劉 曉，胡 崗，陳一凡，劉 波，徐 敏，廖俊喆

(四川省成都市第五人民醫(yī)院呼吸科 611130)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA SUMO1P3在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值*

劉 曉，胡 崗△，陳一凡，劉 波，徐 敏，廖俊喆

(四川省成都市第五人民醫(yī)院呼吸科 611130)

目的探討非小細(xì)胞肺癌lncRNA SUMO1P3的表達(dá)與臨床意義。方法應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)126例非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織中SUMO1P3的表達(dá)水平及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果與癌旁組織、健康組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織中SUMO1P3表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。其表達(dá)水平與TNM分期(χ2=12.49,P<0.01)及腫瘤體積(χ2=10.20,P<0.01)顯著相關(guān)。ROC曲線(xiàn)下面積為0.728 4[95%CI(0.664,0.761)；P=0.001 2]。Kaplan-Meier生存分析顯示SUMO1P3高表達(dá)組患者的總生存時(shí)間(OS)和疾病無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)顯著縮短(P=0.000 1,P=0.003 1)。Cox回歸分析顯示SUMO1P3表達(dá)水平、組織學(xué)分級(jí)和TNM分期是OS、PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。結(jié)論SUMO1P3的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可能是非小細(xì)胞肺癌患者診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。

肺腫瘤；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；SUMO1P3；預(yù)后

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的首要原因，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的80%～85%[1]。NSCLC 5年總體生存率僅約11%～15%[2]，這與NSCLC高侵襲和高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)，并且缺少有效的分子靶點(diǎn)及分子標(biāo)志物[3]。長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)是近幾年由高通量轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼RNA，其參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。小泛素樣修飾物(SUMO)1假基因3(SUMO1P3)是lncRNAs家族一員，近年來(lái)已證實(shí)其與膀胱癌、胃癌的不良預(yù)后、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。但是，lncRNA SUMO1P3與NSCLC之間的相關(guān)性尚不明確。本研究應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)126例NSCLC患者腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中SUMO1P3的表達(dá)水平，通過(guò)分析SUMO1P3表達(dá)與NSCLC的臨床病理指標(biāo)以及預(yù)后之間的相關(guān)性，探討SUMO1P3在NSCLC發(fā)生和發(fā)展中的作用，為尋找NSCLC潛在的預(yù)后判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 126例新鮮癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織取自2010年6月至2012年5月在四川省成都市第五人民醫(yī)院確診的NSCLC患者。標(biāo)本通過(guò)經(jīng)支氣管鏡黏膜活檢、經(jīng)皮肺穿刺活檢、經(jīng)支氣管肺活檢以及手術(shù)切除獲得，所有患者在獲取標(biāo)本前均未接受腫瘤的相關(guān)治療。標(biāo)本采集后立即存放在無(wú)RNA酶的凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＿x取57例未患有NSCLC的志愿者作為健康對(duì)照。采用2010年WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)；根據(jù)2009年IASLC肺癌分期系統(tǒng)對(duì)患者進(jìn)行分期；對(duì)所有患者進(jìn)行嚴(yán)密隨訪，前兩年3個(gè)月隨訪1次，之后6個(gè)月隨訪1次。計(jì)算總生存期(OS)和疾病無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)，OS為確診到死亡的間隔時(shí)間，PFS為確診到首次發(fā)現(xiàn)局部、區(qū)域性或遠(yuǎn)處腫瘤進(jìn)展的間隔時(shí)間。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

圖1 SUMO1P3基因在NSCLC組織中的表達(dá)和相關(guān)的臨床參數(shù)

