何穎，張暉,*，甄士琪，張麗娟，曹馳程，章奇

1. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 2100092. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心食品安全與評(píng)價(jià)所，南京 210009

鄰苯二甲酸酯類(lèi)雌激素活性聯(lián)合作用模型分析

何穎1，張暉1,*，甄士琪2，張麗娟1，曹馳程1，章奇1

1. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 2100092. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心食品安全與評(píng)價(jià)所，南京 210009

環(huán)境雌激素對(duì)生命健康影響受到廣泛關(guān)注，現(xiàn)行污染物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)制訂和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)只針對(duì)單一化合物而非混合物效應(yīng)，不足以保護(hù)生命安全與人類(lèi)健康。為探討環(huán)境雌激素的混合物效應(yīng)，選擇對(duì)雌激素敏感的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)雌二醇(E2)、鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物(DBP和DEHP)的單一及其聯(lián)合雌激素活性；基于單一化合物的濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)，運(yùn)用濃度相加(CA)和獨(dú)立作用(IA)模型對(duì)混合物的毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將模型預(yù)測(cè)結(jié)果與混合物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，E2、DBP、DEHP對(duì)MCF-7細(xì)胞的單一作用數(shù)據(jù)可通過(guò)Weibull方程擬合，由擬合方程得到的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)及95%置信區(qū)間分別為3.450×10-6(2.373×10-6～1.675×10-5)、5.138(1.489～1.082×10)、1.186(4.478×10-1～2.24) μmol·L-1；3種化合物的混合物數(shù)據(jù)亦可通過(guò)Weibull、Logistic和ExpGro1方程進(jìn)行有效擬合，混合物效應(yīng)與化合物單獨(dú)作用產(chǎn)生的效應(yīng)具有顯著性差異；3種化合物表現(xiàn)非相似聯(lián)合作用，利用獨(dú)立作用(IA)模型預(yù)測(cè)混合物效應(yīng)較為可靠，外源性環(huán)境雌激素與內(nèi)源性雌激素聯(lián)合作用產(chǎn)生的混合效應(yīng)顯著。環(huán)境雌激素混合物毒性可以通過(guò)相加作用模型預(yù)測(cè)，為環(huán)境復(fù)合污染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

鄰苯二甲酸酯類(lèi)；MCF-7細(xì)胞；雌激素活性；聯(lián)合作用

Received22 April 2017accepted31 May 2017

Abstract: Estrogens in the environment have received extensive concerns due to their potential risks to human health. The present environmental standards and risk assessment procedures have limitation in the protection of human health and safety, because they are on the basis of the single effects of chemical compounds, rather than the combined effects. To investigate the combined effects of estrogens, the single and joint toxicities of three estrogens, including estradiol (E2) and phthalic acid ester compounds (DBP and DEHP), were investigated using the estrogen-sensitive MCF-7 human breast cancer cells proliferation assay. The individual concentration-response curves of the three estrogens were applied to predict the joint toxicity of their mixtures according to the concentration addition (CA) and the independent action (IA) models. The predicted concentration-response curves were further compared with the experimental data. The results showed that the single effects of E2, DBP, and DEHP were well fitted by Weibull equation, and their EC50(95% confidence interval) values were 3.450×10-6(2.373×10-6-1.675×10-5) μmol·L-1, 5.138 (1.489-10.820) μmol·L-1, and 1.186 (0.448-2.240) μmol·L-1, respectively. The effect from the mixtures of the three estrogens were well described by Weibull, Logistic, and ExpGro1 equations, while significant differences were observed between the single effects of the three estrogens and the combined effects of their mixtures. The three compounds showed dissimilar joint actions, and the IA model was more appropriate to predict the combined effects compared to the CA model. The combined effects of exogenous environmental estrogen and endogenous estrogen were significant. Overall, the toxicity of estrogens mixtures can be predicted by the additive model, providing the basic data for the risk assessment and management of combined pollution in the environment.

