1155-1163.

[18] Van Holle A, Machado M D, Soares E V. Flocculation in ale brewing strains of: re-evaluation of the role of cell surface charge and hydrophobicity[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(3): 1221-1229.

[19] Sedlá?ková P, ?e?ovsky M, Horsáková I,. Cell surface characteristic of Asaia bogorensis-spoilage microorganism of bottled water[J]. Czech Journal of Food Sciences, 2011, 29(4): 457-461.

[20] Barrento S, Marques A, Teixeira B,. Chemical composition, cholesterol, fatty acid and amino acid in two populations of brown crab: ecological and human health implications[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2010, 23(7): 716-725.

[21] Laane C, Boeren S, Vos K,. Rules for optimization of biocatalysis in organic solvents[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1987, 30(1): 81-87.

[22] Mander P, Yoo H Y, Kim S W,. Transesterification of waste cooking oil by an organic solvent-tolerant alkaline lipase fromsp. CS273[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(3): 1377-1389.

[23] Rajagopal A N. Growth of Gram-negative bacteria in the presence of organic solvents[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1996, 19(8): 606-613.

[24] Zhang H F, Chong H Q, Ching C B,. Engineering global transcription factor cyclic AMP receptor protein offor improved 1-butanol tolerance[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(4): 1107-1117.

[25] Sardessai Y, Bhosle S. Tolerance of bacteria to organic solvents[J]. Research in Microbiology, 2002, 153(5): 263-268.

[26] 王鑫昕, 王少華, 李維, 等. 細(xì)菌的有機(jī)溶劑耐受機(jī)制[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(5): 641-649.Wang X X, Wang S H, Li W,. Tolerant mechanisms of bacteria to organic solvents[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2009, 25(5): 641-649.

[27] Isar J, Rangaswamy V. Improved-butanol production by solvent tolerant[J]. Biomass and Bioenergy, 2012, 37: 9-15.

[28] Heipieper H J, Meulenbeld G, van Oirschot Q,. Effect of environmental factors on theratio of unsaturated fatty acids inS12[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(8): 2773-2777.

[29] Cario A, Grossi V, Schaeffer P,. Membrane homeoviscous adaptation in the piezo-hyperthermophilic archaeon[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 1-12.

[30] Oger P M, Cario A. Adaptation of the membrane in Archaea[J]. Biophysical Chemistry, 2013, 183: 42-56.

Tolerance mechanism ofC2J6 to cyclohexanone

SU Xuelin1, ZHANG Zihan2, LIU Ya1

(1College of Food Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang, China;2Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute, Urumqi 830011, Xinjiang, China)

The mycelium growth and enzyme activity ofC2J6 in organic solvent are related to cell tolerance in the solvent. In order to reveal the regulation and mechanism of organic solvent tolerance, fifteen kinds of organic solvents were used to investigate the organic solvent tolerance ofC2J6. Then the tolerance mechanism for cyclohexanone, which is a less hydrophobic solvent, was studied in the cellular level. The results indicate thatC2J6 can grow in a variety of organic solvents for enzyme production. Organic solvents whose lgare between-0.24 and 3.0 will inhibit the cell growth and enzyme production to different degrees, whereas organic solvents whose lgare greater than 3.0 will promote the growth and production. Under the stress of cyclohexanone, the cell membrane is damaged. The intracellular organelles shrunk. The hydrophobicity of cell surface decreased. Extracellular nucleotide concentration increased. The content of unsaturated fatty acid decreased while the content of saturated fatty acid increased. These phenomena illustrate that cellular tolerance to cyclohexanone is influenced in many aspects, and there are variety of tolerance mechanisms working together which help to reduce the toxicity of cyclohexanone on the cells, so as to improve the tolerance of the microbes.

; lipase; organic solvent; cyclohexanone; cell tolerent mechanism

10.11949/j.issn.0438-1157.20170277

Q 93

A

0438—1157（2017）08—3218—07

劉婭，張梓涵。第一作者：蘇雪林（1989—），女，碩士研究生。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460031）。

2017-03-22收到初稿，2017-05-05收到修改稿。

2017-03-22.

Prof. LIU Ya, L68274609@163.com; ZHANG Zihan, musiq0510@sina.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (31460031).