1.2RNA抽提與qRT-PCR 應(yīng)用Trizol試劑(Invitrogen,中國(guó)上海)從組織樣本中提取總RNA。用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific)在260 nm處測(cè)定總RNA的濃度和純度，電泳檢測(cè)顯示，提純的RNA質(zhì)量良好。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,中國(guó)大連)將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。采用SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR(TaKaRa,中國(guó)大連)，并應(yīng)用ABI PRISM 7000 熒光定量PCR系統(tǒng)(Agilent Technologies)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。引物由Biosune(中國(guó)上海)合成，SUMO1P3引物序列：上游5′- ACT GGG AAT GGA GGA AGA-3′,下游5′-TGA GAA AGG ATT GAG GGA AAA G -3′;GAPDH引物序列：上游5′-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TTC-3′,下游5′-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C-3′。取3次測(cè)量的平均值用2-ΔΔCt法計(jì)算SUMO1P3的相對(duì)量。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC患者腫瘤組織中SUMO1P3的表達(dá) SUMO1P3在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)與癌旁組織(P<0.01)和正常組織(P<0.01)相比明顯上調(diào)。這表明SUMO1P3的表達(dá)差異可能同NSCLC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)(圖1A)?；颊逿NM分期越高，腫瘤體積越大，SUMO1P3表達(dá)水平越高(圖1B、C)。

2.2SUMO1P3的表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 SUMO1P3水平同患者TNM分期(0.960 3±0.153 3vs. 1.757 0±0.270 5,P=0.001 5)和腫瘤體積存在正相關(guān)性(0.971 2±0.143 3vs. 1.937 1±0.302 1,P=0.001 0)。腫瘤大于3 cm，或TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期的患者，其SUMO1P3水平較高，而腫瘤小于3 cm，或TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期的患者，其SUMO1P3水平較低。同時(shí)，根據(jù)癌組織中SUMO1P3表達(dá)水平的中位數(shù)，筆者將樣本分成SUMO1P3高表達(dá)組(高于中位數(shù)，n=63)和SUMO1P3低表達(dá)組(低于中位數(shù)，n=63)。利用χ2檢驗(yàn)評(píng)估兩組間臨床病理因素。SUMO1P3表達(dá)水平同腫瘤體積 (χ2=10.20,P<0.01)和TNM分期(χ2=12.49,P<0.01)，存在相關(guān)性。而SUMO1P3表達(dá)水平同其他因素之間不存在相關(guān)性(P>0.05)，例如性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)(低、中、高)、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、吸煙史，見(jiàn)表1。

2.3SUMO1P3的診斷價(jià)值 應(yīng)用ROC曲線(xiàn)和ROC曲線(xiàn)下面積對(duì)比NSCLC腫瘤組織和癌旁組織SUMO1P3的表達(dá)水平。兩組ROC曲線(xiàn)明顯分離，SUMO1P3的AUC為0.728 4[95%CI(0.664，0.761)；P=0.001 2]，說(shuō)明SUMO1P3可以作為NSCLC的一種潛在的分子標(biāo)志物，見(jiàn)圖2。

表1 SUMO1P3的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.4SUMO1P3高表達(dá)與NSCLC患者不良預(yù)后的相關(guān)性 為明確SUMO1P3表達(dá)水平同患者預(yù)后之間的關(guān)系，筆者首先應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析和log-rank秩檢驗(yàn)評(píng)估了SUMO1P3表達(dá)水平同OS和PFS之間的相關(guān)性。如圖3A和3B所示，SUMO1P3低表達(dá)組5年OS為20.6%，而高表達(dá)組只有11.5%；高表達(dá)組的中位生存時(shí)間為23個(gè)月，而低表達(dá)組為48個(gè)月；高表達(dá)組中位PFS為19個(gè)月，低表達(dá)組為36個(gè)月。值得注意的是，SUMO1P3高表達(dá)組的OS (P=0.000 1)和PFS(P=0.003 1)都較差。這些都提示NSCLC中SUMO1P3表達(dá)上調(diào)與患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。

圖2 SUMO1P3表達(dá)的ROC曲線(xiàn)

2.5SUMO1P3的高表達(dá)是NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo) 為了進(jìn)一步明確SUMO1P3在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值，筆者對(duì)126例NSCLC患者的PFS和OS分別進(jìn)行了單變量和多變量生存分析(COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型)。單變量分析明確了3個(gè)預(yù)后指標(biāo)(組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、SUMO1P3表達(dá))是影響患者OS和PFS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的危險(xiǎn)因素。其他臨床病理因素，例如，性別、腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等因素都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。多因素分析進(jìn)一步揭示影響NSCLC患者OS、PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)包括SUMO1P3表達(dá)情況、組織學(xué)分級(jí)和TNM分期，見(jiàn)表2。