Keywords: phthalates; MCF-7 cells; estrogenic activity; combination effects

鄰苯二甲酸酯類(lèi)(phthalic acid esters, PAEs)化合物是一種增塑劑，主要包括：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)等，被廣泛應(yīng)用于塑料容器、食品包裝和個(gè)人護(hù)理用品等數(shù)百種產(chǎn)品中[1-2]。研究報(bào)道，增塑劑為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，與生殖障礙、出生缺陷、發(fā)育異常和代謝紊亂有關(guān)[3]?，F(xiàn)實(shí)生活中，機(jī)體總是同時(shí)或相繼暴露于多種環(huán)境污染物，特別是環(huán)境雌激素的濃度-反應(yīng)關(guān)系非線(xiàn)性，往往呈現(xiàn)低劑量效應(yīng)，彼此間表現(xiàn)各種聯(lián)合作用[4]。現(xiàn)行只對(duì)單一化合物而非混合物效應(yīng)進(jìn)行的評(píng)價(jià)，可能不足以保護(hù)生物安全和人類(lèi)健康，需要研究混合物效應(yīng)評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)方法[5-7]。

化合物相互作用分為無(wú)交互作用和有交互作用2種情況，無(wú)交互作用就是我們通常定義的“相加作用”類(lèi)型，相加作用是聯(lián)合作用定量分析的前提和基礎(chǔ)，有Loewe相似作用和Bliss獨(dú)立作用[8-10]，前者表示聯(lián)用化合物作用機(jī)理相似，有對(duì)數(shù)劑量-概率單位平行，聯(lián)用效應(yīng)相當(dāng)于同一物質(zhì)的幾個(gè)不同劑量合用，即濃度相加(concentration addition, CA)；而后者指聯(lián)用化合物作用機(jī)理不同，即獨(dú)立作用或反應(yīng)相加(independent action or response addition, IA)。在藥理學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上可推導(dǎo)出二類(lèi)數(shù)學(xué)模型：濃度相加模型(concentration addition, CA)和反應(yīng)相加模型(independent action or response addition, IA)。濃度相加適用于相似聯(lián)合作用，從“毒性單位”的概念出發(fā)；反應(yīng)相加模型適用于獨(dú)立聯(lián)合作用，根據(jù)概率論中“獨(dú)立事件的概率相加公式”推導(dǎo)而來(lái)，適合于作用機(jī)理不同的幾種化合物的相加計(jì)算。實(shí)際情況下我們往往不能夠準(zhǔn)確判斷相加作用的類(lèi)型，所以，在評(píng)價(jià)時(shí)，需要同時(shí)應(yīng)用2類(lèi)模型綜合分析評(píng)價(jià)。如果混合物實(shí)際測(cè)得的效應(yīng)與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，則分別為模型所定義的相加作用類(lèi)型。

本文通過(guò)雌激素依賴(lài)型人乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)(E-screen assay)，對(duì)PAEs的聯(lián)合作用進(jìn)行研究，先建立單個(gè)化合物雌激素活性效應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，在對(duì)單個(gè)化合物濃度-反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行非線(xiàn)性回歸分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用2類(lèi)相加作用數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)PAEs混合物的生物效應(yīng)，并與實(shí)際測(cè)得的混合物效應(yīng)結(jié)果比較，進(jìn)而有助于判斷該類(lèi)化合物聯(lián)合作用類(lèi)型，同時(shí)測(cè)試了模型的預(yù)測(cè)效力和實(shí)用性，為化合物聯(lián)合作用的預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)和實(shí)用方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 測(cè)試化合物

3個(gè)受試化合物為：17β-雌二醇(17β-estradiol，E2，CAS:50-28-2)，純度≥98%，分子式C18H24O2，分子量272.38，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate，DEHP，CAS:117-81-7)分子式C24H38O4，分子量390.56，標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于美國(guó)AccuStandard公司；鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP，CAS:84-72-2)，分子式C16H22O4，分子量278.34，標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于美國(guó)AccuStandard公司。

1.1.2 試劑與儀器

用于細(xì)胞培養(yǎng)的DMEM高糖培養(yǎng)基、無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

儀器包括超凈工作臺(tái)(BSG-1500ⅡA2-X，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(Series 8000WJ, Thermo Scientific, USA)，倒置顯微鏡(IX2-ILL30, Olympus, Japan)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Epoch, BioTek instruments, Tnc., USA)等。

1.2 MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(E-screen assay)

經(jīng)雌激素受體ERα基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本實(shí)驗(yàn)選用的MCF-7細(xì)胞為ERα陽(yáng)性的雌激素依賴(lài)型細(xì)胞，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感性和可靠性。

采用MTT作為顯色底物進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[11]，MTT全稱(chēng)3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，化學(xué)名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，又稱(chēng)噻唑藍(lán)，是一種接受氫離子的黃色染料。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：MCF-7細(xì)胞復(fù)蘇后用10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下正常培養(yǎng)至3代以上。實(shí)驗(yàn)前48 h將原培養(yǎng)基替換為含5% CDT-FBS的無(wú)酚紅高糖DMEM培養(yǎng)液。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔200 μL約6 000～7 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)液，加入200 μL無(wú)酚紅培養(yǎng)基配制的不同濃度梯度的化合物或混合物，每個(gè)濃度均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄去原有培養(yǎng)基，加入5 mg·mL-1MTT和無(wú)血清無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基混合液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h。1 mL注射器吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，充分溶解紫色結(jié)晶物。選擇490 nm波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的光密度(OD)值。

以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO為溶劑對(duì)照，濃度為1 nmol·L-1的E2作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果用校正相對(duì)增殖效應(yīng)(relativistic proliferation effect, RPE)表示，RPE=(實(shí)驗(yàn)組OD值-溶劑對(duì)照組OD值)/(陽(yáng)性對(duì)照組OD值-溶劑對(duì)照組OD值)×100%。

1.3 混合物效應(yīng)預(yù)測(cè)模型

根據(jù)單一化合物的數(shù)據(jù)擬合濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)，運(yùn)用濃度相加(CA)和獨(dú)立作用(IA)模型對(duì)混合物的聯(lián)合毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)[12-13]。

濃度相加(CA)模型用下式表示：

式中：pi為混合物中化合物i的濃度占總濃度的分?jǐn)?shù)；ECxmix(單位：μmol·L-1)為引起x效應(yīng)的混合物預(yù)測(cè)總濃度；其中ECxi(單位：μmol·L-1)可通過(guò)單個(gè)化合物劑量-反應(yīng)回歸方程的反函數(shù)求得，即：

獨(dú)立作用(IA)模型如下：

式中：Eci為混合物中各化學(xué)物在ci濃度時(shí)所產(chǎn)生的效應(yīng)，可通過(guò)劑量-反應(yīng)關(guān)系方程或內(nèi)插法計(jì)算得到，即：

式中：Fi為單個(gè)化學(xué)物i的劑量-效應(yīng)函數(shù)，對(duì)于給定混合物效應(yīng)x可通過(guò)迭代算法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件和Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和計(jì)算[14-15]。濃度-反應(yīng)關(guān)系采用origin7.5軟件進(jìn)行非線(xiàn)性曲線(xiàn)擬合，選擇擬合相關(guān)決定系數(shù)R2值最大的方程為最優(yōu)擬合方程，同時(shí)繪制濃度與細(xì)胞相對(duì)增殖效應(yīng)的關(guān)系曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖效應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)單個(gè)化合物

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了3個(gè)化合物作用濃度范圍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算得出各化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞的相對(duì)增殖效應(yīng)(RPE)，表明3個(gè)化合物均能促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖，在設(shè)定濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系。由圖1可知，17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)濃度在0.01 pmol·L-1～1 nmol·L-1范圍內(nèi)，細(xì)胞相對(duì)增殖效應(yīng)逐漸增大；濃度在1 nmol·L-1時(shí)達(dá)最大，表明E2在此濃度下雌激素活性最強(qiáng)。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)的濃度-反應(yīng)關(guān)系亦是正相關(guān)關(guān)系，隨著濃度的增加，增殖效應(yīng)逐漸增大，DBP在100 μmol·L-1，DEHP在10 μmol·L-1，細(xì)胞增殖效應(yīng)最大。

運(yùn)用非線(xiàn)性回歸方法對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的濃度-反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性曲線(xiàn)擬合，并將多個(gè)函數(shù)擬合的曲線(xiàn)進(jìn)行比較，獲取擬合度最優(yōu)的濃度-反應(yīng)方程，見(jiàn)表1。對(duì)比多次擬合結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，E2、DEHP、DBP均是Weibull函數(shù)擬合效果最優(yōu)，說(shuō)明Weibull函數(shù)能夠有效表述這3種化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖影響的濃度-反應(yīng)關(guān)系。根據(jù)曲線(xiàn)方程及其反函數(shù)方程，計(jì)算得出各個(gè)化合物單一作用于MCF-7細(xì)胞的效應(yīng)濃度(EC50)值。具體的擬合結(jié)果(各化合物擬合方程及其參數(shù)、決定系數(shù)R2值，以及EC50及其95%置信區(qū)間(95%CI)見(jiàn)表2，擬合的曲線(xiàn)如圖1，將3種化合物的濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)整合在同一坐標(biāo)系中，可清楚地展示各化合物作用的濃度范圍。結(jié)合表2和圖1中各曲線(xiàn)的位置分布可知，E2的濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)位于最左側(cè)，相對(duì)增殖效應(yīng)最大，EC50為3.450 pmol·L-1；DEHP(EC50=1.186 μmol·L-1)和DBP(EC50=5.138 μmol·L-1)的促增殖能力比E2低105-106倍。這3種化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖效應(yīng)為E2 >DEHP>DBP。