圖3 SUMO1P3的表達(dá)與NSCLC患者OS與PFS的關(guān)系

表2 單因素及多因素分析NSCLC患者臨床病理特征與PFS和OS的關(guān)系

3 討 論

近幾年發(fā)現(xiàn)了許多l(xiāng)ncRNAs，大量研究探討其在廣泛的生物學(xué)過(guò)程中的作用，從轉(zhuǎn)錄到mRNA剪接、RNA衰減及翻譯，基因生命周期的每一步幾乎都可受到這些分子的影響[8-9]。此外，近期研究開(kāi)始鑒定癌癥相關(guān)lncRNAs，并探討它們?cè)诎┌Y中的臨床意義和生物學(xué)功能。例如，HOTAIR是一種lncRNA，在多種腫瘤中發(fā)生過(guò)表達(dá)，并與癌癥轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[10-12]。lncRNA CCAT2過(guò)表達(dá)與結(jié)直腸癌(CRC)和NSCLC患者的不良預(yù)后具有相關(guān)性，可用作患者生存率的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[13-14]。MALAT1表達(dá)上調(diào)是NSCLC生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[15]。與之相反，其他一些lncRNAs如MEG3、GAS5和lncRNA H19則在多種人類(lèi)癌癥中具有腫瘤抑制作用[16-18]。這些發(fā)現(xiàn)表明，像蛋白質(zhì)編碼基因和miRNAs一樣，lncRNAs可作為診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物。但是，lncRNAs在NSCLC中的總體病理生理作用目前尚不明確。SUMO1P3是SUMO假基因家族的成員之一，是一種新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA[19]。SUMO1P3在胃癌和膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，是胃癌和膀胱癌潛在的預(yù)后判斷和治療靶點(diǎn)[6-7]。在胃癌中，SUMO1P3與腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)具有相關(guān)性[7]。此外，SUMO1P3 siRNA轉(zhuǎn)染的膀胱細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制、凋亡增多以及遷移抑制[6]。但是，SUMO1P3在NSCLC中的表達(dá)和臨床意義目前尚不明確。

本研究結(jié)果表明：與癌旁組織相比，NSCLC腫瘤組織SUMO1P3的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，另外通過(guò)進(jìn)一步分析NSCLC患者腫瘤組織中SUMO1P3表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SUMO1P3高表達(dá)與TNM分期及腫瘤體積有關(guān)(P<0.01)，而與其他臨床病理特征如患者性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)(低、中、高)、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、吸煙史無(wú)關(guān)。ROC曲線(xiàn)和ROC曲線(xiàn)下面積顯示ROC曲線(xiàn)顯示明顯分離，SUMO1P3的AUC為0.728 4，說(shuō)明SUMO1P3可以作為NSCLC的一種潛在的生物標(biāo)志物。Kaplan-Meier生存分析和log-rank秩檢驗(yàn)結(jié)果顯示SUMO1P3高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，SUMO1P3高表達(dá)組患者的OS和PFS顯著縮短。單變量和多變量生存分析結(jié)果顯示組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、SUMO1P3表達(dá)是影響患者PFS和OS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的危險(xiǎn)因素和獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究?jī)H為單中心研究，納入樣本量較少，有待今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究將樣本中位數(shù)(n=63)的SUMO1P3表達(dá)水平作為SUMO1P3高表達(dá)和低表達(dá)的臨界值，這需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，確定一個(gè)更為敏感度和特異性的SUMO1P3值，進(jìn)而進(jìn)入臨床推廣應(yīng)用。在隨后的研究中，筆者將擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步探討，并嘗試鑒定lncRNA SUMO1P3的生物學(xué)功能，闡明其在NSCLC腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制。