(2)混合物

E2、DEHP和DBP等效應(yīng)固定濃度比混合，即初始混合物按照每種化合物的等效應(yīng)濃度(如EC50)比例進(jìn)行混合。構(gòu)成3種二元混合物E2/DEHP、E2/DBP、DEHP/DBP和1個(gè)三元混合物E2/DEHP/DBP，將4個(gè)混合物當(dāng)作4個(gè)新的化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將初始混合物依次稀釋成初始濃度的100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%倍，混合物中每種化合物所占的組成比例始終保持一致。

將混合物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行非線(xiàn)性回歸分析，濃度-反應(yīng)關(guān)系擬合模型、參數(shù)及對(duì)應(yīng)的R2值見(jiàn)表2，擬合曲線(xiàn)如圖2。四參數(shù)的Logistic模型對(duì)DEHP/DBP的濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)擬合效果最好，決定系數(shù)R2=0.995；E2/DEHP和E2/DBP擬合度最優(yōu)的模型分別為三參數(shù)的ExpGro1方程，R2分別為0.977和0.949；E2/DEHP/DBP擬合度最優(yōu)的模型為二參數(shù)Weibull方程，R2為0.996，方程參數(shù)及EC50值見(jiàn)表2。從圖2中各條曲線(xiàn)的分布不難看出，等效應(yīng)固定濃度比二元混合物的擬合曲線(xiàn)和95%置信區(qū)間均介于單個(gè)化合物之間，混合物的EC50也都介于單個(gè)化合物之間；混合物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合曲線(xiàn)形狀不同于單獨(dú)作用的擬合曲線(xiàn)，化合物單獨(dú)作用的效應(yīng)和產(chǎn)生的混合物效應(yīng)顯著不同；外源化合物單獨(dú)作用下在較低濃度時(shí)產(chǎn)生的效應(yīng)較弱，但聯(lián)合作用下會(huì)產(chǎn)生顯著的混合物效應(yīng)。

圖1 單一化合物濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)Fig. 1 Concentration-response fitting curves for each of the individual chemical

表1 擬合度最優(yōu)模型方程及其反函數(shù)方程Table 1 The best-fit regression models and its inverse function

圖2 各種混合物聯(lián)合作用濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)Fig. 2 Concentration-response fitting curves for each of the mixtures

表2 單一化合物和混合物濃度-反應(yīng)關(guān)系曲線(xiàn)方程參數(shù)和EC50(95%CI)Table 2 The corresponding best-fit models with estimated parameters, and the estimated EC50 values and the 95% confidence intervals

圖3 各種混合物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相加作用模型預(yù)測(cè)結(jié)果比較Fig. 3 Comparison between the observed and addition models predicted mixture effects

2.2 混合物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相加作用模型預(yù)測(cè)結(jié)果的比較

根據(jù)17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)單獨(dú)作用的濃度-反應(yīng)回歸方程，應(yīng)用濃度相加(CA)和獨(dú)立作用(IA)模型對(duì)這3種化合物的等毒性固定濃度比例混合物效應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以單個(gè)化合物最優(yōu)化非線(xiàn)性回歸方程為基礎(chǔ)，分別計(jì)算從1%到99%的35個(gè)效應(yīng)點(diǎn)在滿(mǎn)足CA和IA模型條件下的混合物效應(yīng)濃度。將混合物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的曲線(xiàn)及95%置信限，與CA和IA模型預(yù)測(cè)曲線(xiàn)畫(huà)在一張圖中進(jìn)行比較，如圖3，可知：4個(gè)混合物應(yīng)用IA模型預(yù)測(cè)出的混合物效應(yīng)基本上能夠落在混合物實(shí)測(cè)效應(yīng)的95%置信區(qū)間內(nèi)，CA模型得出的效應(yīng)濃度值偏高，提示此3種化合物聯(lián)合作用應(yīng)用IA模型預(yù)測(cè)，CA模型會(huì)低估混合物效應(yīng)，證明了3種化合物在本實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)獨(dú)立聯(lián)合作用。3種化合物在較低暴露濃度(1/20 EC50)下，單獨(dú)存在產(chǎn)生的效應(yīng)以及聯(lián)合存在時(shí)產(chǎn)生的混合物效應(yīng)結(jié)果如圖4，表明化合物單獨(dú)存在時(shí)產(chǎn)生的效應(yīng)可能不顯著，但每個(gè)化合物根據(jù)其作用大小都會(huì)對(duì)總效應(yīng)產(chǎn)生貢獻(xiàn)，甚至在低于有效作用濃度下產(chǎn)生顯著的混合物效應(yīng)。

3 討論(Discussion)

本研究采用體外人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(E-screen assay)，檢測(cè)環(huán)境化合物的雌激素活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E2單獨(dú)作用對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖影響具有濃度-反應(yīng)關(guān)系，E2在1 nmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖效應(yīng)最大，但是隨著濃度的增大，在高濃度時(shí)，E2抑制細(xì)胞增殖；外源性化合物DEHP和DBP的增殖效應(yīng)與內(nèi)源性雌激素E2的相似，在設(shè)定濃度范圍內(nèi)其濃度-反應(yīng)曲線(xiàn)均呈“S”型，但是產(chǎn)生的雌激素活性相對(duì)較弱，DEHP和DBP的半效應(yīng)濃度EC50分別為1.186 μmol·L-1、5.138 μmol·L-1。至今為止大部分的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為DBP無(wú)雌激素活性，DEHP可以改變子宮濕重，但是結(jié)果不穩(wěn)定，可重復(fù)性差，猜測(cè)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)的不一致性的原因可能是DBP和DEHP在體內(nèi)被代謝分解，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)的是代謝產(chǎn)物的雌激素活性[16-17]；體外實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)的是DBP和DEHP原型的活性。雖然在本研究中DBP和DEHP對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響均表現(xiàn)出較弱的雌激素活性，但是鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物對(duì)生物有機(jī)體的生殖內(nèi)分泌毒性和胚胎發(fā)育毒性是不容忽視的[1-3,18]。

環(huán)境雌激素多以混合狀態(tài)存在，且無(wú)論在環(huán)境中還是在生物體內(nèi)均是與天然雌激素共同發(fā)揮作用，并且內(nèi)源性雌激素和外源性環(huán)境雌激素污染物聯(lián)合作用，產(chǎn)生的混合效應(yīng)大于單獨(dú)作用的結(jié)果[19]。因此，對(duì)E2與其他化合物共存時(shí)的雌激素活性進(jìn)行研究，符合機(jī)體受環(huán)境雌激素干擾的實(shí)際情況[20]。多種化合物混合效應(yīng)相較于單獨(dú)作用產(chǎn)生的效應(yīng)更復(fù)雜，這也正是研究環(huán)境雌激素混合物效應(yīng)的意義所在。

圖4 3種化合物低劑量(1/20 EC50)的混合物效應(yīng)Fig. 4 Mixture effects at low-effect concentrations (one-twentieth of EC50) of three chemicals

本文在化合物單獨(dú)作用的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探討雌二醇和鄰苯二甲酸酯化合物的聯(lián)合雌激素活性，主要結(jié)論如下：E2、DEHP和DBP濃度-反應(yīng)關(guān)系曲線(xiàn)非線(xiàn)性，均為Weibull模型擬合度最優(yōu)；內(nèi)源性雌激素E2對(duì)MCF-7細(xì)胞的促增殖能力最強(qiáng)，外源性化合物的雌激素活性相對(duì)較弱；化合物在較低濃度下可能產(chǎn)生顯著的混合物效應(yīng)，外源性環(huán)境雌激素與內(nèi)源性雌激素聯(lián)合作用產(chǎn)生的混合效應(yīng)顯著；3種化合物表現(xiàn)非相似聯(lián)合作用，混合物效應(yīng)利用獨(dú)立作用(IA)模型預(yù)測(cè)較為可靠。

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◆

ModelAssessingfortheCombinationEffectsofEstrogenicActivityofPhthalates

He Ying1, Zhang Hui1,*, Zhen Shiqi2, Zhang Lijuan1, Cao Chicheng1, Zhang Qi1

1. Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China2. Institute of Food Safety and Evaluation, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170422001

2017-04-22錄用日期2017-05-31

1673-5897(2017)3-739-08

X171.5

A

張暉(1968-)，女，副教授,碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境醫(yī)學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(2242017K40041)；東南大學(xué)研討通選課程項(xiàng)目(1125000131；1125001508)

何穎(1993-)，女，碩士,研究方向?yàn)榄h(huán)境衛(wèi)生學(xué)，E-mail: molahe@163.com;

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: 13851553232@163.com

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