綜上所述，與配對(duì)癌旁組織和健康組織相比，NSCLC常發(fā)生SUMO1P3表達(dá)上調(diào)，提示SUMO1P3可能具有關(guān)鍵的致癌作用，有望用作NSCLC患者低生存率的預(yù)測(cè)指標(biāo)以及負(fù)性預(yù)后因子。這些新發(fā)現(xiàn)表明，SUMO1P3可能成為NSCLC潛在的預(yù)后和治療靶點(diǎn)。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[2]Chen Z,Fillmore CM,Hammerman PS,et al.Non-small-cell lung cancers:a heterogeneous set of diseases[J].Nat Rev Cancer,2014,14(8):535-546.

[3]Rosell R,Bivona TG,Karachaliou N.Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment[J].Lancet,2013,382(9893):720-731.

[4]Huarte M.The emerging role of incRNAs in cancer[J].Nat Med,2015,21(11):1253-1261.

[5]Rinn JL,Chang HY.Genome regulation by long noncoding RNAs[J].Annu Rev Biochem,2012,81(2):145-166.

[6]Zhan YH,Liu YC,Wang C,et al.Increased expression of SUMO1P3 predicts poor prognosis and promotes tumor growth and metastasis in bladder cancer[J].Oncotarget,2016,7(13):16038-16048.

[7]Mei D,Song H,Wang K,et al.Up-regulation of SUMO1 pseudogene 3 (SUMO1P3) in gastric cancer and its clinical association[J].Med Oncol,2013,30(4):709.

[8]Flynn A,Chang Y.Long noncoding RNAs in cell-fate programming and reprogramming[J].Cell Stem Cell,2014,14(6):752-761.

[9]Turner M,Galloway A,Vigorito E.Noncoding RNA and its associated proteins as regulatory elements of the immune system[J].Nat Immunol,2014,15(6):484-491.

[10]Gupta RA,Shah N,Wang KC,et al.Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J].Nature,2010,464(7291):1071-1076.

[11]Hajjari M,Salavaty A.HOTAIR:an oncogenic long non-coding RNA in different cancers[J].Cancer Biol Med,2015,12(1):1-9.

[12]Du M,Wang W,Jin H,et al.The association analysis of lncRNA HOTAIR genetic variants and gastric cancer risk in a Chinese population[J].Oncotarget,2015,6(31):31255-31262.

[13]Ling H,Spizzo R,Atlasi Y,et al.CCAT2,a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer[J].Genome Res,2013,23(9):1446-1461.

[14]He X,Tan X,Wang X,et al.C-Myc-activated long noncoding RNA CCAT1 promotes colon cancer cell proliferation and invasion[J].Tumour Biol,2014,35(12):12181-12188.

[15]Gutschner T,H?mmerle M,Eissmann M,et al.The noncoding RNA MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cells[J].Cancer Res,2013,73(3):1180-1189.

[16]Sun M,Jin FY,Xia R,et al.Decreased expression of long noncoding RNA GAS5 indicates a poor prognosis and promotes cell proliferation in gastric cancer[J].BMC Cancer,2014,14(3):319.

[17]Liang C,Fu M,Wong W,et al.The lncRNA H19 promotes epithelial to mesenchymal transition by functioning as miRNA sponges in colorectal cancer[J].Oncotarget,2015,6(26):22513-22525.

[18]Yin D,Liu J,Zhang E,et al.Decreased expression of long noncoding RNA MEG3 affects cell proliferation and predicts a poor prognosis in patients with colorectal cancer[J].Tumour Biol,2015,36(6):4851-4859.

[19]Wright MW,Bruford EA.Naming junk:human non-protein coding RNA (ncRNA) gene nomenclature[J].Hum Genomics,2011,5(2):90-98.

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.030

R734.2

B

1671-8348(2017)27-3839-04

2016-12-14

2017-04-29)

四川省醫(yī)學(xué)會(huì)青年創(chuàng)新項(xiàng)目(Q16008)。

劉曉(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的早期診斷與治療?！?/p>

，E-mail:hu13684038833@163.com。